劉 歡, 黃麗娜, 張奮強(qiáng), 姜夢嫣, 周義杰, 陳思源, 王有年, 楊明峰*, 馬蘭青,3*

1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 102206;3.北京農(nóng)學(xué)院, 北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 北京 102206

RNA-Seq高通量測序技術(shù)在果樹功能基因組學(xué)研究的應(yīng)用進(jìn)展

劉 歡1, 黃麗娜2, 張奮強(qiáng)1, 姜夢嫣2, 周義杰1, 陳思源2, 王有年2, 楊明峰2*, 馬蘭青2,3*

1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 102206;2.北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗室, 北京 102206;3.北京農(nóng)學(xué)院, 北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心, 北京 102206

RNA-Seq又稱為“轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)”，它能夠從整體水平研究物種基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程。應(yīng)用該項技術(shù)能有效地解決因果樹基因組龐大等問題，有效地揭示和闡明植物體內(nèi)次生代謝生物合成途徑及代謝機(jī)制。主要論述了RNA-Seq技術(shù)的應(yīng)用方法與流程，通過對測序數(shù)據(jù)的處理分析與比對等方法，分析了RNA-Seq技術(shù)在果樹新基因挖掘、次生代謝產(chǎn)物合成途徑的應(yīng)用進(jìn)展，基于RNA-Seq的高通量測序技術(shù)對于發(fā)現(xiàn)和揭示具有重要生物學(xué)功能和經(jīng)濟(jì)價值的次生代謝產(chǎn)物合成關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)制提供了可能。

高通量測序；RNA-Seq；果樹；次生代謝產(chǎn)物

基因測序技術(shù)也稱DNA測序技術(shù)，是現(xiàn)代生物學(xué)研究中重要的手段之一。截至目前，基因測序技術(shù)一共經(jīng)歷了三個發(fā)展階段。繼1963年Sanger等人第一次完成胰島素51個氨基酸序列的測定后，1975年Sanger和Maxam-Gilbert等又建立了核酸序列測定的方法——雙脫氧末端終止法，將其稱之為第一代測序技術(shù)。隨后，哈佛大學(xué)遺傳學(xué)家George Church和454 Life Sciences公司 Jonathan Rothberg掀起的“新一代測序技術(shù)(NGS)” 也被稱為二、三代測序技術(shù),均以高通量為共同特征。Roche公司的454測序平臺、Illumina公司的Solexa測序系統(tǒng)以及ABI公司的SOLID測序系統(tǒng)標(biāo)志著第二代測序技術(shù)誕生。Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)、Oxford Nanopore Technologies公司研究的納米孔單分子技術(shù)，被認(rèn)為是第三代測序技術(shù)。RNA-Seq對研究不同環(huán)境下植物體內(nèi)基因表達(dá)差異的技術(shù)研究方面具有重要作用[1]。該技術(shù)結(jié)合了構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫的實(shí)驗方法與DGE (digital gene expression TagProfiling) 的信息分析手段，具有高通量的特點(diǎn)，開辟了功能基因組學(xué)研究的新紀(jì)元[2]。

轉(zhuǎn)錄組是連接基因調(diào)控和功能蛋白質(zhì)組的紐帶，RNA-Seq與傳統(tǒng)的cDNA文庫構(gòu)建及EST測序相比[3]，可在較短時間、較少人工和更低成本的情況下獲得大量序列信息，尤其是可獲得低表達(dá)豐度的基因序列，對研究植物抗逆性的基因表達(dá)方式有重要意義[4]。針對遺傳背景復(fù)雜、雜合度高的果樹研究瓶頸，RNA-Seq結(jié)合自身優(yōu)勢，已成為果樹學(xué)研究的新突破點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計：甜橙[5,6]、蘋果[7,8]、草莓[9]、獼猴桃[10,11]、藍(lán)莓[12]、荔枝[13]、火龍果[14]、李子[15]、樹莓[16]等果樹已應(yīng)用這一技術(shù)獲得了高通量的轉(zhuǎn)錄本序列信息及表達(dá)量數(shù)據(jù)，并為其在基因功能驗證及預(yù)測、生物體內(nèi)代謝與調(diào)控、果實(shí)發(fā)育與品質(zhì)形成、環(huán)境脅迫響應(yīng)等方面的研究奠定了基礎(chǔ)。本文先對RNA-Seq測序技術(shù)的研究情況進(jìn)行總述，再結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在果樹功能基因組學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)行分析，最后小結(jié)并展望今后研究中面臨的問題與趨勢，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 RNA-Seq技術(shù)的應(yīng)用與方法

