乞艷華，余珊珊，李小鵬，麻妙艷，鄔晉芳，周 琦*，雷小瑩

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院超聲科，西安 710032；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；*通訊作者，E-mail：13909232905@163.com)

孕早期流產(chǎn)物的高通量測序研究

乞艷華1，余珊珊1，李小鵬1，麻妙艷1，鄔晉芳2，周 琦1*，雷小瑩1

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院超聲科，西安 710032；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科；*通訊作者，E-mail：13909232905@163.com)

目的 探討高通量測序技術在孕早期流產(chǎn)物檢測中的應用價值。 方法 收集2014-02～2016-10在西安交通大學第二附屬醫(yī)院就診的胚胎停止發(fā)育孕婦45例。取流產(chǎn)物組織，進行高通量測序及染色體核型分析。 結果 共收集到有效樣本44例，高通量測序11例(25.00%)在檢測范圍內未檢出已知致病性染色體畸變；19例(43.18%)染色體數(shù)目異?；蚯逗象w；14例(31.82%)染色體部分片段拷貝缺失或呈多態(tài)性。核型分析12例(27.27%)染色體數(shù)目異?；蚯逗象w。 結論 高通量測序技術對流產(chǎn)物的檢出陽性率高于核型分析，尤其在染色體微缺失和微重復檢出上有明顯優(yōu)勢，可用于臨床上不明原因流產(chǎn)的病因學檢查。

高通量測序技術； 染色體核型分析； 流產(chǎn)

近年來，隨著國家計劃生育政策的調整以及人們生育觀念的轉變，高齡高危孕婦逐年增多。孕婦早期出血、胚胎停止發(fā)育者比例升高，引起了醫(yī)務工作者的注意。自然流產(chǎn)的病因復雜，包括胚胎染色體異常、孕婦內分泌失調、母胎血型不合、免疫因素、精神因素以及孕婦全身心疾病等都會導致流產(chǎn)的發(fā)生，其中胎兒染色體異常在早期流產(chǎn)中占據(jù)很大比例[1]。目前對染色體異常的檢測手段主要是核型分析，因受細胞培養(yǎng)及核型顯帶分辨率的影響，檢出率為5 Mb左右[2]。隨著高通量測序技術在產(chǎn)前診斷中的逐步應用，我們采用高通量測序技術檢測孕早期流產(chǎn)物，明確流產(chǎn)原因，為下次妊娠提供遺傳指導。

1 對象與方法

1.1 對象

2014-02～2016-10在西安交通大學第二附屬醫(yī)院就診的胚胎停止發(fā)育孕婦45例，孕婦年齡21-38歲，平均年齡30歲，孕周7-20周，平均孕周12周。45例孕婦均為自然受孕，26例為初次妊娠，19例為復發(fā)性妊娠，復發(fā)性流產(chǎn)中流產(chǎn)2次的共7例。

1.2 流產(chǎn)物測序及核型分析方法

取流產(chǎn)物10 mg，無菌PBS緩沖液沖洗，提取DNA，超聲波打斷使基因組DNA成小片段核酸。采用酶反應的方法，將打斷后的DNA小片段5′端突出末端補平或將3′端突出末端削平。T4 DNA連接酶將接頭連接在DNA片段兩端，瓊脂糖凝膠切膠回收合適范圍的片段。PCR擴增、純化，構建測序文庫。多個測序文庫index標記后測序，測序采用Hiseq2000高通量測序儀(美國Illumina公司)。對測得的序列片段與已知人類參考基因組比對(hgl9)進行數(shù)據(jù)分析。參照已發(fā)表研究中的Fused Lasso算法確定染色體片段的重復或缺失[3]。在全基因組水平篩選出待檢樣本的DNA重復或缺失區(qū)域，并將檢測數(shù)據(jù)與基因變異數(shù)據(jù)庫(database of genomic variants，DGV)、人類染色體變異數(shù)據(jù)庫(database of chromosomal imbalance and phenotype in humans using ensembl resources，DECIPHER)和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(online Mendelian inheritance in man，OMIM)進行匹配得出拷貝數(shù)變異的意義。

流產(chǎn)物核型分析：流產(chǎn)物采用常規(guī)消化法處理，5%CO2，37 ℃溫箱培養(yǎng)，收獲分離，滴片制片烤片，胰蛋白酶消化，吉姆薩染色，G顯帶，每例鏡下計數(shù)30個核型，分析5個核型，嵌合體加倍計數(shù)，必要時做C帶和N帶。G帶分辨率為320-400條帶。

2 結果

共計檢測45例流產(chǎn)物，其中1例因母源性污染被排除，因此有效樣本為44例，陽性結果見表1。

表1 流產(chǎn)物測序及核型分析結果

Table 1 The results of sequencing technology and karyotype analysis for the abortion

