鄧 涵，祖琴琴，朱杰瑞，楊安樹，陳紅兵

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

超聲處理對大豆7S蛋白潛在致敏性的影響

鄧 涵，祖琴琴，朱杰瑞，楊安樹*，陳紅兵

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

利用超聲波改性處理大豆7S蛋白，并評估超聲處理產(chǎn)物體外消化性及消化產(chǎn)物抗原性和潛在致敏性的變化。結(jié)果表明，7S蛋白耐唾液、胃液消化，但其在300 W超聲處理80 min后易被十二指腸消化；進(jìn)一步利用體外免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G結(jié)合能力評估消化產(chǎn)物抗原性的強(qiáng)弱，超聲處理7S蛋白后，隨著超聲處理時(shí)間（0～120 min）的延長，其消化產(chǎn)物的抗原性總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在超聲100 min時(shí)，消化產(chǎn)物的抗原性最低；利用體外IgE結(jié)合能力評估其潛在致敏性，隨超聲處理時(shí)間（0～120 min）的延長，大豆7S蛋白消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，超聲80 min時(shí)，其消化產(chǎn)物IgE結(jié)合能力最低。研究結(jié)果表明超聲

大豆7S蛋白；超聲；體外消化性；抗原性；潛在致敏性

大豆是一種營養(yǎng)豐富的食用蛋白資源。在亞洲，大豆制品消費(fèi)已有上千年的歷史，并且一直深受廣大消費(fèi)者的青睞[1-2]。然而，作為8大類過敏食物之一，大豆制品對于大豆過敏人群存在著潛在的危險(xiǎn)[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，90%的大豆過敏是由免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）E介導(dǎo)，可引發(fā)產(chǎn)生過敏性皮炎、胃腸道紊亂等一系列的癥狀[4-5]。大豆過敏患者約占食品過敏總?cè)藬?shù)的25%[6]。迄今為止，大豆過敏尚無特效療法。因此，為了減少大豆過敏的危害，利用食品加工方法開發(fā)低致敏或脫敏的大豆制品刻不容緩[7]。大豆含有35%～40%蛋白質(zhì)，按照沉降模式，可分為2S、7S、11S和15S 4 個(gè)主要組分[8]。在已發(fā)現(xiàn)的38 種大豆過敏原中，Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和β-伴大豆球蛋白中的Gly m Bd 60K被認(rèn)為是3 種主要的大豆過敏原，且都存在于大豆7S蛋白中[9]。因此，研究大豆7S蛋白的致敏性控制具有非常重要的意義。

高強(qiáng)度超聲波是指機(jī)械振蕩頻率達(dá)到20～100 kHz的聲波，其作為一種高效的食品加工技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中。由于超聲波的空化和直進(jìn)流作用會(huì)使能量高度聚集，產(chǎn)生一系列高溫、高壓的物理效應(yīng)，可導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[10]。有研究表明，超聲處理能使食物過敏原結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變[11]。如利用超聲處理蝦過敏原提取物，再通過蝦過敏患者的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：一定條件下超聲處理能夠降低蝦過敏原蛋白的免疫活性，這可能是由于超聲波破壞了蝦過敏原的IgE識別位點(diǎn)[12]。也有研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，超聲處理可使大豆7S蛋白一級結(jié)構(gòu)因蛋白聚合發(fā)生變化，這些聚合物的形成可能掩蓋抗原表位，進(jìn)而使大豆的致敏性發(fā)生變化。目前國內(nèi)外借助超聲波加工降低大豆致敏性的研究很少，鑒于超聲處理在降低其他食物過敏性方面有一定成效，所以期待其可以成功應(yīng)用于生產(chǎn)低致敏豆制品。