高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能。在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(whole transcriptome resequencing)，也稱為RNA-Seq，是研究基因功能及結(jié)構(gòu)研究的出發(fā)點(diǎn)；從而可以相繼開展可變剪接、轉(zhuǎn)錄本變異研究(如基因融合編碼區(qū)SNP研究)、非編碼區(qū)域功能研究(non-coding RNA研究和microRNA前體研究等)[11]等方面的研究。

1.1 RNA-Seq的實(shí)驗及分析方法

轉(zhuǎn)錄組測序的主要目標(biāo)是獲得某個生物體或某個組織在特定條件下(如經(jīng)過高溫、光照、水分、鹽分脅迫、各種激素的誘導(dǎo)等)表達(dá)的全部基因序列，實(shí)驗流程見圖1[17]。

圖1 RNA-Seq的實(shí)驗流程Fig.1 Experiment pipeline of RNA-Seq.

1.1.1 測序文庫的制備方法[17]提取植物樣品總RNA，然后用帶有Oligo (dT)的磁珠富集mRNA，向得到的mRNA中加入適量fragmentation buffer高溫條件下使其片斷化，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA，經(jīng)過磁珠純化、末端修復(fù)、在3’末端加A尾、測序接頭與dsDNA連接并純化，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用Agilent 2100 Bioanalyzer 和ABI StepOnePlus Real-time PCR System 進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測，文庫質(zhì)控合格后進(jìn)行測序。

1.1.2 數(shù)據(jù)分析 由于所測數(shù)據(jù)結(jié)果龐大而冗雜，測序所得的原始數(shù)據(jù)(rawreads 或raw data) 首先進(jìn)行質(zhì)量篩選，以確定測序數(shù)據(jù)是否適用于后續(xù)分析[1]。經(jīng)過濾得到的clean reads與參考序列做對比進(jìn)行篩選，質(zhì)量分布通常大于30(小于20為質(zhì)量較低)，并對篩選出的樣品間差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋，KEGG生物體內(nèi)代謝分析，基因功能性富集分析(Q-value≤0.05)[18]。

通過RT-PCR、qRT-PCR驗證潛在樣品間差異表達(dá)上、下調(diào)基因的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步闡述他們的作用機(jī)制。

1.1.3 RNA-Seq在果樹上的應(yīng)用 由于果樹存在發(fā)育周期長、遺傳背景復(fù)雜、基因組龐大等特點(diǎn)，相對草本植物與動物的生物合成途徑研究相對滯后，主要是木本植物基因進(jìn)化、遺傳特性以及生態(tài)等因素使其基因組信息嚴(yán)重缺乏。轉(zhuǎn)錄組研究是生物合成途徑、關(guān)鍵基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)，能夠全面且快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息。Zhang等[19]于1997 年最早提出了轉(zhuǎn)錄組的概念，這一概念的提出有效地解決了對遺傳背景復(fù)雜、雜合度高木本植物型果樹的研究瓶頸。轉(zhuǎn)錄組測序是用于研究對象在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括 mRNA和非編碼RNA(rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和microRNA 等)。

表1 應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)的部分果樹Table 1 The trees used RNA-Seq.

