王利杰
摘 要:采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測了發(fā)酵液中維生素B12的含量,使用費氏丙酸桿菌細胞破碎提取維生素B12。結果顯示,羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素的回收率分別為92.43%,97.56%和96.45%.費氏丙酸桿菌的質量濃度分別為43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。經超聲波破碎,經測定,維生素B12的產量分別為13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。維生素B12經微波加熱法獲得的提出率最大,其次為煮沸法、超聲法和高壓均質法。HPLC具有良好的重復性和較快的分析速度,而在費氏丙酸桿菌細胞破碎提取中,微波加熱法和煮法法值得推廣。
關鍵詞:發(fā)酵液;維生素B12;高效液相色譜法;超聲波
中圖分類號:TQ924 文獻標識碼:A DOI:10.15913/j.cnki.kjycx.2016.22.106
維生素B12又被稱為鈷胺素,主要是通過微生物發(fā)酵獲取的,其被廣泛應用于醫(yī)藥、食品工業(yè)等方面。在實踐中,常見的檢測方法有微生物法、間接檢測法等,其中,HPLC的使用頻率最高。但是,因為維生素B12的發(fā)酵周期過長、發(fā)酵物種繁多,所以,急需構建準確、簡便、高效的檢測方法。目前,關于維生素B12的檢測和提取的研究報道比較少。因此,本文利用HPLC檢測了維生素B12,并借助大孔樹脂吸附法進行了提取,效果顯著,具體情況如下。
1 實驗材料
實驗一:費氏丙酸桿菌,質量分數(shù)為5%的玉米漿,質量分數(shù)為2%的葡萄糖,質量分數(shù)為0.2%的硫酸銨,高效液相色譜儀,超聲波細胞破碎儀,高速離心機,大容量離心機,純水機,分析純,色譜柱為5 μm,(4.7×25.0)cm。
實驗二:菌種、培養(yǎng)基同實驗一,采用高效液相色譜儀,高速離心機,大容量離心機,超聲波細胞破碎儀,微波爐,高壓均質機,考馬斯亮藍染液,色譜柱5 μm,(4.7×25.0)cm。
2 實驗方法
實驗一:培養(yǎng)費氏丙酸桿菌,利用生理鹽水清洗菌體,靜置30 ℃,培養(yǎng)50 h。接種發(fā)酵培養(yǎng)基后,靜置30 ℃,培養(yǎng)100 h,發(fā)酵后40 h,添加二甲基苯并咪唑,誘導菌體,積累維生素B12,離心4 000 r/min,獲取菌體。具體實驗有,重復性實驗、穩(wěn)定性試驗、回收率實驗,即稱取5份菌體,質量相同,制備樣品,添加等量羥基鈷胺素和甲基鈷胺素,置于4 ℃冰箱內,避光保存,檢測間隔時間為1 h/次,分析樣品5 h內的穩(wěn)定性。
實驗二:配置不同濃度的血清白蛋白溶液,取0.1 mL,加入考馬斯亮藍染液5 mL。維生素B12的提取方法有4種,即超聲法,稱取菌體,放置在小燒杯內,離心后,溶解菌體,選取不同時間,探討其提取效率,取上清,測定蛋白質釋放率,除蛋白質后測定維生素B12的含量;煮沸法,定容后,煮沸,離心,過濾上清液后,測定維生素B12的含量。此外,還包括微波加熱法和高壓均質法,此處不一一闡述。
3 實驗結果
實驗一:細胞破碎液處理后,獲得了HPLC色譜圖,羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素均在25 min內完全分離,各自保留時間為10.9 min、18.5 min、22.4 min,細胞破碎液中雜質6 min內被洗脫,借助梯度洗脫,分離了脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。三類不同濃度的鈷胺素與色譜峰面積呈線性關系,因其對光線敏感,操作時應避光,質量濃度為10~200 μg/mL,三者線性關系良好。維生素B12經重復性實驗,5次實驗標準偏差均低于2.5%,均在允許誤差范圍內。此結果表明,儀器具有較高的精密度,分析方法具有良好的重復性。穩(wěn)定性實驗,維生素B12置于避光環(huán)境中,5 h內穩(wěn)定,三者的回收率分別為92.43%,97.56%,96.45%. 費氏丙酸桿菌的質量濃度分別為43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。經超聲波破碎,測定維生素B12的產量分別為13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。
實驗二:費氏丙酸桿菌菌體采取不同的方法提取維生素B12,提出率最大的為微波加熱法,其次為煮沸法、超聲法和高壓均質法,分別為100.00%,97.67%,89.65%和88.63%.
4 討論
經微生物發(fā)酵獲取維生素B12常見的有羥基鈷胺素、脫氧腺苷鈷胺素和甲基鈷胺素。為了快速測定發(fā)酵液中維生素B12的含量,本文采用了HPLC方法,離心后,得到了菌體,待預處理后使用醋酸鈉緩沖液為流動相。實驗結果為檢測方法精準。在鈷胺素類物質檢測中使用HPLC,優(yōu)勢顯著,準確、快速,具有良好的重復性。因此,該方法可用于鈷胺素工業(yè)發(fā)酵生產。在實踐過程中,可以對維生素B12進行定量分析,其應用價值顯著,值得推廣。
維生素B12為細胞內產物,在提取時關鍵環(huán)節(jié)便是破碎細胞,其對產物有直接的影響,比如活性、收率、成本等。因此,在實踐過程中,應確保細胞破碎方法具有合理性、針對性和有效性。目前,常見的細胞破碎方法有2種,一種為機械法,另一種為非機械法,前者包括株磨法、超聲波法,后者包括化學法、物理法等。為了指導實踐,使維生素B12提取更加簡便,本文對比了不同提取方法,取得了良好的效果。其中,微波加熱法的提取時間最短,但是,在工業(yè)應用中,需要借助大型配套設備。此外,煮沸法優(yōu)點顯著,提取效率高,處理量大,僅需簡單的設備,值得推廣。
參考文獻
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〔編輯:白潔〕