基于南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對超聲強(qiáng)度對大豆蛋白影響的研究，首先將大豆7S蛋白經(jīng)不同時(shí)間超聲處理（40 kHz、300 W）[15]。然后經(jīng)體外模擬唾液、胃液和十二指腸液消化，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、Tricine-SDS-PAGE方法分析超聲處理對大豆7S蛋白消化性的影響，并采用體外IgG、IgE的結(jié)合能力評估消化產(chǎn)物的抗原性和潛在致敏性，研究旨在探討利用超聲處理降低大豆致敏性的現(xiàn)實(shí)意義，為生產(chǎn)低過敏大豆食品提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東農(nóng)42大豆 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)；β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品、Acr/Bis溶液、過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、預(yù)染Marker、低分子質(zhì)量蛋白Marker 上海生工公司；甲叉丙烯酰胺-三羥甲基氨基甲烷（Bis-Tris）、甘氨脫氧膽酸鈉、牛膽酸鈉胰蛋白酶、卵磷脂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、兔抗大豆蛋白血清、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SB-5200DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PB-10型酸度計(jì) 德國Sartorius公司；Allegra 64 R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；Power Pac 3000迷你型蛋白電泳儀、Model 1860酶聯(lián)免疫檢測儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；ImmunoCAP 100熒光免疫分析儀 瑞典法瑪西亞公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆7S蛋白的提取

為減輕因研磨發(fā)熱引起的大豆蛋白空間改變，稱取一定質(zhì)量大豆在液氮下進(jìn)行研磨，以料液比1∶15（m/V）加入正己烷進(jìn)行脫脂、風(fēng)干，即得脫脂豆粉。大豆7S蛋白提取方法參照文獻(xiàn)[16-17]進(jìn)行，所得蛋白在經(jīng)透析后置于－20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大豆7S蛋白質(zhì)量濃度的測定

以BSA制標(biāo)準(zhǔn)曲線用Bradford[18]法測定，紫外分光光度計(jì)595 nm波長處測其吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用50 mmol/L Tris溶解大豆7S蛋白，混勻，離心（8 000 r/min、4 ℃、30 min）取上清液。將樣品質(zhì)量濃度稀釋到BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，取2.5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液與0.5 mL待測樣品混勻，室溫條件下靜置3 min后測定吸光度，根據(jù)待測蛋白的稀釋倍數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

1.3.3 超聲處理

稀釋大豆7S蛋白至質(zhì)量濃度為6 mg/mL，將其置于超聲裝置中40 kHz、300 W強(qiáng)度下分別處理0、20、40、60、80、100、120 min，處理后置于－20 ℃條件下凍存。

1.3.4 體外模擬消化

參照Amigo-Benavent等[19]的方法并略有調(diào)整。

1.3.4.1 模擬唾液消化

取1 mL超聲處理后7S蛋白置于37 ℃水浴中，先加入1 mL唾液緩沖液反應(yīng)15 min，再加入2.5 mL α-淀粉酶溶液（150 U）反應(yīng)2 min，用1 mol/L HCl調(diào)pH值至3.5終止反應(yīng)。

1.3.4.2 模擬胃液消化

取1 mL上述唾液消化產(chǎn)物置于37 ℃水浴中，與0.5 mL胃蛋白酶液，250 μL卵磷脂和250 μL NaCl（35 mmol/L，pH 2.0）反應(yīng)60 min，用1 mol/L NaHCO3調(diào)pH值至7.0以終止反應(yīng)。

1.3.4.3 模擬十二指腸液消化

取2 mL上述胃消化產(chǎn)物，與0.25 mol/L Bis-Tris（pH 6.5）、1 mol/L CaCl2、0.250 mol/L膽鹽混合，置于37 ℃水浴中預(yù)熱15 min后，加入0.5 mL胰蛋白酶、6 μL α-糜蛋白酶和2.784 mL超純水反應(yīng)60 min后，再置于85 ℃水浴鍋中滅酶處理5 min。

1.3.5 SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE

選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%分離膠、4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE，檢測大豆7S蛋白經(jīng)超聲處理以及體外消化后分子質(zhì)量的變化。選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%濃縮膠、10%夾層膠和16.5%致密膠進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE，分析消化產(chǎn)物中小分子蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。濃縮膠恒流6 mA，分離膠電流調(diào)至12 mA，直至溴酚藍(lán)指示劑涌動(dòng)至分離膠底部，電泳結(jié)束。

1.3.6 游離巰基含量分析

采用Ellman[20]的方法：取不同超聲時(shí)間處理的大豆7S蛋白溶于pH 8.0的緩沖液中（0.086 mol/L Tris-0.09 mol/L甘氨酸-4 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）），使其蛋白終質(zhì)量濃度為2 mg/mL。向3 mL蛋白液中加入0.03 mL埃爾曼試劑，兩者迅速混合，在20 ℃避光條件下靜置反應(yīng)15 min，在紫外分光光度計(jì)412 nm波長處讀取吸光度，設(shè)置3 組平行。游離巰基的含量通過所測吸光度與摩爾消光系數(shù)13 600 L/mol的比值計(jì)算得出，單位為μmol/g。

