何炫程, 呂鶴書(shū), 黃捷飛, 馬蘭青, 楊明峰

北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206

植物miRNA靶基因驗(yàn)證研究進(jìn)展

何炫程, 呂鶴書(shū), 黃捷飛, 馬蘭青, 楊明峰*

北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206

植物microRNA(miRNA)可以利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則對(duì)靶基因進(jìn)行識(shí)別并介導(dǎo)靶基因(mRNA)的切割或翻譯抑制，以此機(jī)制來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)。主要從作用方式及實(shí)驗(yàn)體系兩大方面入手，綜述了植物miRNA與其靶基因的作用機(jī)制，以及植物miRNA靶基因驗(yàn)證方法的研究進(jìn)展,旨在更深入的探究miRNA與其靶基因的作用關(guān)系。

植物miRNA；靶基因；驗(yàn)證

自1993年Lee等[1]和Wightman等[2]分別在研究線蟲(chóng)胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)了19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼單鏈小RNA以來(lái)，就此揭開(kāi)了研究miRNA的序幕。在植物中，miRNA通過(guò)對(duì)其相應(yīng)靶基因進(jìn)行互補(bǔ)識(shí)別，以此來(lái)介導(dǎo)靶基因的調(diào)控，表現(xiàn)為大部分miRNA對(duì)其相應(yīng)靶mRNA進(jìn)行切割，只有小部分的miRNA對(duì)靶基因進(jìn)行翻譯抑制。這與miRNA和靶mRNA的互補(bǔ)程度有著密切關(guān)系。已有研究表明，miRNA通過(guò)作用于其相應(yīng)靶基因，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育等諸多方面都具有調(diào)控作用[3]。因此，運(yùn)用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈヲ?yàn)證miRNA與靶基因的關(guān)系就顯得尤為重要。目前，人們根據(jù)植物miRNA作用于靶基因的特點(diǎn)，建立了幾種適用于植物miRNA靶基因驗(yàn)證的方法。這些方法從不同角度以及不同方面對(duì)靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)已頗具成效。本文將目前已有的驗(yàn)證方法歸納總結(jié)，綜述了目前效果最佳及使用較多的驗(yàn)證方法，以期為今后miRNA的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 miRNA與靶基因作用機(jī)制

1.1 miRNA介導(dǎo)靶基因的降解

目前對(duì)于miRNA如何介導(dǎo)mRNA的降解有以下兩種觀點(diǎn)：一種觀點(diǎn)認(rèn)為miRNA具有向?qū)ё饔?，它?huì)把需要降解的mRNA作出標(biāo)記，之后運(yùn)送到普通mRNA降解機(jī)制中?，F(xiàn)階段在斑馬魚(yú)胚胎以及線蟲(chóng)的研究中支持此觀點(diǎn)；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為miRNA介導(dǎo)mRNA的降解需要多種相關(guān)酶和復(fù)合物的參與，如脫腺苷酶復(fù)合物、脫帽酶等都可能在此過(guò)程中發(fā)揮作用?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)，植物中大約有70%的miRNA是介導(dǎo)靶基因切割的。其切割位點(diǎn)處于miRNA的第10～11堿基之間。

1.2 miRNA介導(dǎo)靶基因的翻譯抑制

目前對(duì)于 miRNA 如何介導(dǎo) mRNA 翻譯抑制的爭(zhēng)議較大，具體有以下幾種觀點(diǎn)：

1.2.1 翻譯起始抑制 這種觀點(diǎn)認(rèn)為miRNA導(dǎo)致核糖體無(wú)法順利組裝，Chendrimada等[4]認(rèn)為miRNA可能是通過(guò)阻止核糖體組裝從而阻斷翻譯起始。Thermann等[5]的研究也表明miRNA可以全面抑制核糖體的組裝，將這種miRNA去除后，核糖體又會(huì)重新恢復(fù)其功能。

1.2.2 miRNA翻譯起始后抑制 在線蟲(chóng)中的實(shí)驗(yàn)表明，miRNA及其靶基因可以與一些多聚核糖體結(jié)合在一起，miRNA可能通過(guò)這些多聚核糖體抑制mRNA的翻譯。Petersen等[6]的研究證實(shí)了此觀點(diǎn)。

1.2.3 翻譯的提前終止 這個(gè)觀點(diǎn)主要是基于Petersen等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該研究設(shè)置兩組mRNA，一組加入miRNA，另一組為對(duì)照組。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組靶基因核糖體的解離速度要比對(duì)照組更快。由此產(chǎn)生了miRNA引發(fā)翻譯提前終止的假說(shuō)。

目前，就驗(yàn)證miRNA介導(dǎo)靶基因翻譯抑制的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，其具體機(jī)制為當(dāng)miRNA與靶mRNA的3′-UTR區(qū)不完全互補(bǔ)配對(duì)，miRNA會(huì)結(jié)合到靶mRNA 3′-UTR上，從而阻斷靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