樣品編號核型分析結果高通量測序結果結果備注15SC3529未見異常13q31．1(83980001-84200000)×3?，重復片段大小為0．22Mb13號染色體長臂31．1區(qū)域重復，致病性未知15SC6202未見異常2p12，2p13．1(74920001-75240000)×3?，重復片段大小為0．32Mb2號染色體短臂12/13．1區(qū)域重復，致病性未知15SC3511未見異常4p11(48600001-49340000)×3?，重復片段大小為0．74Mb4號染色體短臂11區(qū)域重復，致病性未知15SC0189未見異常2p12(77320001-78140000)×3，重復片段大小為0．82Mb2號染色體短臂12區(qū)域重復，致病性未知15SC0721未見異常11q14．3(90020001-90160000)×1，缺失片段大小為0．14Mb11號染色體長臂14．3區(qū)域缺失，致病性未知15SC3521未見異常2p12(78640001-79940000)×3，重復片段大小為1．30Mb2號染色體短臂12區(qū)域重復，致病性未知16SC05685未見異常7q31．33處重復0．62Mb區(qū)域7號染色體長臂31．33區(qū)域重復，致病性未知16SC05745未見異常8p22-p21．3處重復0．62Mb區(qū)域8號染色體短臂22-21．3區(qū)域重復，致病性未知15SC6201未見異常7q34(138800001-159140000)×1?，缺失片段大小為20．34Mb；19q13．43(57960001-58500000)×3?，重復片段大小為0．54Mb7號染色體長臂34缺失區(qū)域，導致前腦無裂畸形、腎積水；19號染色體長臂13．43區(qū)域重，致病性未知15SC3525未見異常7q11．21(64680001-65180000)×1?，缺失片段大小為0．5Mb7號染色體長臂11．21區(qū)域缺失，致病性未知15SC3527未見異常14q11．2(19460001-20420000)×3，重復片段大小為0．96Mb14號染色體長臂11．2區(qū)域重復，致病性未知15SC0187未見異常20p12．3(8300001-12280000)×1，缺失片段大小為3．98Mb；20p12．1(13180001-14520000)×1，缺失片段大小為1．34Mb20號染色體短臂12．3區(qū)域缺失(與Alagillesyndrome相關，肝內膽管缺乏，膽汁郁積，心臟疾病，骨骼異常等)；20號染色體短臂12．1區(qū)域缺失，致病性未知

表1 流產(chǎn)物測序及核型分析結果 (續(xù)表)

Table 1 The results of sequencing technology and karyotype analysis for the abortion (continuing)

樣品編號核型分析結果高通量測序結果結果備注15SC1255未見異常8p23．3p21．1(160001-28480000)×1?，缺失片段大小為28．32Mb；8p21．1p12(28480001-31020000)×3?，重復片段大小為2．54Mb；12p11．1(34180001-34860000)×1?，缺失片段大小為0．68Mb8號染色體短臂28．32Mb的拷貝數(shù)缺失(表征：出生后生長遲緩，頭小畸形，智力障礙，特殊面容，先天性心臟缺損等)；8號染色體短臂2．54Mb拷貝數(shù)重復(致病性未知)；12號染色體短臂0．68Mb的拷貝數(shù)缺失(致病性未知)16SC05757未見異常22號染色體q13．31-13．33處缺失3．1Mb覆蓋了22q13deletionsyndrome(phelan-Mcdermidsyndrome)約90%的區(qū)域，包含關鍵基因SHANK3、ARSA，自閉癥，語言發(fā)育遲緩，智力障礙，張力減退，行為異常等15SC352316SC0569247，XN，+1647，XN，+1647，XN，+1647，XN，+16習慣性流產(chǎn)最為常見的一種，常表現(xiàn)為胎兒宮內生長受限以及先天性心臟缺陷。嵌合比例越高，異常表型越明顯16SC0623147，XN，+1647，XN，+1615SC3515未見異常47，XN，+16[75%]/46，XN[25%]15SC3520培養(yǎng)失敗48，XN，+7，+10[30%]/46，XN[70%]7號染色體三體：宮內生長受限，小頭畸形，皮膚色素改變，面部不對稱；10號染色體三體在孕早期流產(chǎn)，多有耳部畸形，唇腭裂，眼睛、心臟、腎臟和手足畸形16SC05682培養(yǎng)失敗48XN，+2，+13。該樣本為2號染色體三體，同時也為13號染色體三體2號染色體三體：胎兒宮內生長受限，室間隔缺損，面部畸形，胚胎早期停育等；13號染色體三體：發(fā)育遲緩，智力障礙，小眼畸形，腭裂，唇裂，隱睪癥，多指趾畸形，顱面部異常，大腦發(fā)育不全，腎臟畸形，心臟結構缺陷，胚胎早期停育16SC01328培養(yǎng)失敗49，XN，+13，+14，+21。該樣本為13號染色體三體，14號染色體三體，21號染色體三體14號染色體三體：宮內生長受限，精神運動發(fā)育遲緩，智力低下，頭面部異常以及心臟結構畸形；21號染色體三體表現(xiàn)：智力低下，特殊面容，心臟，胃腸道等畸形15SC351615SC019016SC0276215SC409916SC0568769，X1NN69，XNN69，XNN69，XNN未見異常69，XNN69，XNN69，XNN69，XNN69，XNN常在孕早期出現(xiàn)流產(chǎn)，表現(xiàn)：先天性心臟缺陷，生殖器畸形(男性)，腦部發(fā)育異常等15SC352245，X45，X特納綜合征(Turnersyndrome)，表現(xiàn)：身材矮小，性腺發(fā)育不良16SC0575545，X45，X16SC05760培養(yǎng)失敗21X21號染色體單體：先天性多重畸形(骨骼、心臟、眼部、肺部、腎部及泌尿系統(tǒng))，胚胎早期停育15SC125316SC0569116SC0568347，XN，+2247，XN，+2247，XXY，+22[60%]/46，XN[40%]47，XN，+2247，XN，+22該樣本為47，XN，+22[65%]/46，XN[35%]的嵌合體22號染色體三體：是第三大非整倍體致自然流產(chǎn)的原因，小頭畸形，顱骨異常，先天性心臟病，腎臟畸形，胎兒宮內發(fā)育遲緩嵌合比例越高，異常表型越明顯15SC1252培養(yǎng)失敗70，XNN，+20三整倍體綜合征，孕早期出現(xiàn)流產(chǎn)，先天性心臟缺陷，生殖器畸形(男性)以及腦部發(fā)育異常等

