阿勒泰別克·鬧乎旦，張玉玲，白廣超，金洪亮，李寬新*

（1新疆兵團(tuán)醫(yī)院關(guān)節(jié)脊柱外科，新疆 烏魯木齊 832000；2新疆兵團(tuán)醫(yī)院教學(xué)科,新疆 烏魯木齊 830000）

Wnt因子聯(lián)合BMP-7誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化的研究

阿勒泰別克·鬧乎旦1，張玉玲2，白廣超1，金洪亮1，李寬新1*

（1新疆兵團(tuán)醫(yī)院關(guān)節(jié)脊柱外科，新疆 烏魯木齊 832000；2新疆兵團(tuán)醫(yī)院教學(xué)科,新疆 烏魯木齊 830000）

為了觀察Wnt聯(lián)合BMP誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化是否具有協(xié)同作用，本研究以密度梯度離心聯(lián)合貼壁法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組、Wnt組、BMP-7組、Wnt和BMP-7聯(lián)合誘導(dǎo)組；以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性；定量測(cè)定堿性磷酸酶（ALP）活性；以RT-PCR技術(shù)檢測(cè)特異成骨轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況；使Von Kossa染色法觀察細(xì)胞內(nèi)礦化沉積程度。結(jié)果顯示：以CKK-8法測(cè)培養(yǎng)第7天時(shí)聯(lián)合組吸光度值為0.847，Wnt組為0.739，均明顯高于對(duì)照組0.408，差異具有顯著性（P<0.05）；聯(lián)合誘導(dǎo)組的ALP活性比值在培養(yǎng)第6天和第12天時(shí)分別為63.9和144.4，BMP-7組分別為40.9和104.2，均明顯高于對(duì)照組的7.2和18.8，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；培養(yǎng)14 d后，OCN、β-Catenin的相對(duì)灰度值聯(lián)合組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），而Runx2及Osterix的表達(dá)量各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；培養(yǎng)3周后，以Von Kossa染色后觀察到鈣結(jié)節(jié)在大小和數(shù)量上聯(lián)合組均大于對(duì)照組。由此可知，Wnt3a因子和BMP-7聯(lián)合可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，且兩者具有協(xié)同作用。

Wnt3a；BMP-7；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化

研究認(rèn)為成骨細(xì)胞(Osteoblast)、破骨細(xì)胞(Osteoclasts)及多種生長(zhǎng)因子共同參與完成了骨的形成、代謝及修復(fù)再生，而具有持續(xù)成骨能力的細(xì)胞是維持這一動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵性因素[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells)的增殖及定向分化是一復(fù)雜的過(guò)程，各種激素、生長(zhǎng)因子都參與其中，Wnt/β-catenin及BMP信號(hào)通路在該過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。

在很多的生物學(xué)行為例如干細(xì)胞的增殖分化、胚胎發(fā)育、癌的發(fā)生中，Wnt和BMP信號(hào)通路的表達(dá)在空間和時(shí)間節(jié)奏上相互影響，這表明兩種信號(hào)途徑間存在交聯(lián)關(guān)系(crosslinked relations)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein）是 TGF-β 超家族的一員。BMP-7是BMP家族中成骨作用最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子，其調(diào)節(jié)骨與軟骨再生的方式為結(jié)合骨形成蛋白受體進(jìn)而激活Smads/Runx2/Osterix和P38MAPKS通路途徑。BMP-7信號(hào)下游序列中存在兩個(gè)特異性的成骨轉(zhuǎn)錄因子，分別為Runx2與Osterix，前者在干細(xì)胞定向分化的起始階段發(fā)揮重要作用，而后者則在終末階段發(fā)揮作用，它們可調(diào)節(jié)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)、Ⅰ型膠原、骨橋素(Osteopontin)、骨鈣素(Osteocalcin)等的表達(dá)，這些均為成骨細(xì)胞的標(biāo)志物。

目前，大量的研究表明BMP和Wnt蛋白都可以通過(guò)各自的信號(hào)通路調(diào)節(jié)干細(xì)胞的分化[1]，但作為單一的成骨誘導(dǎo)因子時(shí)，誘導(dǎo)效果并不理想，故我們考慮在本實(shí)驗(yàn)中把Wnt3a與BMP-7聯(lián)合起來(lái)進(jìn)行干細(xì)胞的誘導(dǎo)，以觀察兩種因子誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化時(shí)是否具有協(xié)同作用，進(jìn)而初步探討兩種通路之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠15只，不限雌雄，體重（100± 20）g，由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BMSCs)的分離、純化、培養(yǎng)

