榮 輝,吳兵兵,2,楊賢慶,*,李來好，3,鄧建朝,李春生

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306；3.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東廣州 510300)

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高速逆流色譜分離純化脂肪酸的研究進展

榮 輝1,吳兵兵1,2,楊賢慶1,*,李來好1，3,鄧建朝1,李春生1

(1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所,國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學食品學院,上海 201306；3.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東廣州 510300)

高速逆流色譜(High-speed Countercurrent Chromatography HSCCC)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術,在中藥、生化、食品、天然產(chǎn)物化學、環(huán)境分析領域中有著廣泛的應用。文章對高速逆流色譜技術的原理和特點,以及在微藻油、魚油以及其他來源的脂肪酸及其相應酯的分離純化上的應用進行了概述,并且展望了利用高速逆流色譜技術分離純化脂肪酸的應用前景。

高速逆流色譜,脂肪酸,檢測分析,分離純化

上世紀八十年代初,美國Ito教授發(fā)明了高速逆流色譜(High-speed countercurrent chromatography,HSCCC)[1-2],很快HSCCC便被廣泛應用在生物化學、醫(yī)藥學、食品、地質、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、材料、化工、海洋生物等眾多領域。近年來隨著儀器設備的不斷改進和完善,HSCCC設備的保留能力和分離性能都極大的提高,使其可以使用雙水相體系進行生物大分子的分離純化,如蛋白質、核酸、脂肪酸等[3-5]。脂肪酸是人體必不可少的營養(yǎng)成分之一,對人體的健康具有十分重要的作用。其中ω-3和ω-6系多不飽和脂肪酸在脂蛋白平衡、抗心血管疾病、促進生長發(fā)育以及保護神經(jīng)細胞等方面起著重要的作用,成為當前的營養(yǎng)生化以及保健品行業(yè)的研究熱點[6-7]。本文就高速逆流色譜技術在脂肪酸分離和純化方面的進展進行討論,并展望了其發(fā)展趨勢。

1 HSCCC的工作原理和技術優(yōu)勢

1.1 HSCCC的原理

HSCCC分離原理是螺旋柱在高速行星式運動時會產(chǎn)生巨大的不對稱離心力,利用不對稱離心力使互不相溶的兩相液體在螺旋柱中不斷混合,其中一相(固定相)保留下來,另一相(流動相)通過恒流泵持續(xù)不斷輸入,此時在螺旋柱中任何一部分,兩相溶劑都反復進行著混合和不斷分配的過程,這一過程頻率極高,流動相不斷穿過固定相,溶質(樣品)隨著流動相進入螺旋柱并不斷反復穿過固定相,樣品在兩相之間不斷的反復分配,由于樣品中各組分在兩相之中的分配能力不同,導致在色譜柱中的移動速度不一樣,從而使樣品中的各組分得到分離[8-9]。

1.2 HSCCC的技術優(yōu)點

HSSCCC以液體溶劑做固定相,物質的分離依據(jù)其在互不相溶的兩相液體中的分配系數(shù)的差異而實現(xiàn),因而可以擁有廣泛的溶劑來源。特點主要有以下幾點:操作簡單易行。HSCCC簡化了樣品預處理工作,能夠直接進樣,部分洗脫組分純度可以達到90%以上[10],出峰可以在線檢測,并且可以直接和質譜儀或紅外色譜儀聯(lián)用進行分析;不需要固體支持物作為固定相。由于不使用固體支持物,可以避免樣品出現(xiàn)不可逆吸附、污染、變性、失活等;節(jié)省成本。HSCCC分離過程不是吸附與淋洗的過程,而是對流穿透的過程,可以節(jié)省填料的費用,節(jié)約溶劑的消耗;應用范圍廣。HSCCC所使用的兩相溶劑體系是任意的,可以適用于各種極性范圍的化合物的分離,不同的型號可以實現(xiàn)小規(guī)模的分析及大規(guī)模的制備[11]。

2 脂肪酸傳統(tǒng)分離純化方法存在的問題

2.1 脂肪酸的種類及功能

脂肪酸是組成油脂的脂肪族一元羧酸,根據(jù)其飽和度的不同,可以將脂肪酸分為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。不同脂肪酸之間的區(qū)別主要是在于烴鏈的長短、飽和與否以及雙鍵的數(shù)目和位置等。飽和脂肪酸包括辛酸、丁酸、硬脂酸、月桂酸、棕櫚酸、花生酸等。研究表明,飽和脂肪酸是心臟優(yōu)先動用的脂肪酸[12],適量食用飽和脂肪酸也可以促進脂肪代謝,其中辛酸等可以調(diào)節(jié)血清中低密度脂蛋白(LDL)的代謝,丁酸可以促進細胞分化和凋亡、抑制腫瘤生長的作用[13]。膳食中的飽和脂肪酸比較容易沉積在動脈管壁,過量食用會造成體內(nèi)脂肪沉積,誘發(fā)高血脂和血管硬化等疾病。單不飽和脂肪酸指含有一個雙鍵脂肪酸,主要有油酸、芥酸、棕櫚油酸、蓖麻油酸等。油酸(C18∶1,ω9)是單不飽和脂肪酸最具代表性的一類,被廣泛應用于食品與醫(yī)藥工業(yè)中。單不飽和脂肪酸具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇等生理作用[14]。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs),又被稱為多烯酸,是指含有兩個或更多個不飽和雙鍵結構的脂肪酸。多不飽和脂肪酸根據(jù)甲基端第一個雙鍵位置的不同,PUFAs可以分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列。ω-3系主要有α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等;ω-6系列主要有亞油酸(LA)、γ-亞油酸(GLA)、花生四烯酸(AA)等;ω-7、ω-9系列主要有二十碳三烯酸等[15]。多不飽和脂肪酸是人體必需的營養(yǎng)物質,具有保障人體細胞的正常生理功能、降低血液中的膽固醇和甘油三酯、改善血液循環(huán)等眾多功能。其中ω-3系的DHA和EPA對于神經(jīng)系統(tǒng)具有重要功能,可以促進嬰幼兒腦細胞的生長發(fā)育,提高青少年記憶力,預防老年性癡呆等[16-18]。