2 靶基因驗(yàn)證方法

現(xiàn)階段對(duì)于miRNA靶基因的驗(yàn)證工作可以從兩方面著手：一方面是從miRNA對(duì)于靶基因的作用方式入手，主要有miRNA介導(dǎo)靶基因的切割以及靶基因的翻譯抑制。當(dāng)miRNA介導(dǎo)靶基因切割時(shí)可以從RLM-5′RACE[7,8]、3′PPM RACE技術(shù)[9]、降解組[10]測(cè)序入手。當(dāng)miRNA介導(dǎo)靶基因翻譯抑制時(shí)主要為報(bào)告基因系統(tǒng)。另一方面是針對(duì)于驗(yàn)證靶基因的實(shí)驗(yàn)體系，可分為瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)基因兩種方式。

2.1 從作用方式著手的驗(yàn)證方法

2.1.1 利用RLM-5′RACE驗(yàn)證靶基因 Llave等[7]利用植物miRNA介導(dǎo)靶基因切割這一特點(diǎn)，運(yùn)用改進(jìn)的RLM-5′RACE(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM RACE)驗(yàn)證植物miRNA靶基因。事實(shí)證明，在植物中當(dāng)miRNA介導(dǎo)靶基因切割時(shí)運(yùn)用其開(kāi)發(fā)的這種方法是可行的，因此被廣大研究人員采用。這一方法相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，可在短時(shí)間內(nèi)完成驗(yàn)證工作。但這種方法驗(yàn)證結(jié)果單一，每次試驗(yàn)只可驗(yàn)證一種靶基因，對(duì)于多種靶基因的同時(shí)驗(yàn)證無(wú)法完成。其主要原理為:miRNA介導(dǎo)mRNA發(fā)生切割后,斷裂的mRNA 3′端片段會(huì)產(chǎn)生一個(gè)暴露的5′磷酸基團(tuán),接著使用RNA連接酶在mRNA斷口處拼接上一個(gè)RNA接頭,然后利用反轉(zhuǎn)錄引物Oligo (dT)完成反轉(zhuǎn)錄。最后利用基因特異性引物(GSP)可以擴(kuò)增mRNA斷口處附近核酸序列,借此來(lái)確定切割位點(diǎn)[11]。

2.1.2 利用3′PPM RACE驗(yàn)證靶基因 RLM 5′RACE利用被切割的靶基因的3′端斷裂片段進(jìn)行驗(yàn)證，而3′PPM RACE[Poly (A) polymerase-mediated 3′rapid amplification of cDNA ends]則利用5′端斷裂片段進(jìn)行驗(yàn)證。宋長(zhǎng)年[12]和王晨[13]分別利用3′PPM RACE技術(shù)驗(yàn)證了各自研究的靶基因。其主要原理為：在mRNA 5′斷裂片段的3′端添加Poly(A)尾巴，之后將 5′斷裂片段反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后將包含切割位點(diǎn)的片段擴(kuò)增，最后對(duì)其切割位點(diǎn)進(jìn)行檢驗(yàn)。此方法相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于5′端斷裂產(chǎn)物不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解，所以3′PPM RACE并不十分常見(jiàn)。

2.1.3 利用降解組測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證miRNA靶基因 上述方法只能驗(yàn)證單一靶基因序列，對(duì)于大量的靶基因驗(yàn)證工作就變得無(wú)從入手。由于高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展和更新?lián)Q代，隨之演變出了一種新的對(duì)于miRNA靶基因的驗(yàn)證手段, 即降解組測(cè)序(degradome sequencing)法[14]。

German等[10]首次運(yùn)用降解組測(cè)序技術(shù)成功驗(yàn)證了miRNA的靶基因。降解組測(cè)序技術(shù)主要由3個(gè)步驟組成:構(gòu)建文庫(kù)、高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析。這一方法的主要原理為[15]:miRNA介導(dǎo)mRNA發(fā)生切割后,斷裂的mRNA 3′端片段會(huì)產(chǎn)生一個(gè)暴露的5′磷酸基團(tuán),在其斷口處用RNA連接酶拼接一個(gè)RNA接頭，然后利用反轉(zhuǎn)錄引物Oligo (dT)完成反轉(zhuǎn)錄。最后利用基因特異性引物(GSP)將mRNA斷口處附近核酸序列擴(kuò)增。進(jìn)行酶切后得到長(zhǎng)度為20～21 nt的片段，再將此片段與3′雙鏈DNA接頭連接并進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 膠回收純化后, 得到一個(gè)靶基因斷裂的3′端切割片段的文庫(kù)，進(jìn)行高通量測(cè)序后，運(yùn)用CleaveLand分析軟件將得到的序列與目標(biāo)物種的基因組或cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，記錄匹配序列，同時(shí)去除未比對(duì)上的序列，最終能夠獲得被切割的mRNA的完整核酸序列。

