付美麗，嚴(yán)銘銘，邵 帥，吳程彥，劉 暢，田 雙，尉忠賢，楊 洋（長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長春 130117）

RP-HPLC法測(cè)定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量Δ

付美麗＊，嚴(yán)銘銘#，邵 帥，吳程彥，劉 暢，田 雙，尉忠賢，楊 洋（長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長春 130117）

目的：建立測(cè)定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為GRACE Alltima TMC 18，流動(dòng)相為甲醇-水（15∶85，V/V，紅景天苷）、乙腈-水（23∶77，V/V，虎杖苷），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為275 nm（紅景天苷）、306 nm（虎杖苷），柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：紅景天苷和虎杖苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.99～10.89 μg（r＝0.999 8）、0.046～1.196 μg（r＝0.999 8）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.31%～99.44%（RSD＝1.20%，n＝6）、95.96%～99.73%（RSD＝1.42%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡單方便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于測(cè)定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量。

反相高效液相色譜法；新扶正除疫顆粒；紅景天苷；虎杖苷；含量測(cè)定

新扶正除疫顆粒原始劑型為湯劑，即扶正除疫湯，因其使用不便，本課題組對(duì)劑型進(jìn)行了改造，制備了新扶正除疫顆粒。該制劑由紅景天、虎杖、大青葉、貫眾等中藥材組成，具有扶正祛邪、清熱透毒之功效；方中以紅景天為君，解毒達(dá)邪，先證用藥；以虎杖、大青葉為臣，清熱解毒、截?cái)嗖?shì)，結(jié)合貫眾的佐使之力，從而達(dá)到整體調(diào)節(jié)、多靶治療的目的，有效地阻斷多個(gè)病理環(huán)節(jié)的惡性循環(huán)[1-4]。為了更好地控制新扶正除疫顆粒的質(zhì)量，本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]，采用反相高效液相色譜法（RPHPLC）測(cè)定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括紫外檢測(cè)器（美國Agilent公司）；AB265-S型、ALB-224型萬分之一分析天平均購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器（功率：250 W；頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

新扶正除疫顆粒（長春中醫(yī)藥大學(xué)自制，批號(hào)：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305，規(guī)格：10 g/袋）；紅景天苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201001，純度：99.8%）、虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)：111575-200502，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，無水乙醇、甲醇為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅景天苷的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：GRACE Alltima TMC 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（15∶85，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：275 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液。精密稱取紅景天苷對(duì)照品9.9 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制備每1 mL含紅景天苷1.98 mg的對(duì)照品貯備液。取上述貯備液適量，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制備每1 mL含紅景天苷0.48 mg的對(duì)照品溶液。②供試品溶液。取樣品適量，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷；再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[6]。③陰性對(duì)照溶液。按樣品的處方比例和制備工藝，制備不含紅景天苷的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液[7]。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以紅景天苷峰計(jì)≥2 000，保留時(shí)間為18.656 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

龍血樹(Dracaena cambodian)屬于百合科龍血樹屬，樹葉為線狀披針形，簇生于枝條頂端，樹形極具特點(diǎn)，可塑性強(qiáng)，可以根據(jù)人的意愿塑造出不同形狀，樹干古樸滄桑，同時(shí)還能在頂部萌發(fā)新枝，給人一種沉穩(wěn)而不失朝氣的感覺，且十分耐陰，可在室內(nèi)盆栽多年仍然綠意盎然，是園林綠化及家庭盆栽的名貴樹種，具有很好的觀賞價(jià)值。同時(shí)藥用價(jià)值極高，具有止血、生肌、行氣等功效。

圖1 紅景天苷高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of salidroside

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.1 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.099、0.198、0.396、0.594、0.792、0.990、1.089 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得紅景天苷的回歸方程為y＝308.3x－42.301（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，紅景天苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.99～10.89 μg。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140302）10μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，紅景天苷峰面積的RSD＝0.42%（n＝12），表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：20140304）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，紅景天苷峰面積的RSD＝1.43%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：20140303）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，紅景天苷的平均含量為0.41%，RSD＝0.86%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好[8-9]。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20140305）適量，精密加入一定質(zhì)量的紅景天苷對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 紅景天苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test of salidroside（n＝6）