取大鼠，進(jìn)行稱(chēng)重，記錄完畢后以頸椎脫臼法處死大鼠，放入75%酒精中浸泡消毒5 min，分離出脛骨及腓骨，放入PBS內(nèi)浸泡，移入超凈臺(tái)內(nèi)。以組織剪去除股骨及脛骨兩端，露出骨髓腔，以2.5 mL注射器抽取培養(yǎng)液（含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基）反復(fù)沖洗髓腔直至呈現(xiàn)透明。沖洗液以1200 r/min速度離心7 min后去上清，加入培養(yǎng)液重懸后 用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×107/mL接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中，設(shè)置參數(shù)為37℃、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)。每三天全換液，當(dāng)瓶底被貼壁細(xì)胞爬滿時(shí)，用0.25%胰蛋白酶按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的體外誘導(dǎo)分化

取第3代細(xì)胞調(diào)整密度為1×107/mL種植于6 cm培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿底被貼壁細(xì)胞覆蓋達(dá)80% -90%時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)劑，繼續(xù)在常規(guī)條件下培養(yǎng)。按誘導(dǎo)劑不同分為 4組：Wnt3a組（100 ng/mL）、BMP-7組（100ng/mL）、聯(lián)合誘導(dǎo)組（Wnt3a100 ng/mL+BMP-7100 ng/mL）以及對(duì)照組（不加入任何誘導(dǎo)劑）。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

每組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的第1、3、7、10天加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，把制成的單細(xì)胞懸液接種于96孔板中(每孔加入100 μL，細(xì)胞數(shù)量約為2×103)，隨后每孔加入CCK-8工作液10 μL進(jìn)行2 h的孵育，使用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞懸液450 nm處的吸光度（OD值）。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次，最后匯總每次測(cè)得的OD值，取其平均值。

1.5 定量測(cè)定ALP活性

調(diào)節(jié)各組細(xì)胞密度為3×104/mL接種于6孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的第6天和第12天進(jìn)行PBS漂洗 ，隨后每孔加入0.5%Triton500 μL，置于4℃中12 h，期間于-20℃和20℃之間反復(fù)凍融3次，然后置于EP管中，隨后把30 μL細(xì)胞裂解液、0.5 mL緩沖液和0.5 mL基質(zhì)液依次加入到EP管中，混勻后進(jìn)行37℃水浴15 min，每管中加入1.5 mL顯色劑后使用分光光度儀測(cè)其在490 nm下的吸光度，再取2 μL細(xì)胞裂解液應(yīng)用BCA試劑盒測(cè)各樣品總蛋白濃度，使用下述公式計(jì)算ALP活性比值并與ALP標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，作柱狀圖。

細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性(U/gprot)=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管含酚量÷樣品中蛋白克數(shù)

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

（1）細(xì)胞總RNA的抽提：1）在各組細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的第14天時(shí)，把1 mL Trizol加入到每個(gè)培養(yǎng)瓶中以裂解細(xì)胞，隨后移入1.5 mL EP管中，置于-20℃保存。2）兩相分離 細(xì)胞裂解充分后放置冰上約5 min，把0.2 mL的氯仿加入EP管后劇烈振蕩15 s，在室溫下孵育3 min后放入離心機(jī)，4℃下12000 r/min離心15 min，去除沉淀后可見(jiàn)混合液體分三層：下層為紅色，上層及中間層為無(wú)色水相，RNA全部分配于上層中。3）RNA沉淀 抽取0.3 mL的上層液體及等體積的異丙醇放入一離心管中，混勻后在室溫下孵育10 min，隨后放入離心機(jī)中在4℃下12000 r/min離心10 min，得到的沉淀物即為RNA。4）RNA清洗 移除上清液，加入1 mL的75%乙醇，放入離心機(jī)中在4℃下8000 r/min離心5 min后棄上清液。5）RNA干燥 多余液體去除后，放在室溫空氣中晾干RNA沉淀。6）加入30 μL消毒的DEPC水反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，置于-80℃保存。