2.2 從實(shí)驗(yàn)體系著手的驗(yàn)證方法

現(xiàn)階段，在植物中驗(yàn)證靶基因的體系可分為瞬時(shí)表達(dá)和轉(zhuǎn)基因。瞬時(shí)表達(dá)較穩(wěn)定表達(dá)具有操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)操作快、實(shí)驗(yàn)周期短等諸多優(yōu)點(diǎn)[16]，轉(zhuǎn)化效率比較穩(wěn)定，表達(dá)水平較高，并且不可穩(wěn)定遺傳，具有很高的生物安全性[17]。

2.2.1 利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)作為植物miRNA功能的驗(yàn)證體系 趙文婷等[18]選用植物表達(dá)載體，依靠此載體表達(dá)miRNA；并且選用同樣的植物表達(dá)載體來(lái)表達(dá)預(yù)測(cè)的靶基因與GFP融合蛋白，將這兩種載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染煙草葉片下表皮，之后觀察煙草下表皮的熒光現(xiàn)象。此方法簡(jiǎn)單省時(shí)，可以快速、直觀地觀察生物大分子的功能[19]。

2.2.2 利用轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)作為植物miRNA功能的驗(yàn)證體系 賈小云等[20]以miR828過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄和野生番茄為材料，設(shè)置正常供磷和缺磷2個(gè)處理的培養(yǎng)試驗(yàn)。將野生型和miR828過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株缺磷培養(yǎng)15 d后，觀察番茄植株地上部分和地下部分的表型差異。之后利用qRT-PCR分析miR828及其靶基因SlMYB7-like的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR828及其靶基因SlMyb7-like的表達(dá)受缺磷脅迫誘導(dǎo)。在正常供磷和缺磷條件下，miR828過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄植株中各花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)量和花青素含量均低于野生型，表明miR828通過(guò)靶向SlMyb7-like負(fù)調(diào)控花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)調(diào)控番茄植株中花青素的生物合成。從而證明了miRNA與其靶基因的相關(guān)性。

3 展望

目前分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)正在飛速發(fā)展，有關(guān)miRNA靶基因的驗(yàn)證方法也在不斷更新。但由于miRNA片段較小，且作用機(jī)制單一，所以將驗(yàn)證靶基因的方法變得具有局限性。當(dāng)下絕大部分驗(yàn)證手段均是從靶位點(diǎn)斷裂部分著手，但由于miRNA與靶基因關(guān)系的不確定性，都為使用這些方法驗(yàn)證靶基因制造了隱患。

就單一的靶基因驗(yàn)證而言，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)雖然可以驗(yàn)證出miRNA與其靶基因的相關(guān)性，但都是從標(biāo)記基因以及表觀現(xiàn)象來(lái)進(jìn)行佐證。若想從分子角度來(lái)闡明這種關(guān)系，其最終還是要通過(guò)RLM 5′RACE等來(lái)加以證明。而就現(xiàn)階段研究來(lái)看，直接從植物中驗(yàn)證靶基因已并不多見(jiàn)，大部分都是通過(guò)過(guò)表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。那么，對(duì)于多種驗(yàn)證手段的綜合應(yīng)用，已經(jīng)是當(dāng)下靶基因研究的發(fā)展趨勢(shì)。如果可以從植物中直接驗(yàn)證目的miRNA的靶基因，將會(huì)極大的推進(jìn)miRNA的研究進(jìn)程。因此，今后對(duì)于直接從植物中高效的驗(yàn)證出低峰度miRNA的靶基因，可能會(huì)成為研究的熱點(diǎn)。

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Advances on Target Gene Alidation Method of Plant miRNA

HE Xuancheng, LV Heshu, HUANG Jiefei, MA Lanqing, YANG Mingfeng*

KeyLaboratoryofUrbanAgriculture(NorthChina),MinistryofAgriculture,CollegeofBiologicalScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China

Plant microRNAs (miRNAs) can recognize the target gene(mRNA) by the principle of complementary pairing and mediate the cleavage or translation inhibition of the target gene, and the mechanism was used to regulate the expression of target genes. In this paper, we reviewed the mechanism of plant miRNA and its target genes, and the research progress of plant miRNA target gene validation methods from two aspects of the function and the experimental system, which was objectived to explore the relationship between miRNA and its target genes.

plant miRNA; target gene; validation

2016-12-07; 接受日期：2017-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370674；31300620)；北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201410020001)資助。

何炫程，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锎x調(diào)控。E-mail:1375720631@qq.com。*通信作者：楊明峰，副教授，研究方向?yàn)橹参锎x調(diào)控。E-mail:mfyang@bac.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.02.03