李紅雨，趙姍姍，張璘，張科，陳創(chuàng)夫，王遠志*

（1石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子832000；2濟南市中心醫(yī)院輸血科，山東 濟南250013；3平頂山學院，河南 平頂山467000；4石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832000）

新疆北疆地區(qū)寄生蜱無形體和疏螺旋體分子流行病學調(diào)查

李紅雨1，趙姍姍1，張璘2，張科3，陳創(chuàng)夫4，王遠志1*

（1石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子832000；2濟南市中心醫(yī)院輸血科，山東 濟南250013；3平頂山學院，河南 平頂山467000；4石河子大學動物科技學院，新疆 石河子832000）

為了解新疆北疆地區(qū)的家畜主要寄生蜱種的無形體和螺旋體的流行情況。采用聚合酶鏈反應（PCR）對采自家畜體表的546只成蜱（包括210只亞洲璃眼蜱，209只刻點血蜱，61只草原革蜱，40只邊緣革蜱，和26只圖蘭扇頭蜱）進行了無形體和螺旋體的核酸篩檢。結(jié)果顯示，無形體的總陽性率為53.48%(292/546)，螺旋體的總陽性率為17.77%(97/546)。此外有15只蜱復合感染了兩種病原的核酸。通過測序發(fā)現(xiàn)了嗜吞噬細胞無形體，綿羊無形體，伯氏疏螺旋體，伽氏疏螺旋體四種病原核酸，BLAST序列比對分析發(fā)現(xiàn)這四種病原核酸存在序列多樣性。由此可知，無形體在新疆家畜寄生蜱中呈高流行態(tài)勢，疏螺旋體呈散在分布，首次從邊緣革蜱中檢測到綿羊無形體核酸。在新疆等偏遠的農(nóng)村地區(qū)控制家畜體表寄生蜱數(shù)量以及蜱傳病原散播具有緊迫性。

無形體；疏螺旋體；寄生蜱；新疆北疆地區(qū)

無形體?。╝naplasmosis）是由無形體屬（Anaplasma）細菌引起的蜱傳人獸共患病。無形體病的病原體包括嗜吞噬細胞無形體、邊緣無形體、中央無形體、綿羊無形體、牛無形體和血小板無形體。其中嗜吞噬細胞無形體感染引起人粒細胞無形體病，而綿羊無形體可引起綿羊無漿體病。萊姆病（lyme disease）是由廣義的伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferisensu lato）感染可引起人的游走性紅斑為典型特點的萊姆病，感染動物則可表現(xiàn)為系統(tǒng)性癥狀（如發(fā)熱、疲乏、慢性進行性消瘦和精神沉郁等）的動物萊姆病。

蜱作為一種體表寄生蟲及一些重要人獸共患病的傳播媒介和貯存宿主，能給人類的身體健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來嚴重的危害。比如全溝硬蜱，太平洋硬蜱[1]能夠傳播導致萊姆病的伯氏疏螺旋體。而肩突硬蜱和太平洋硬蜱[2]能夠傳播引起人粒細胞無形體病的嗜吞噬細胞無形體。然而在“邊、窮、少”的農(nóng)村地區(qū)，系統(tǒng)報道家畜這兩種蜱傳病原的文獻很少。新疆占中國國土面積的六分之一，其經(jīng)濟和衛(wèi)生條件發(fā)展相對滯后，蜱種虐生和蜱傳疾病的爆發(fā)屢見不鮮[3]。文獻報道新疆至少有42個蜱種和10種蜱傳疾病[4]。然而關(guān)于家畜寄生蜱感染無形體和疏螺旋體系統(tǒng)的流行病調(diào)查研究尚未見諸報道。本課題組以往關(guān)于西北主要蜱種的調(diào)查顯示亞洲璃眼蜱、刻點血蜱、草原革蜱、邊緣革蜱和圖蘭扇頭蜱是家畜體表的主要蜱種[5]。為了系統(tǒng)評估家畜體表寄生蜱的病原攜帶情況，我們對北疆13個縣、市農(nóng)村地區(qū)的優(yōu)勢蜱種進行無形體和疏螺旋體的流行病學調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2012-2014年期間（每年4月初至5月中旬），從北疆家畜體表共收集到4711只成蜱。依據(jù)參考文獻[6]經(jīng)體視解剖顯微鏡（LEICA M165C）進行形態(tài)學鑒定后，篩選出5個主要蜱種亞洲璃眼蜱210只，刻點血蜱209只，草原革蜱61只，邊緣革蜱40只，圖蘭扇頭蜱26只做進一步的調(diào)查研究。這546只蜱采自北疆的13個縣市（察布查爾、福海、阜康、吉木薩爾、克拉瑪依、米泉、木壘、青河、奇臺、沙灣、石河子、伊寧和裕民）。