1.3.7 體外IgG結(jié)合能力的評估

用方正滴定法確定最佳包被蛋白質(zhì)量濃度和一抗稀釋倍數(shù)[21]。采用競爭抑制酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法測定IgG結(jié)合能力來評估消化產(chǎn)物抗原性的強(qiáng)弱。具體操作步驟如下：酶標(biāo)板每孔加入最佳包被蛋白質(zhì)量濃度的包被液，4 ℃條件下過夜。次日加入磷酸鹽吐溫（PBST）緩沖液洗3 次后，加入250 μL 1%的明膠在37 ℃條件下封阻1 h，洗滌3 次，置于4 ℃?zhèn)溆?。取另一塊酶標(biāo)板，明膠封阻1 h，洗滌3 次后，加入體積比1∶1的不同質(zhì)量濃度梯度的競爭抗原（不同超聲處理時(shí)間的大豆7S蛋白）和一抗（兔抗大豆蛋白血清），37 ℃條件下溫育1 h。從該板每孔中吸取100 μL轉(zhuǎn)移至第一塊板內(nèi)，37 ℃條件下溫育1 h，洗滌3 次。加入羊抗兔HRP酶標(biāo)二抗（1∶5 000），37 ℃條件下溫育1 h，加入100 μL OPD顯色底物，避光反應(yīng)15 min后加入50 μL H2SO4溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀490 nm波長處測光密度值。按式（1）計(jì)算IgG抑制率。

式中：B為不同超聲時(shí)間下競爭蛋白的OD值；B0為無競爭蛋白時(shí)的OD值。

1.3.8 體外IgE結(jié)合能力的評估

利用ImmunoCAP 100熒光免疫分析儀篩選大豆過敏血清，以過敏患者血清作為一抗，構(gòu)建血清池。實(shí)驗(yàn)中的7 位大豆過敏患者信息見表1。

表 1 大豆過敏患者信息Table 1 Information about the patients with soybean allergy

具體方法與1.3.7節(jié)相似，部分稍作如下改變：包被未加工的7S蛋白和加工后的競爭蛋白質(zhì)量濃度為15 μg/mL；一抗使用1∶15稀釋的過敏患者人血清，與超聲處理后的7S蛋白37 ℃溫育1 h；二抗使用1∶5 000稀釋的生物素標(biāo)記的IgE二抗，37 ℃溫育2 h，洗板結(jié)束后每孔加入100 μL 1∶60稀釋的HRP-鏈霉素標(biāo)記的親和素，37 ℃溫育1 h。按式（2）計(jì)算IgE抑制率。

式中：B為不同超聲時(shí)間下競爭蛋白的OD值；B0為無競爭蛋白時(shí)的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)分析采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件。統(tǒng)計(jì)顯著性分析用單因素方差分析，以P＜0.05表明具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆7S蛋白質(zhì)量濃度的確定

采用Bradford法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性回歸方程：y＝0.002 2x＋0.001 9（R2＝0.999 2），測得7S蛋白質(zhì)量濃度為25.10 mg/mL。

2.2 超聲處理大豆7S蛋白的電泳圖

圖 1 超聲處理7S蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of 7S globulin subjected to ultrasonic treatment

由圖1可以看出，超聲處理前后大豆7S蛋白電泳條帶的組成與灰度并未發(fā)生顯著變化，且隨著超聲時(shí)間的延長，SDS-PAGE顯示的超聲處理后大豆7S蛋白條帶和灰度與未處理加工的大豆7S蛋白幾乎一致，表明大豆7S蛋白超聲處理后，其分子質(zhì)量并未發(fā)生顯著變化，這與Karki等[22]的研究結(jié)果相似。

圖 2 超聲處理對大豆7S蛋白游離巰基的影響Fig. 2 Free -SH content in soybean 7S protein subjected to ultrasonic treatment