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取5批樣品各適量，分別按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算紅景天苷的含量。結(jié)果，5批樣品（批號(hào)：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305）中紅景天苷的含量分別為6.675‰、5.354‰、4.893‰、3.464‰、4.183‰（n＝3）。

2.2 虎杖苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：GRACE Alltima TMC 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（23∶77，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：306 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液的制備 ①對(duì)照品溶液。精密稱取虎杖苷對(duì)照品9.2 mg，置于50 mL量瓶中，加稀乙醇（取乙醇529 mL，加水稀釋至1 000 mL，即得稀乙醇溶液）溶解并定容，制備每1 mL含0.184 mg的對(duì)照品貯備液。取上述貯備液適量，置于100 mL量瓶中，加稀乙醇定容，制備每1 mL含虎杖苷0.03 mg的對(duì)照品溶液（避光放置）。②供試品溶液。取樣品適量，研細(xì)，取約0.25 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷；再次稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得（避光放置）。③陰性對(duì)照溶液。按樣品的處方比例和制備工藝，制備不含虎杖苷的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以虎杖苷峰計(jì)≥3 000，保留時(shí)間為11.452 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖2 虎杖苷高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of polydatin

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液0.25、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加稀乙醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.004 6、0.009 2、0.027 6、0.046 0、0.064 4、0.082 8、0.101 2、0.119 6 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得虎杖苷的回歸方程為y＝308.3x－42.301（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，虎杖苷檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.046～1.196 μg。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140302）10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷峰面積的RSD＝1.21%（n＝12），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：20140304）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，虎杖苷峰面積的RSD＝0.70%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號(hào)：20140303）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，虎杖苷的平均含量為0.75%，RSD＝1.22%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（批號(hào)：20140305）適量，精密加入一定質(zhì)量的虎杖苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取5批樣品各適量，分別按

表2 虎杖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test of polydatin（n＝6）

“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算虎杖苷的含量。結(jié)果，5批樣品（批號(hào)：20140301、20140302、20140303、20140304、20140305）中虎杖苷的含量分別為2.891‰、7.898‰、0.947‰、11.247‰、5.332‰（n＝3）。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本課題組參考了相關(guān)文獻(xiàn)中紅景天苷的流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸[10]、乙腈-水[11]、甲醇-水[12]；虎杖苷的流動(dòng)相：乙腈-水[13]、乙腈-0.5%乙酸、乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃[14]、甲醇-乙腈-0.1%甲酸[15]，結(jié)果，測(cè)定紅景天苷時(shí)以甲醇-水為流動(dòng)相、測(cè)定虎杖苷時(shí)以乙腈-水為流動(dòng)相的分離效果最好，并且柱效最高。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇-水（紅景天苷）、乙腈-水（虎杖苷）為流動(dòng)相。

3.2 樣品提取方法的選擇

在提取方法的選擇上，本課題組分別用回流法、索氏回流法、超聲法對(duì)樣品中紅景天苷和虎杖苷進(jìn)行提取。結(jié)果，采用回流法、索氏回流法、超聲法制備的供試品溶液所測(cè)得的待測(cè)成分含量相差不大，以超聲法測(cè)得待測(cè)成分的含量最高，且超聲法操作簡便，故兩種成分均選擇超聲法提取。

3.3 樣品提取溶劑的選擇

在提取溶劑的選擇上，課題組考察了甲醇、70%乙醇、水（紅景天苷），甲醇、稀乙醇、70%乙醇-乙酸乙酯（3∶1，V/V）（虎杖苷）。結(jié)果，紅景天苷以甲醇、虎杖苷以稀乙醇為溶劑時(shí)經(jīng)超聲法提取最充分，且含量均較高。因此，本試驗(yàn)選擇甲醇（紅景天苷）、稀乙醇（虎杖苷）為提取溶劑。

綜上所述，本方法操作簡單方便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于測(cè)定新扶正除疫顆粒中紅景天苷和虎杖苷的含量。

[1] 張雨舟.紅景天藥理作用研究進(jìn)展及應(yīng)用前景分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（25）：77-79、82.