（2）RNA樣品的濃度檢測(cè)：應(yīng)用紫外分光光度儀（UV spectrophotometer）測(cè)定 A260/A280值并計(jì)算RNA濃度，其比值范圍應(yīng)為1.8-2.1。

（3）樣品cDNA的合成：1）RNA的熱變性：取1 μg總RNA，加入隨機(jī)引物(Random primer)、Oligo(dT) 20、去離子水于65℃熱變性5 min，隨后置于冰上以進(jìn)一步操作。2）逆轉(zhuǎn)錄：加入2 μL的dNTP Mixture、4 μL的5×Buffer、l μL的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT-Ace）及1 μL的RNA酶抑制劑直至體積為20 μL。在42℃下反應(yīng)20 min后瞬間離心即得到cDNA，混勻后置入PCR儀中，在37℃下孵育5 min。3）擴(kuò)增：取各組cDNA 1 μL分別加入12.5 μL的2×PCR TaqMix、上/下游引物（10 μmol/L）各1 μL，最后加入超純水直至體積為25 μL。第一步：94℃預(yù)變性3 min；第二步：94℃變性1 min；第三步：55℃退火30 s；第四步：72℃延伸30 s。重復(fù)第2-4步30次，最后進(jìn)行72℃延伸10 min。以β-actin為內(nèi)參。每組cDNA樣本重復(fù)3次，各組PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件(Gel imaging analysis system)照相并對(duì)各電泳條帶吸光灰度值進(jìn)行分析，引物見(jiàn)表1。

表 1 引物序列及產(chǎn)物大小Tab.1 Primer sequences and their product sizes

1.7 VonKossa染色

調(diào)節(jié)各組細(xì)胞密度至2×104/mL后接種于12孔板中，誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后可見(jiàn)皿底形成半透明結(jié)節(jié)樣物質(zhì)。依次加入去離子水、4%多聚甲醛、1%硝酸銀，室溫下孵育2 min，去除多余液體后在紫外燈下暴露1 h，隨后用去離子水清洗后在空氣中晾干，5%硫代硫酸鈉染色2 min，1%中性紅復(fù)染10 min，去離子水漂洗后觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P< 0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)

使用倒置相差顯微鏡 (Inverted phase contrast microscope)觀察培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)：剛接種時(shí)BMSCs呈球形懸浮，培養(yǎng)12 h后部分貼壁，72 h后可完全貼壁，培養(yǎng)7 d左右細(xì)胞體積變大，布滿瓶底，為長(zhǎng)梭形。傳代培養(yǎng)(Subculture)后細(xì)胞貼壁加速，細(xì)胞形態(tài)向多角形轉(zhuǎn)化（圖1）。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs形態(tài)（×100）Fig.1 The BMSCs morphology observed by inverted phase contrast microscope

2.2 細(xì)胞增殖能力測(cè)定

以CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值可發(fā)現(xiàn)：BMSCs在接種后的第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(Logarithmic growth phase)，第7天達(dá)高峰，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。第7天時(shí)聯(lián)合組（0.847）>對(duì)照組（0.408），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組BMSCs增殖曲線Fig.2 BMSCs proliferation curves of each group

2.3 細(xì)胞堿性磷酸酶活性測(cè)定

堿性磷酸酶（ALP）是早期成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志之一，分別在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第6天和12天定量測(cè)定各組細(xì)胞的ALP活性。培養(yǎng)第6天時(shí)：聯(lián)合組(63.9) >BMP-7組 (40.9)>對(duì)照組 (7.2)，差異具有顯著性（P<0.05）；培養(yǎng)第12天時(shí)：聯(lián)合組(144.4)>BMP-7組(104.2)>對(duì)照組 (18.8)，差異具有顯著性（P<0.05）（圖3）。

圖3 各組BMSCs堿性磷酸酶活性Fig.3 BMSCs alkaline phosphatase activities in each group

2.4 RT-PCR

誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，用 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)OCN、 β-Catenin及Runx2、Osterix的表達(dá)情況。結(jié)果表明，OCN、β-Catenin的相對(duì)灰度值聯(lián)合組高于對(duì)照組，差異具有顯著性（P<0.05），而Runx2及Osterix的表達(dá)量各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 各組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因表達(dá)情況Fig.4 The expressions of osteogenic differentiation related genes detected after 14 days of induction of cells in each group