2.3 超聲處理前后大豆7S蛋白游離巰基變化游離巰基含量變化可反映蛋白的變性程度，且對蛋白的功能性質(zhì)有關(guān)鍵的影響[23]。經(jīng)過不同時(shí)間超聲處理的大豆7S蛋白游離巰基的變化如圖2所示。隨著超聲處理時(shí)間的延長，游離巰基含量變化趨勢為先增加后減少。超聲0～80 min時(shí)，游離巰基含量增加，這可能是由于超聲處理產(chǎn)生的空穴現(xiàn)象下的紊流、高壓和剪切力的作用使掩埋的巰基暴露，或空穴作用破壞了蛋白分子中的二硫鍵，從而產(chǎn)生了新的游離巰基[11]。80 min時(shí)，巰基含量達(dá)到最高值，蛋白質(zhì)破壞程度達(dá)到最大。超聲時(shí)間超過80 min時(shí)，巰基含量反而呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于在高密度超聲處理形成的空穴作用中產(chǎn)生了瞬態(tài)自由基（?OH、H?），這些自由基經(jīng)交叉反應(yīng)又產(chǎn)生氫過氧化物，氫過氧化物進(jìn)一步氧化巰基，形成新的二硫鍵，該變化可導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊[24]。

2.4 體外模擬消化

2.4.1 模擬唾液和胃液消化

圖 3 超聲處理7S蛋白經(jīng)體外模擬唾液（A）和胃液（B）消化后電泳圖Fig. 3 Effect of ultrasonic treatment on salivary (A) and gastric (B) digestion of 7S globulin

如圖3A和3B所示，與未超聲的大豆7S蛋白比較，不同超聲時(shí)間處理后的7S蛋白經(jīng)唾液和胃液消化后蛋白分子質(zhì)量并未發(fā)生明顯變化，同時(shí)，其條帶灰度也與未處理蛋白基本保持一致。結(jié)果表明：超聲處理對大豆7S蛋白在唾液和胃液中消化性的影響沒有顯著差異。Bowman等[25]指出食物中致敏強(qiáng)的過敏原一般具有抗消化性。本研究電泳結(jié)果也表明在口腔和胃消化階段，7S蛋白作為一種強(qiáng)致敏性的過敏原，具有較強(qiáng)的耐唾液和胃液消化性。

2.4.2 模擬十二指腸液消化

圖 4 超聲處理7S蛋白腸消化產(chǎn)物的SDS-PAGE（A）和Tricine-SDSPAGE（B）圖Fig. 4 SDS-PAGE (A) and Tricine-SDS-PAGE (B) patterns of intestinal digestion products of 7S globulin subjected to ultrasonic treatment

如圖4所示，未加工和不同時(shí)間超聲處理的大豆7S蛋白經(jīng)十二指腸液中消化后，其蛋白條帶發(fā)生顯著變化，產(chǎn)生一些分子質(zhì)量＜26 kD的小分子片段；同時(shí)，蛋白灰度減弱，即消化后殘留的蛋白量呈現(xiàn)降低趨勢，且在超聲80 min時(shí)，大豆7S蛋白條帶的灰度達(dá)到最弱。結(jié)果表明超聲處理的大豆7S蛋白易被十二指腸消化，超聲處理80 min時(shí)最易被消化，可能是由于此時(shí)超聲處理后的蛋白質(zhì)破壞程度達(dá)到最大，因此，最易被十二指腸液消化，這可從上述游離巰基結(jié)果得到證明。

2.5 超聲處理大豆7S蛋白的消化產(chǎn)物與IgG結(jié)合能力

過敏原的抗原決定簇在經(jīng)消化道進(jìn)入免疫系統(tǒng)前只有保持足夠完整又有免疫原性的蛋白或蛋白片段才具有潛在致敏的可能[26]。在利用間接競爭ELISA評估抗原性實(shí)驗(yàn)中，常用使IgG的抑制率達(dá)到50%時(shí)對應(yīng)的競爭抗原的濃度即半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值來表征IgG結(jié)合能力進(jìn)而表征抗原性的強(qiáng)弱，IC50值越大，達(dá)到半抑制率所需競爭抗原濃度越高，即抗原性越弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，IC50值均大于0，超聲處理（0～120 min）后的7S蛋白消化產(chǎn)物具有免疫原性。隨著超聲處理時(shí)間的延長，大豆7S蛋白的抗原性總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且80 min時(shí)IC50值達(dá)到最小，約為5 μg/mL，此時(shí)7S蛋白的抗原性達(dá)到最高。

圖 5 超聲處理7S蛋白消化產(chǎn)物的IgG結(jié)合能力Fig. 5 IgG-binding capacity of digestion products of 7S globulin subjected to ultrasonic treatment