高通量測序結果：11例在檢測范圍內未檢出已知致病性染色體畸變(見圖1A)，陰性率為25.00%(11/44)。19例染色體數(shù)目異?；蚯逗象w，占比43.18%(19/44)，其中5例69XNN(樣本編號15SC3516，15SC0190，16SC02762，15SC4099，16SC05687)、3例16-三體(樣本編號15SC3523，16SC05692，16SC06231)、2例22-三體(15SC1253，16SC05691)、2例45X(樣本編號15SC3522，16SC05755)、1例70XNN(樣本編號15SC1252)、1例21單體(樣本編號16SC05760)、2例多條染色體異常(樣本編號16SC05682，16SC01328)，3例多條染色體嵌合體(樣本編號15SC3515，15SC3520，16SC05683)(見圖1B，16-三體；圖1C,69，XNN)。14例檢測結果中存在染色體部分片段拷貝缺失或呈多態(tài)性，占比31.82%(14/44)(見圖1D)。

核型分析結果：5例培養(yǎng)失敗，27例未見異常，12例染色體數(shù)目異?；蚯逗象w(27.27%，12/44)。

A．流產(chǎn)物測序陰性結果B．流產(chǎn)物(16-三體)測序結果C．流產(chǎn)物(69，XNN)測序D．流產(chǎn)物(7號染色體部分缺失，19號染色體部分重復)測序

1-22號染色體用環(huán)形圖表示，內圈紅色表示該區(qū)域存在缺失，綠色表示該區(qū)域存在重復

圖1 不同流產(chǎn)物測序結果

Figure 1 The sequencing results of the abortion tissues

3 討論

在人類妊娠過程中，自然流產(chǎn)已成為一種非常重要的優(yōu)勝劣汰法則。據(jù)資料統(tǒng)計，孕早期自然流產(chǎn)發(fā)生率占10%-15%，對患者產(chǎn)生較大的心理負擔。造成流產(chǎn)的病因非常復雜，如遺傳、免疫、解剖、內分泌、感染、環(huán)境及其他未知因素等，而遺傳因素對自然流產(chǎn)發(fā)生的影響更加突出，占50%-60%，其中染色體的異常最為常見[1]。

染色體異常的檢測手段隨著近年來生物檢測技術的發(fā)展而更加豐富多樣，如熒光原位雜交技術(FISH)、多重探針擴增技術(MLPA)、基因芯片法(arrayCGH、SNParray)等，這些技術雖能將檢出率提高一些，但是受限于技術原理，只能檢測到芯片探針覆蓋的染色體區(qū)域，這就限制了發(fā)現(xiàn)新的染色體畸變，因而限制了其臨床廣泛應用。高通量測序技術明顯優(yōu)于其他技術[4]，可以覆蓋46條染色體非整倍體以及大于100 kb的染色體拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNVs)，由于是全基因組均勻覆蓋，因此能發(fā)現(xiàn)芯片平臺未覆蓋到的CNVs[5]，進而發(fā)現(xiàn)新的染色體疾病，且還能檢出5%以上的嵌合體[6,7]。因此與其他技術相比更適用于臨床應用，有學者嘗試了羊水中游離胎兒DNA的測序，取得了較為理想的結果[8]。