2.5 礦化沉積

誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行Von Kossa染色，然后鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況：在鈣結(jié)節(jié)大小及數(shù)量上聯(lián)合組>BMP-7組>Wnt3a組>對(duì)照組（表2）。由圖5可知：接種第3d細(xì)胞基本貼壁，部分伸出偽足；培養(yǎng)第7 d細(xì)胞體積增大，長(zhǎng)梭形，部分呈集落樣生長(zhǎng)；加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)3 d后細(xì)胞形態(tài)趨于一致，向多角形轉(zhuǎn)化。

表2 各組電泳目標(biāo)條帶相對(duì)灰度值Tab.2 Relative gray value of electrophoresis target bands in each group

圖5 各組BMSCs Von Kossa染色情況Fig.5 The observersion of BMSCs Von Kossa staining in each group

3 討論

理想的種子細(xì)胞和成骨誘導(dǎo)劑（Osteogenic inducer）是構(gòu)建組織工程最重要的兩個(gè)因素。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢(shì)：擴(kuò)增迅速、獲取方便、多向分化潛能及免疫豁免（Immune privilege）等[2]。BMP及Wnt因子是目前研究較熱門(mén)的兩種成骨誘導(dǎo)劑，BMP信號(hào)通路在BMSCs的成骨誘導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用[3]，除了目前已經(jīng)用于臨床治療的BMP-2，BMP-7也被證實(shí)有較強(qiáng)的成骨活性。Wnt信號(hào)通路具有維持原始細(xì)胞和引導(dǎo)細(xì)胞成熟兩方面的作用，有研究證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力[4]。本實(shí)驗(yàn)分別以BMP-7及Wnt3a作為誘導(dǎo)劑，結(jié)果同樣證實(shí)了兩種信號(hào)通路都具有誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化能力。

研究證實(shí)BMP信號(hào)通路及Wnt/β-catenin信號(hào)通路均具有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力，故兩種信號(hào)通路是否具有協(xié)同作用及進(jìn)一步的機(jī)制是本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。研究中我們發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合誘導(dǎo)組ALP的表達(dá)量明顯高于BMP-7單獨(dú)誘導(dǎo)組，這表明Wnt3α增強(qiáng)了BMP-7誘導(dǎo)的早期成骨標(biāo)志ALP的活性。Stewart S等[5]的研究發(fā)現(xiàn)BMP可以通過(guò)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)ALP的表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。但是，ALP是早期成骨的標(biāo)志，并不能有力地證明BMSCs分化成為成熟的成骨細(xì)胞，所以我們又檢測(cè)了反應(yīng)成骨中晚期的指標(biāo)：OCN及礦化沉積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合誘導(dǎo)組在OCN的表達(dá)量、鈣結(jié)節(jié)數(shù)量及大小上均高于BMP-7誘導(dǎo)組。Liu D等[6]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin和BMP存在協(xié)同作用，可以上調(diào)OCN的表達(dá)及基質(zhì)礦化的速度。另有研究表明，Wnt/β-catenin在間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過(guò)程中主要起的是“穩(wěn)定器”的作用，增強(qiáng)了間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞膜對(duì)BMP的敏感性，保證干細(xì)胞分化過(guò)程的穩(wěn)定進(jìn)行[7]。以上這些研究都與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。但有些研究卻得出Wnt3α與BMP聯(lián)合后兩種通路表現(xiàn)出相互抑制的結(jié)果[8-9]，例如 Guerrero F等[10]在研究中發(fā)現(xiàn)BMP激活Smad 1后抑制dvl的表達(dá)，從而抑制了Wnt通路的成骨誘導(dǎo)作用。但是本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持Wnt3α增強(qiáng)BMP-7成骨誘導(dǎo)分化能力，造成這種差異性，筆者做出以下推斷：選擇的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的差異；檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的差異造成得出的結(jié)論相差甚至完全相反。在本實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)：Wnt3α聯(lián)合BMP-7具有非凡的成骨誘導(dǎo)能力，這給干細(xì)胞移植治療骨缺損等疾病提供了另一種思路。但是，Wnt3α與BMP-7涉及兩種完全不同的通路，其協(xié)同機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。