2.6 超聲處理大豆7S蛋白的消化產(chǎn)物與IgE結(jié)合能力

通過比較不同時(shí)間超聲處理后消化產(chǎn)物所對應(yīng)的IgE抑制率來評估7S蛋白的潛在致敏性。抑制率越低，競爭抗原與過敏患者人血清的結(jié)合能力越弱，即潛在致敏性越低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，隨著7S蛋白超聲處理時(shí)間的延長，其小腸消化產(chǎn)物的IgE抑制率總體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與未超聲處理（對照組）相比，分別經(jīng)超聲處理20、40 min后，7S蛋白腸消化產(chǎn)物的IgE抑制率有顯著差異（P＜0.05），40 min時(shí)，其潛在致敏性最高；延長超聲時(shí)間，7S蛋白消化產(chǎn)物的IgE抑制率呈下降趨勢，與超聲處理40 min的樣品相比，超聲處理80 min后，其消化產(chǎn)物的IgE抑制率有極顯著差異（P＜0.01），此時(shí)，IgE抑制率達(dá)到了最低。這可能與經(jīng)80 min超聲作用后，大豆7S蛋白最易被十二指腸消化，導(dǎo)致其過敏原結(jié)構(gòu)上的改變有關(guān)。

圖 6 超聲處理7S蛋白消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力Fig. 6 IgE-binding capacity of digestion products of 7S globulin subjected to ultrasonic treatment

3 討論與結(jié)論

超聲已被廣泛應(yīng)用于食品加工中，但在食物過敏方面的研究卻很少。Li Zhenxin等[12]利用超聲波較全面地分析了其對蝦的過敏原的影響，并取得較好的效果。Kasera[14]、Gulseren[24]等的研究結(jié)果都表明超聲會(huì)影響蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，而食物過敏原大部分是蛋白質(zhì)，因此通過超聲處理改變過敏原結(jié)構(gòu)，進(jìn)而引起其致敏性變化的方法具有可行性。本研究首先對大豆致敏原7S蛋白進(jìn)行不同時(shí)間的超聲處理，測定其表面游離巰基含量的變化來分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的改變，然后模擬人體胃腸消化，分析其消化產(chǎn)物致敏性的變化。

隨著超聲時(shí)間的延長，游離巰基的含量先升高又降低，可能是超聲處理使7S蛋白結(jié)構(gòu)展開，部分二硫鍵斷裂，形成新的巰基，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，巰基重新締合形成二硫鍵，過敏蛋白發(fā)生進(jìn)一步折疊，從而對某些過敏表位產(chǎn)生影響，這和孫英杰[27]的研究結(jié)果一致。國內(nèi)外許多文獻(xiàn)采用體外模擬胃腸液消化過敏原，并分析其消化產(chǎn)物的抗原性與致敏性變化，該方法被普遍認(rèn)為是體外評估過敏原致敏性的一個(gè)重要手段[28]，研究結(jié)果顯示：超聲處理對大豆7S蛋白在唾液和胃液中消化的影響不顯著，但在十二指腸消化中，經(jīng)超聲處理后的蛋白可以被消化成小分子物質(zhì)。在80 min時(shí)，7S蛋白消化產(chǎn)物的條帶和灰度發(fā)生顯著變化，消化程度最為顯著，這可能是因?yàn)榇藭r(shí)過敏原蛋白的三級結(jié)構(gòu)展開程度最大，使更多的水解位點(diǎn)暴露在分子表面，促進(jìn)亞基與水解酶充分接觸。大豆過敏是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)[5]，而致敏原要保持完整的抗原決定簇才有致敏的可能性。從抗原性與致敏性的結(jié)果可以看出，不同超聲時(shí)間處理7S蛋白消化產(chǎn)物都存在潛在致敏性，在超聲處理時(shí)間40 min時(shí)，7S蛋白的抗原性、致敏性增強(qiáng)到最高點(diǎn)，可能與超聲處理使過敏蛋白結(jié)構(gòu)展開，暴露出更多IgE結(jié)合表位有關(guān)；隨著超聲時(shí)間的繼續(xù)延長，7S蛋白的致敏性反而降低，在80 min時(shí)致敏性顯著降低，這可能是由于超聲處理時(shí)間的延長，使過敏蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊，從而掩埋了某些表位。過敏反應(yīng)是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，超聲處理引起過敏原致敏性變化的機(jī)制還有待深入的研究。