1.2 DNA提取、PCR擴增、測序

按DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說明書，提取蜱的基因組DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。依?jù)參考文獻引物[7]，進行蜱線粒體 16S rDNA和cox1基因擴增進行進一步的分子學鑒定。依據(jù)參考文獻[8]采用PCR檢測疏螺旋體和無形體核酸。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行DNA序列測定，測序結(jié)果通過在GenBank中進行BLAST分析后，將差異序列登錄至GenBank。

2 結(jié)果與分析

無形體的分子流行率53.48%，疏螺旋體的流行率為17.77%（表1）。有15只蜱復合感染了無形體和疏螺旋體。復合感染見于亞洲璃眼蜱，刻點血蜱和邊緣革蜱。病原核酸測序分析顯示：共檢出4種病原，即嗜吞噬細胞無形體、綿羊無形體、伯氏疏螺旋體和伽氏疏螺旋體。BLAST序列比對結(jié)果顯示，新疆北疆地區(qū)的這4種病原核酸具有序列多樣性（表2），其中嗜吞噬細胞無形體有三種16S rDNA序列類型，分別與中國湖北（GenBank登錄號：HQ171975和GQ900613），意大利福賈市（KF293668），美國加利福尼亞（KP276588）最相似。而綿陽無形體有兩種16S rDNA序列類型，分別與中國新疆（KJ410246）和土耳其埃拉澤（KF034788）最為接近，伯氏疏螺旋體有兩種5S-23S基因間隔區(qū)序列類型，分別與美國喬治亞州（KM269458）和中國新疆（KP400556）接近。伽氏疏螺旋體也有兩種5S-23S序列類型，分別與俄羅斯莫斯科（AB178363）和捷克布杰約維采（AF497990）最接近。

表1 546只成蜱各個地區(qū)病原的陽性率%Tab.1 546 adult ticks and prevalence of pathogens in each sampling site

表2 新疆北疆地區(qū)主要蜱種中嗜吞噬細胞無形體16S rDNA基因部分序列 (表 2A),綿羊無形體（A.ovis）(表2B),伯氏疏螺旋體5S-23S基因間隔區(qū)序列(表2C),伽氏疏螺旋體5S-23S基因間隔區(qū)序列(表2D)Tab.2 Closest relative sequences to the partial 16S gene sequences of theAnaplasma phagocytophilum (Table 2A),A.ovis(Table 2B),5S-23S gene sequences ofBorrelia burgdorferi(Table 2C),andB.garinii(Table 2D) detected in the questing ticks,northwest of China

續(xù)表1

3 討論

（1）本研究首次對新疆北疆地區(qū)13個縣、市農(nóng)村地區(qū)家畜體表寄生的5種優(yōu)勢蜱，進行了無形體和疏螺旋體的核酸檢測調(diào)查。結(jié)果顯示無形體和疏螺旋體在本地區(qū)家畜寄生蜱中呈高流行態(tài)勢，攜帶率分別為53.48%(292/546)和17.77%(97/546)。此外，有15只蜱復合感染了兩種病原核酸。這些結(jié)果與中國的其他地方[9]相比，新疆家畜體表蜱攜帶無形體和疏螺旋體具有陽性率高、分布范圍廣和病原類型豐富的特點，其可能的原因如下：首先，可能是由于新疆的畜牧業(yè)規(guī)模較大，且是傳統(tǒng)養(yǎng)殖，在每年5月之前對家畜很少進行藥浴和使用殺蟲劑，這種狀況與Lorusso[10]等在非洲尼日利亞的調(diào)查相似，這就增加了散養(yǎng)家畜之間水平傳播蜱傳病原的可能性；其次，硬蜱攜帶無形體是越冬生存的生理需要，Neelakanta[11]等報道寒冷地區(qū)無形體高流行可能是因為：無形體能夠誘導硬蜱高表達抗凍糖蛋白，從而使多宿主蜱、蜱卵能夠成功越冬。

（2）通過PCR和測序本研究發(fā)現(xiàn)了4種病原，即：嗜吞噬細胞無形體、伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體和綿羊無形體。許多研究顯示：在中國，不同蜱種能夠特異性的攜帶不同的無形體種。綿羊無形體曾在伊朗的血紅扇頭蜱中被檢測出來[12]。在本研究中，我們首次在邊緣革蜱檢出綿羊無形體核酸。邊緣革蜱在新疆廣泛分布，在山西，陜西，內(nèi)蒙古，吉林亦有零星分布。筆者認為：今后應加強其他省份邊緣革蜱中綿羊無形體核酸的檢測；邊緣革蜱能否作為綿羊無形體的傳播媒介還有待進一步研究。