RNA 高通量測序技術(shù)(RNA-Seq) 和單分子測序技術(shù)(SNS)[2]能提供精確的數(shù)字化信號，具有測序速度快、測序精度準(zhǔn)確、測序成本低的特點(diǎn)，相比傳統(tǒng)測序手段得到提升，將RNA-Seq結(jié)果與已知基因組DNA 序列信息進(jìn)行對比，判斷基因的表達(dá)情況、基因結(jié)構(gòu)的優(yōu)化以及新基因的發(fā)現(xiàn)等結(jié)果[20]，是目前深入研究復(fù)雜轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)大工具?，F(xiàn)已應(yīng)用RNA-Seq 進(jìn)行研究的部分果樹信息見表1，得益于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使果樹在分子生物學(xué)水平上的研究更為系統(tǒng)化，逐漸由分解轉(zhuǎn)向整合[25]，使木本植物型果樹的分子生物學(xué)研究迎來新的機(jī)遇。

2 RNA-Seq技術(shù)在果樹上的應(yīng)用前景

2.1 基于RNA-Seq技術(shù)挖掘新基因

在Genbank上注冊的基因序列都是經(jīng)過與同源物種進(jìn)行比對，或者通過EST測序預(yù)測而來的。如樹莓(Rubuscorchorifolius)屬于薔薇科落葉小灌木，存在發(fā)育周期長、遺傳背景復(fù)雜、基因組龐大等特點(diǎn)，單純的基因注釋結(jié)果往往難以完全涵蓋某一物種的整個轉(zhuǎn)錄組信息。通過RNA-Seq技術(shù)，可以對現(xiàn)有的基因進(jìn)行整合并優(yōu)化現(xiàn)有的基因注釋結(jié)果；通過測序數(shù)據(jù)與已知的參考基因組比對，能夠發(fā)現(xiàn)一些新的轉(zhuǎn)錄本和新基因。

目前RNA-Seq技術(shù)在植物新基因的挖掘方面己有很多報道。應(yīng)用Illuminate/Solexa測序平臺對越橘果實(shí)的果肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得64 312 746個短序列[5]，利用454測序平臺對模式植物擬南芥的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重測序。Hyun等[24]第一次嘗試使用Illumina測序技術(shù)在沒有參考基因組的情況下，對紅樹莓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共產(chǎn)生了5 100 000個短序列，經(jīng)過重新組裝，獲得了42 604個平均長度為812 bp的獨(dú)立基因，根據(jù)NCBI公共數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)68.86%的獨(dú)立基因在同源物種的植物中被發(fā)現(xiàn)。張曉慧等[10]利用RNA-Seq技術(shù)，探討黃肉獼猴桃發(fā)育過程中果實(shí)類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)差異基因的功能發(fā)現(xiàn)：基因Unigene11266、Unigene23885 可能是類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵基因，且較其他基因而言，基因CL10467、Unigene12775、CL10798、CL1511、Unigene2673 與其關(guān)系更密切。

2.2 基于RNA-Seq技術(shù)確定次生代謝產(chǎn)物合成途徑

針對一些具有經(jīng)濟(jì)價值或者藥用價值的植物來說，一些重要次生代謝產(chǎn)物和有效成分的生物合成途徑是研究的重點(diǎn)。由于果樹體內(nèi)次生代謝途徑冗長而又復(fù)雜，因此利用RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)和挖掘這些重要途徑中的關(guān)鍵酶基因為研究有效成分的生物合成途徑和調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時為利用生物手段提高植物中的有效成分含量或直接生產(chǎn)有效成分提供了可能?；诟咄繙y序系統(tǒng)的RNA-Seq分析在植物次生代謝研究中具有重要意義。目前，已有多種植物通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ζ浯紊x途徑進(jìn)行了研究。Hyun等[24]對樹莓進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析用于后續(xù)基因組功能和合成途徑研究，和己知的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NR、Swiss-Prot、KEGG和COG進(jìn)行比對(E-value<1.0e″5)，對其功能進(jìn)行注釋，在差異表達(dá)庫中進(jìn)行篩選，實(shí)驗表明CHS、CHI、F3H、DFR、F3’H等7個關(guān)鍵酶基因與次生代謝產(chǎn)物花色苷合成相關(guān)。Gupta等[12]對藍(lán)莓發(fā)育成熟前后5個階段的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果指出，藍(lán)莓生長和成熟過程中涉及動態(tài)基因表達(dá)的變化，包括上調(diào)和下調(diào)代謝途徑酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。RNA序列比對分析確定了發(fā)育調(diào)控基因的選擇性剪接過程及各階段啟動子的調(diào)控情況。最終得到了基因組序列、基因模型，并對其進(jìn)行了GO功能注釋。Petersen等[7]、Kui等[8]對蘋果柱狀苗的純合子和雜合子分別進(jìn)行RNA-Seq分析和RT-PCR分析驗證，結(jié)果表明其初級根緊湊增長的分子基礎(chǔ)已被確定，是由一個嵌套的gypsy-44反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入；然而插入轉(zhuǎn)座的表型以及時間之間的聯(lián)系尚不清楚。Gerin等[26]利用RNA-Seq技術(shù)分析并揭示了黑曲霉菌OTA相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄過程的變化方式與途徑，PKS催化異香豆素酸和L-苯丙氨酸之間的肽鍵的形成。