本實(shí)驗(yàn)利用不同時(shí)間的超聲處理對大豆7S蛋白的潛在致敏性進(jìn)行研究，7S蛋白經(jīng)過40 kHz、300 W超聲強(qiáng)度加工處理80 min時(shí)，其三級結(jié)構(gòu)破壞程度最大，也更易被十二指腸消化，且消化產(chǎn)物的潛在致敏性降至最低。

[1] YANG A, YU X W, ZHENG A, et al. Rebalance between 7S and 11S globulins in soybean seeds of differing protein content and 11SA4[J]. Food Chemistry, 2016, 210: 148-155. DOI:10.1016/ j.foodchem.2016.04.095.

[2] NISHINARI K, FANG Y, GUO S, et al. Soy proteins: a review on composition, aggregation and emulsif i cation[J]. Food Hydrocolloids, 2014, 39: 301-318. DOI:10.1016/j.foodhyd.2014.01.013.

[3] VERMA A K, KUMAR S, DAS M, et al. A comprehensive review of legume allergy[J]. Clinical Reviews in Allergy & Immunology, 2013, 45(1): 30-46. DOI:10.1007/s12016-012-8310-6.

[4] 田斌強(qiáng), 鄧乾春, 謝筆鈞, 等. 食物過敏原與過敏性消除方法[J]. 食品科技, 2007, 32(11): 9-13. DOI:10.3969/j.issn.1005-9989.2007.11.003.

[5] WANG T, QIN G X, SUN Z W, et al. Advances of research on glycinin and β-conglycinin: a review of two major soybean allergenic proteins[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2014, 54(7): 850-862. DOI:10.1080/10408398.2011.613534.

[6] KLEINE-TEBBE J, WANGORSCH A, VOGEL L, et al. Severe oral allergy syndrome and anaphylactic reactions caused by a Bet v 1- related PR-10 protein in soybean, SAM22[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2002, 110(5): 797-804. DOI:10.1067/ mai.2002.128946.

[7] 楊慧, 陳紅兵, 程偉, 等. 大豆主要過敏原及其脫敏方法的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2011, 32(21): 273-277. DOI:10.1067/mai.2002.128946.

[8] L’HOCINE L, BOYE J I. Allergenicity of soybean: new developments in identification of allergenic proteins, crossreactivities and hypoallergenization technologies[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2007, 47(2): 127-143. DOI:10.1080/10408390600626487.

[9] WU Y M, GUAN R X, LIU Z X, et al. Synthesis and degradation of the major allergens in developing and germinating soybean seed[J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2012, 54(1): 4-14. DOI:10.1111/ j.1744-7909.2011.01092.x.

[10] SHRIVER S K, YANG W W. Thermal and nonthermal methods for food allergen control[J]. Food Engineering Reviews, 2011, 3(1): 26-43. DOI:10.1007/s12393-011-9033-9.

[11] 郭孝武, 馮岳松. 超聲提取分離[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 10-25.

[12] LI Z X, LIN H, CAO L M, et al. Effect of high intensity ultrasound on the allergenicity of shrimp[J]. Journal of Zhejiang University Science B, 2006, 7(4): 251-256. DOI:10.1631/jzus.2006.B0251.

[13] 祖琴琴, 華萍, 龔育清, 等. 基于食品物理加工技術(shù)對大豆過敏原的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(5): 360-364. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2014.05.064.

[14] KASERA R, SINGH A B, KUMAR R, et al. Effect of thermal processing and γ-irradiation on allergenicity of legume proteins[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(10): 3456-3461. DOI:10.1016/j.fct.2012.07.031.

[15] YANG H, GAO J Y, YANG A S, et al. The ultrasound-treated soybean seeds improve edibility and nutritional quality of soybean sprouts[J]. Food Research International, 2015, 77: 704-710. DOI:10.1016/ j.foodres.2015.01.011.

[16] LIU C, WANG H L, CUI Z M, et al. Optimization of extraction and isolation for 11S and 7S globulins of soybean seed storage protein[J]. Food Chemistry, 2007, 102(4): 1310-1316. DOI:10.1016/ j.foodchem.2006.07.017.