我們用高通量測序及核型分析檢測了45例自然流產(chǎn)的絨毛組織，有效樣本44例。高通量測序共計檢出33例(75%)染色體異常，其中19例為染色體數(shù)目異常或嵌合體，占比43.18%，5例69XNN、3例16-三體、2例22-三體、2例45X、1例70XNN、1例21單體、2例多條染色體異常，3例多條染色體嵌合體。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與早期流產(chǎn)密切相關的染色體異常為69XNN，16-三體及其嵌合體，22-三體等，未見集中在13號、18號、21號上，所以臨床上曾經(jīng)選用FISH做流產(chǎn)物分析，因探針受限，常選擇13號、18號、21號、X、Y染色體探針進行流產(chǎn)物分析意義不大，檢出率低[9]。核型分析僅發(fā)現(xiàn)12例(27.27%)染色體異常，檢出率明顯低于高通量測序。高通量測序檢測出14例存在染色體部分片段拷貝缺失或呈多態(tài)性，占比31.82%，染色體的部分片段拷貝缺失或多態(tài)性，可能影響胚胎早期發(fā)育，但是其致病性未知，這一部分是需要更進一步研究改變和致病性間的關系。本研究結果與其他學者報道相一致[10]。2014年Liang等[11]研究發(fā)現(xiàn)從疑難家系揭示CNVs與疾病之間的關系，當CNVs缺失未達到一定的劑量時，相應缺失部分的基因補代償，疾病不表現(xiàn)，當缺失到達一定劑量，相應缺失部分的基因無法補償時產(chǎn)生臨床表現(xiàn)。

本研究中的高通量測序方法是單端測序，尚不能解決易位、倒位問題。隨著雙端測序，環(huán)形測序、單細胞測序，到文庫構建中優(yōu)化后的CSMART(循環(huán)單分子擴張和重測序技術)、Meta pair(雙端末端配對測序)等方法的發(fā)展，解決易位、倒位、嵌合、微缺失、微重復、單基因、單親二倍體等都會成為現(xiàn)實。最新研究結果顯示，CSMART方法[12]已經(jīng)成功產(chǎn)前無創(chuàng)診斷了Wilson單基因疾病，同樣也可應用于檢測其他單堿基變異、微缺失或插入等致病突變，而且還能運用于腫瘤早期診斷，定量血液中低水平的腫瘤特異性循環(huán)DNA和檢測患者對治療的反應。

綜上所述，高通量測序技術對流產(chǎn)物的檢出陽性率高于核型分析，尤其在染色體微缺失微重復檢出上有明顯優(yōu)勢，可用于臨床上不明原因流產(chǎn)的病因學檢查。胚胎早期停止發(fā)育絕大多數(shù)是由胚胎染色體異常導致的。隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展，流產(chǎn)物測序所能帶給人們的遺傳信息也會更加豐富，進一步后續(xù)研究缺失與致病性的關系顯得更為重要，這將為孕婦遺傳學咨詢開辟新的前景。

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Application of high-throughput sequencing technology for analying the abortion of the early pregnancy

QI Yanhua1,YU Shanshan1,LI Xiaopeng1,MA Miaoyan1,WU Jinfang2,ZHOU Qi1*,LEI Xiaoying1

(1DepartmentofUltrasound,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：13909232905@163.com)

ObjectiveTo explore the value of high-throughput sequencing technique in detection of the abortion of the early pregnancy.MethodsForty-five cases of abortion tissue from Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University from February 2014 to October 2016 were selected.The tissues of abortion were collected to perform high-throughput sequencing technology and chromosomal karyotypes analysis.ResultsA total of 44 cases of effective samples were collected.The results of high-throughput sequencing technology showed that 11 cases(25.00%)were not found the known pathogenic chromosome aberration in the test range,and there were 19 cases(43.18%)of abnormal chromosome number or chimera and 14 cases(31.82%)of chromosome fragment copies part missing or polymorphism.Twelve cases(27.27%)of abnormal chromosome number or chimera were found by chromosomal karyotypes analysis.ConclusionThe positive rate of abortion tissue by high-throughput sequencing technology is higher than that of chromosomal karyotype analysis,especially in chromosome micro-deletion and micro-duplication.High-throughput sequencing technology is recommended to be applied to clinical diagnosis of unknown reason abortion.

high-throughput sequencing technology； chromosome karyotype analysis； abortion

陜西省社會發(fā)展科技攻關項目(2015SF126，2016SF014)

乞艷華，女，1981-10生，在讀博士，主治醫(yī)師，E-mail：18991188001@189.cn

2016-12-12

R741.21

A

1007-6611(2017)03-0271-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.016