3 展望

盡管各測序平臺在高通量水平、測序準(zhǔn)確度、存儲格式、技術(shù)方法上各有差異，但共同特征是大大降低了測序成本并極大地提高了測序速度。然而第二代測序技術(shù)需要將DNA從細(xì)胞中提取，然后將其片段化，再將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴(kuò)增后制成測序文庫，但是在測序前PCR對待測片段進(jìn)行擴(kuò)增增加了測序的錯誤率。因此比較適合對已知序列的基因組進(jìn)行重新測序，而在對全新的基因組進(jìn)行測序時還需要結(jié)合第一代測序技術(shù)綜合性地進(jìn)行分析。對于樹莓自身存在的發(fā)育周期長，遺傳背景復(fù)雜、次生代謝產(chǎn)物合成途徑受多種酶和底物限制，相對草本植物與動物的生物合成途徑研究相對滯后，同時全基因測序進(jìn)展緩慢等因素的影響。截至目前，該技術(shù)在果樹上的應(yīng)用還不健全，因此應(yīng)用高通量測序技術(shù)手段完成樹莓體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的生命活動、代謝遺傳規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)化分析，從而揭示其生命活動的分子機(jī)理具有良好的前景。

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Progress on Application of RNA-Seq High Throughput Sequencing Technology in Functional Genomics of Fruit Trees

LIU Huan1, HUANG Lina2, Zhang Fenqiang1, JIANG Mengyan2, ZHOU Yijie1, CHEN Siyuan2, WANG Younian1, YANG Mingfeng2*, MA Lanqing2,3*

1.KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(NorthChina),MinistryofAgriculture,PlantScienceandTechnologyCollege,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;2.KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(NorthChina),MinistryofAgriculture,CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China;3.BeijingCollaborativeInnovationCenterforEco-environmentalImprovementwithForestryandFruitTrees,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China

RNA-Seq, also called "Transcriptome Sequencing Technology", can be used to study the species gene function and genetic structure at an overall level to reveal specific biological processes. The application of this technique can effectively resolve the issue of huge genome of fruit trees and other problems, and efficaciously reveal and elucidate biosynthetic pathways and metabolic mechanisms of secondary metabolism in the plant. This article mainly discussed the application method and processes of the RNA-Seq technology; We analized in-depth the synthesis mechanisms of rich small molecular compounds with various secondary bioactive metabolites in synthetic fruit trees and carried out researches on the key enzyme genes synthesizing this pathway. The high-throughput sequencing technology based on RNA-Seq makes it possible to discover and reveal the key genes and regulation and control mechanisms for the synthesis of secondary metabolites with important biological functions and economic values.

high throughput sequencing; RNA-Seq; fruit tree; secondary metabolite

2016-11-17; 接受日期：2017-01-12

國家自然科學(xué)基金項目(21606020)；北京市自然科學(xué)基金項目(2164059);北京市科技創(chuàng)新服務(wù)能力建設(shè)-協(xié)同創(chuàng)新中心項目(PXM2017_014207_000043)資助。

劉歡，碩士研究生，研究方向為果樹品質(zhì)優(yōu)質(zhì)生態(tài)安全。E-mail:huanliu0824@163.com。*通信作者：楊明峰，副教授，研究方向為植物分子生物學(xué)和植物代謝調(diào)控研究。E-mail:mingfengyang@bua.edu.cn。馬蘭青，教授，研究方向為植物次生代謝分子調(diào)控。E-mail:lqma713@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.02.11