[17] NAGANO T, HIROTSUKA M, MORI H, et al. Dynamic viscoelastic study on the gelation of 7S globulin from soybeans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(6): 941-944. DOI:10.1021/ jf00018a004.

[18] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254. DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3.

[19] AMIGO-BENAVENT M, CLEMENTE A, FERRANTI P, et al. Digestibility and immunoreactivity of soybean β-conglycinin and its deglycosylated form[J]. Food Chemistry, 2011, 129(4): 1598-1605. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.06.015.

[20] ELLMAN G L. Tissue sulfhydryl groups[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82(1): 70-77. DOI:10.1016/0003-9861(59)90090-6.

[21] 袁水林, 熊鼎, 陳紅兵, 等. 間接競爭 ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準(zhǔn)確性評價(jià)[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(18): 100-104. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201418020.

[22] KARKI B, LAMSAL B P, GREWELL D, et al. Functional properties of soy protein isolates produced from ultrasonicated defatted soy fl akes[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 2009, 86(10): 1021-1028. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201418020.

[23] 涂宗財(cái), 張雪春, 劉成梅, 等. 超高壓微射流對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2008, 24(9): 306-308.

[24] GULSEREN I, GUZEY D, BRUCE B D, et al. Structural and functional changes in ultrasonicated bovine serum albumin solutions[J]. Ultrason Sonochem, 2007, 14(2): 173-183. DOI:10.1016/ j.ultsonch.2005.07.006.

[25] BOWMAN C C, SELGRADE M K. Differences in allergenic potential of food extracts following oral exposure in mice reflect differences in digestibility: potential approaches to safety assessment[J]. Toxicological Sciences, 2008, 102(1): 100-109. DOI:10.1093/toxsci/ kfm288.

[26] 王翠燕, 孫璐, 周催, 等. BALB/c小鼠動(dòng)物模型評價(jià)食物過敏性的可行性研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2015, 15(11): 7-15. DOI:10.16429/ j.1009-7848.2015.11.002.

[27] 孫英杰. 超聲波處理對大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)影響研究[D].哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 31.

[28] ASTWOOD J D, LEACH J N, FUCHS R L. Stability of food allergens to digestion in vitro[J]. Nature Biotechnology, 1996, 14(10): 1269-1273. DOI:10.1038/nbt1096-1269.

Effect of Ultrasonic Treatment on the Potential Allergenicity of Soybean 7S Globulin

DENG Han, ZU Qinqin, ZHU Jierui, YANG Anshu*, CHEN Hongbing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Soybean 7S globulin was modif i ed by ultrasonic treatment, and the changes in its in vitro digestibility, and the antigenicity and potential allergenicity of its digestion products were evaluated. Results showed that the 7S globulin was resistant to saliva and gastric juice, but it was easy to be digested in the duodenum after ultrasonic processing 300 W for 80 min. The antigenicity assessed by in vitro IgG binding showed that the antigenicity of the digestion products increased fi rstly but then decreased as the ultrasonic processing time (0?120 min) increased, reaching the lowest level at 100 min. The potential allergenicity assessed by in vitro IgE binding exhibited an initial increase followed by a decrease with ultrasonic processing time up to 120 min, reaching the lowest level at 80 min. These results suggest that soybean 7S globulin with ultrasonic processing for 80 min has a lower potential allergenicity.

soybean 7S globulin; ultrasonic; in vitro digestibility; antigenicity; potential allergenicity

10.7506/spkx1002-6630-201705006

TS214.2

A

1002-6630（2017）05-0032-06

鄧涵, 祖琴琴, 朱杰瑞, 等. 超聲處理對大豆7S蛋白潛在致敏性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 32-37. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705006. http://www.spkx.net.cn

DENG Han, ZU Qinqin, ZHU Jierui, et al. Effect of ultrasonic treatment on the potential allergenicity of soybean 7S globulin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 32-37. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705006. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102205）；國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（31460439）；江西省科技廳對外科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（20142BDH80002）；江西省青年科學(xué)家培養(yǎng)對象計(jì)劃項(xiàng)目（20122BCB23006）；江西省科技廳知識產(chǎn)權(quán)局項(xiàng)目（20143BBM26107）

鄧涵（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：denghan1996@163.com

*通信作者：楊安樹（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：yanganshu@ncu.edu.cn

80 min具有降低大豆7S蛋白潛在致敏性的作用。