[2] 黃海量.中藥虎杖藥理作用研究進(jìn)展[J].西部中醫(yī)藥，2012，25（4）：100-103.

[3] 崔偉亮，李慧芬，劉江亭.大青葉抗病毒抑菌作用研究進(jìn)展[J].山東中醫(yī)雜志，2014，33（5）：410-411.

[4] 崔月曦，劉合剛.貫眾的研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2014，16（12）：1043-1048.

[5] 王忠波，李丹.RP-HPLC法測(cè)定阿哌沙班片的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].中國藥房，2015，26（6）：828-831.

[6] 韓彩霞，蔣艷紅，馬海波.心欣顆粒中紅景天苷含量測(cè)定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（6）：51-52.

[7] 李海齊，周凡，胡志林.HPLC法測(cè)定復(fù)方薔薇紅景天口服液中紅景天苷的含量[J].兵團(tuán)醫(yī)學(xué)，2014，41（3）：4-7.

[8] 劉青，杜守穎，多吉仁青，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地大花紅景天中6種活性成分[J].中草藥，2015，46（2）：276-279.

[9] 黃鈺芳，李越峰，袁菊麗，等.正交設(shè)計(jì)-多元回歸法優(yōu)選紅景天中紅景天苷超聲波提取工藝[J].中國藥房，2015， 26（22）：3128-3130.

[10] 付錦光.心腦欣片中紅景天苷含量測(cè)定[J].河北中醫(yī)，2012，34（1）：105-107.

[11] 戚志華，王慶偉，王四旺，等.HPLC法測(cè)定不同生長期女貞子中紅景天苷的含量[J].中國藥房，2010，21（11）：996-997.

[12] 劉建明，熊立新，余松華.RP-HPLC法測(cè)定大鼠血漿中紅景天苷的濃度[J].江西中醫(yī)藥，2011，42（2）：64-65.

[13] 車彥忠，王培智，陳洪英，等.HPLC測(cè)定護(hù)肝寧丸中虎杖苷的含量[J].中醫(yī)臨床研究，2013，5（19）：27-28.

[14] 王亞洲.HPLC法同時(shí)測(cè)定燙傷合劑中綠原酸、虎杖苷和鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥師，2012，15（7）：993-995.

[15]丁雪鷹，侯曉麗，孫銘學(xué)，等.LC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中虎杖苷濃度[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2012，30（1）：45-48.

Contents Determination of Salidroside and Polydatin in New Fuzheng Chuyi Granule by RP-HPLC

FU Meili，YAN Mingming，SHAO Shuai，WU Chengyan，LIU Chang，TIAN Shuang，YU Zhongxian，YANG Yang（Chinese Medicine and Bioengineering R&D Center，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of salidroside and polydatin in new Fuzheng chuyi granule.METHODS：RH-HPLC was performed on the column of GRACE Alltima TMC 18 with mobile phase of methanolwater（15∶85，V/V，salidroside）and acetonitrile-water（23∶77，V/V，polydatin）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 275 nm（salidroside）and 306 nm（polydatin），column temperature was 25℃，and the injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 0.99-10.89 μg for salidroside（r＝0.999 8）and 0.046-1.196 μg for polydatin（r＝0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.31%-99.44%（RSD＝1.20%，n＝6）and 95.96%-99.73%（RSD＝1.42%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reliable，and suitable for the contents determination of salidroside and polydatin in new Fuzheng chuyi granule.

RP-HPLC；New Fuzheng chuyi granule；Salidroside；Polydatin；Content determination

R917

A

1001-0408（2017）06-0809-04

2016-03-01

2016-10-11）

（編輯：劉 柳）

國家科技重大專項(xiàng)課題（No.2012ZX09103201-033）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.20150204036YY）

＊碩士研究生。研究方向：中藥化學(xué)。E-mail：273575508@qq. com

#通信作者：教授。研究方向：中藥創(chuàng)新藥物。E-mail：yanmm 595@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.24