為了進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin與BMP兩種通路的相互交聯(lián)機(jī)制，我們用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了Runx2基因的表達(dá)量，Runx2是BMP-7信號(hào)下游序列中具有特異性的成骨轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合誘導(dǎo)組的表達(dá)量和單獨(dú)誘導(dǎo)組并無(wú)差異。這和張曉等[11]的研究結(jié)果相反，其在研究中聯(lián)合 Wnt3α 與BMP-9對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果得到聯(lián)合組Runx2的表達(dá)量明顯高于單獨(dú)誘導(dǎo)組，故其認(rèn)為Runx2是Wnt/β-catenin和BMP通路的“交匯點(diǎn)”。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明聯(lián)合誘導(dǎo)組和單獨(dú)誘導(dǎo)組Runx2的表達(dá)量無(wú)明顯差異，不能說(shuō)明Runx2是兩種通路的“交匯點(diǎn)”，這和 D’Alimonte I[12]及 Jing Jian[13]等人的研究結(jié)論相一致。對(duì)此，筆者認(rèn)為：Wnt/β-catenin和BMP兩種通路作用在BMSCs成骨分化的不同階段，兩種通路的相互影響具有時(shí)間特異性。有部分學(xué)者認(rèn)為兩種通路的相互影響還具有空間特異性，例如Su X[14]、Liou S F[15]、Li J[16]等人在研究中發(fā)現(xiàn)Wnt控制矢狀軸部位的組織再生，而B(niǎo)MP主要控制中線軸部位的組織再生。因此，Wnt/β-catenin與BMP兩種信號(hào)通路的相互作用機(jī)制十分復(fù)雜，這種復(fù)雜的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。

Wnt因子和 BMP均對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的成骨分化具有促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)嘗試性的將Wnt3a與BMP-7聯(lián)合進(jìn)行干預(yù)并初步探索Wnt與BMP信號(hào)通路之間的聯(lián)系。本研究結(jié)果表明：Wnt3a聯(lián)合BMP-7誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化優(yōu)于單獨(dú)誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果，為間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)探索了一條新途徑，但其復(fù)雜的機(jī)制尚未完全完全揭示，需要更進(jìn)一步的研究。

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Study on induction of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts by combination of Wnt factor and BMP-7

Aletaibieke Naohudan1,Zhang Yuling2,Bai Guangchao1,Jin Hongliang1,Li Kuanxin1*
(1 Department of Joint and Spinal,Xinjiang Production and Construction Corps Hospital,Urumqi,Xinjiang 830000,China; 2 Department of Science and Education,Xinjiang Production and Construction Corps Hospital,
Urumqi,Xinjiang 830000,China)

To observe the synergistic effect of Wnt combined with BMP on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells,isolated culture was performed on MSCs by density-gradient centrifugation combined with adherence method.The control group,Wnt group,BMP-7 group,Wnt-BMP-7 combined induction group were defined.The cell proliferative activity was detected by CCK-8 method.The ALP activity was detected quantitatively.The expression levels of the osteoblast-specific transcription factors were detected by RT-PCR.The degree of intracellular mineral deposition was observed by VonKossa staining method.The results showed that the light absorbance at 7 days of culture with CKK-8 method was 0.847 in the combined induction group and 0.739 in the Wnt group,both of which were significantly higher than 0.408 in the control group(P<0.05); the ALP activity ratios at 6 and 12 days of culture was 63.9 and 144.4,respectively in the combined induction group,and 40.9 and 104.2,respectively in the BMP-7 group,which were all significantly higher than 7.2 and 18.8,respectively in the control group (P<0.05);at 14 days,the relative gray values of OCN and β-Catenin were higher in the combined induction group than in the control group(P<0.05),while there was no statistically significant difference in the expression levels of Runx2 and Osterixacross the groups;at 3 weeks of culture,both the size and number of calcium nodules observed following VonKossa staining were greater in the combined induction group than in the control group.The conclusion is that combination of Wnt3a and BMP-7 has synergistic action in promoting differentiation of MSCs into osteoblasts.

Wnt3a;BMP-7;marrow mesenchymal stem cells;osteogenesis

R285

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.01.019

1007-7383(2017)01-0113-06

2016-10-26

新疆兵團(tuán)衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（WSJ201406）

阿勒泰別克.鬧乎旦（1968-），男，副主任醫(yī)師，從事關(guān)節(jié)脊柱外科研究。

*通信作者：李寬新（1969-），男，主任醫(yī)師，從事關(guān)節(jié)脊柱外科學(xué)研究，e-mail:likuanxin@sohu.com。