（3）本調(diào)查顯示家畜體表寄生蜱攜帶的無形體和疏螺旋體存在種間多樣性，這很可能因為新疆為連接亞歐的古絲綢之路的要道，家畜的國際貿(mào)易較為頻繁，蜱蟲隨家畜的貿(mào)易運輸而播散，由此可能導致其攜帶的病原具有序列多樣性。另外可能由于新疆是世界候鳥遷徙的重要驛站，候鳥的攜蜱遷徙，將蜱蟲帶至世界各地，也為病原的核酸序列多樣性提供了一種支持的可能。

（4）Wang[5]等人曾在家畜體表的亞洲璃眼蜱，刻點血蜱，邊緣革蜱和圖蘭扇頭蜱中分離出伯氏疏螺旋體。此次病原學調(diào)查中檢測到了伯氏疏螺旋體和伽氏疏螺旋體核酸，拓寬了以往萊姆病病原在新疆的分布。

（5）硬蜱復合感染多種病原的狀況引起人們的關(guān)注。歐洲學者報道了篦子硬蜱[13]復合感染伯氏疏螺旋體、嗜吞噬細胞無形體、微小巴貝西蟲和分歧巴貝西蟲。Milhano[14]等人報道23.3%邊緣革蜱中復合感染斯洛伐克立克次體和盧西塔尼疏螺旋體。Chen等[15]在河南的研究顯示：27只寄生蜱中有3只長角血蜱復合感染了微小巴貝西蟲和未知種立克次體，另外2只蜱分別復合感染了呂氏泰勒蟲和未知種埃立克體以及呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細胞無形體。本研究中蜱復合感染率雖低于以上地區(qū)，但檢出的蜱傳病原（如嗜吞噬細胞無形體、伯氏疏螺旋體）對人、畜健康危害嚴重，合并感染引起的并發(fā)癥須引起當?shù)蒯t(yī)療、動物疫控等單位的關(guān)注。

綜上所述，本研究顯示：

1）無形體在新疆北疆地區(qū)家畜寄生蜱中呈現(xiàn)高流行和廣泛分布，本研究檢測到嗜吞噬細胞無形體和綿羊無形體兩種病原。

2）蜱中萊姆病病原體在北疆呈散在分布，其病原體為伯氏疏螺旋體和伽氏疏螺旋體，以伯氏疏螺旋體為主，這與以往報道不一致。

3）蜱傳病原核酸序列分析顯示這4種蜱傳病原在北疆存在核酸序列多樣性。

4）首次在邊緣革蜱中檢到了綿羊無形體的核酸。這些研究結(jié)果提示：在新疆等偏遠的農(nóng)村地區(qū)控制家畜體表寄生蜱以及蜱傳病原具有緊迫性。

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Molecular investigation on the genera ofAnaplasmaandBorrelia in north region of Xinjiang

Li Hongyu1，Zhao Shanshan1，Zhang Lin2，Zhang Ke3，Chen Chuangfu4，Wang Yuanzhi1
(1 School of Medicine,Shihezi University,Shihezi 832002,China；2 Department of Blood Transfusion，Ji'nan Center hospital, Ji'nan,Shandong 250013,China；3 Department of Basic Medicine,Pingdingshan University,Pingdingshan,Henan 467000,China; 4 Department of Veternary Medicine,College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000, China)

The aim of this study was to determine the prevalence ofAnaplasmaandBorreliain dominant ticks infecting domestic animals in north region of Xinjiang Uygur Autonomous Region(XUAR).Five hundreds and forty-six represented adult ticks from livestocks (including 210Hyalomma asiaticum,209Haemaphysalis punctata,61Dermacentor nuttalli,40D.marginatusand 26 Rhipicephalus turanicus)were tested by Polymerase Chain Reaction (PCR)for the nucleic acid presence ofAnaplasmaand Borrelia.Overall infectious prevalences were 53.48% (292/546)for Anaplasma spp.and 17.77% (97/546)for Borrelia spp.In addition,15 ticks (2.75%)were co-infected with Anaplasma and Borrelia.Four pathogens,namedA.phagocytophilum,A.ovis, B.burgdorferisensu stricto andB.garinii,were detected by PCR.The sequences of four tick-borne pathogens,in this study, showed genetic diversity by BLAST analysis.In northern region of XUAR,Anaplasmawas highly prevalent in questing ticks from livestocks while theBorreliain questing ticks was scattered.DNA ofA.ovis,for the first time,was found inD.marginatus. It is vital to control tick abundance and tick-borne pathogens from livestocks especially in resource-poor rural communities,such as in XUAR.

Anaplasma;Borrelia;ectoparasitic ticks;Northern region of XUAR

R381

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.01.018

1007-7383(2017)01-0108-05

2016-10-26

國家自然科學基金項目（U1503283，81560338）

李紅雨（1988-），男，碩士研究生，專業(yè)方向為感染免疫學。

*通信作者：王遠志（1977-），男，教授，從事感染免疫學研究，e-mail:wangyuanzhi621@126.com。