2.2 傳統(tǒng)脂肪酸的檢測及分離純化方法

隨著人們對脂肪酸的研究的不斷深入以及各種層析、色譜技術的不斷出現(xiàn),對于脂肪酸的檢測分析以及分離提純的方法也越來越多。常見的脂肪酸的分析測定方法有氣相色譜法[19](Gas chromatography,GC)、高效液相色譜法[20](High performance liquid chromatography,HPLC)、近紅外光譜法[21](Near-infrared Reflectance Spectroscopy,NIRS)等。常用的脂肪酸分離提純方法有溶劑萃取法、低溫結晶法、尿素包合法、分子蒸餾法、高效液相色譜法、超臨界二氧化碳萃取法、三步提取法、脂肪酶濃縮法等。常見的脂肪酸的檢測分析以及分離提純方法都有一定的缺點。檢測分析方法中HPLC的清洗過程的步驟冗長且繁瑣,分離時間較長,對于某些具有生物活性的PUFAs的分離效果不好[22];分離提純方法中分子蒸餾、超臨界萃取等較新型的分離技術由于設備投資大、處理量小,使其應用受到了一定限制,更多的是用來從魚油中分離DHA、EPA等經(jīng)濟價值更高的物質;三步法主要是用來提取不飽和脂肪酸如DHA等,而且操作繁雜、工藝冗長等。Rupani[23]等采用了4種市售的脂肪酶-褶皺假絲酵母脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶、熒光假單胞菌脂肪酶和米黑根毛霉脂肪酶對脂肪酶濃縮法提取α-亞麻酸進行了研究。結果表明,只有褶皺假絲酵母脂肪酶這一種酶能選擇性地水解亞麻籽油得到富集的α-亞麻酸。Mendes[24]等研究利用超臨界二氧化碳萃取法從節(jié)旋藻油中提取亞麻酸(GLA)。在60 ℃和350 Pa的壓力下,運用超臨界萃取技術最終得到棕櫚酸(31.7%)、棕櫚油酸(12.4%)、硬脂酸(0.6%)、油酸(1.2%)、亞油酸(18.6%)、亞麻酸(35.5%)。目前人們?yōu)榱诉M一步提高脂肪酸提取物的純度,一般是將幾種方法結合起來使用。A.Robles Medina和Cartens M等研究提出了三步法提取PUFA[25]。首先利用直接皂化法從細胞中提取脂肪酸組分,然后用尿素結晶法對不飽和脂肪酸進行濃縮,最后利用高壓液相色譜進行EPA和DHA的分離純化,獲得的EPA和DHA的純度均高達92%以上,產(chǎn)率分別為84%和88%。

3 HSCCC分離純化脂肪酸的研究與應用

3.1 HSCCC分離純化脂肪酸的發(fā)展歷程

由于傳統(tǒng)的分離純化脂肪酸的方法有一定的缺陷,所以人們不斷地尋找新的技術方法來分離純化脂肪酸。Cao[26]等采用超臨界萃取結合HSCCC分離的方法對葡萄籽中的油脂成分進行了成功的分離,得到了純度達99%的亞油酸,這說明HSCCC是一種很有效的分離脂肪酸類化合物的方法,隨后人們對此進行了更深入的研究。孫磊[27]等人應用HSCCC技術對共軛亞油酸(CLA)及其異構體的分離進行了研究。采用正己烷-乙腈(1∶1)的溶劑系統(tǒng)對CLA進行分離。結果表明,20 min時油酸(RT 7.10)含量為46.36%,共軛亞油酸(RT 8.03,8.23,8.71,9.11)的含量為47.63%。而38、48 min的圖譜中,已經(jīng)沒有了油酸峰,而且共軛亞油酸的比例分別高達97.05%和97.73%,由此可見使用HSCCC可以對CLA進行較高效率的純化。Chen[28]等對HSCCC純化表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)單脂肪酸酯進行了研究,首先對沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯用十六烷酰氯進行催化酯化反應,再使用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)組成的溶劑系統(tǒng),通過HSCCC從該反應產(chǎn)物中純化得到EGCG單脂肪酸酯,并通過紅外光譜法和電噴霧質譜法對其結構進行了驗證,最終確定其為EGCG-COOC15H31,HSCCC分離該物質的純度可達到85%。

3.2 HSCCC分離純化脂肪酸的應用

目前HSCCC分離提純脂肪酸的相關研究,多集中在以魚油以及微藻油為原料來分離提純多不飽和脂肪酸上。在微藻油以及魚油中,多不飽和脂肪酸多以甘油三酯的形式存在。目前的處理方法大多是將微藻油以及魚油經(jīng)皂化處理,成為游離脂肪酸和甘油,再經(jīng)HSCCC處理就可以分離出游離的脂肪酸。應用HSCCC分離提純脂肪酸酯時,不需進行皂化處理,就可以直接進行分離提純。

3.2.1 HSCCC分離純化微藻油脂肪酸 微藻是一類在陸地、海洋分布廣泛、營養(yǎng)豐富、種類繁多的單細胞真核生物。微藻多富含蛋白質、脂肪、糖以及氨基酸和多不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)物質,是生產(chǎn)食品、藥品高價值生物活性物質和生物柴油的重要來源[29-30]。大多微藻油脂的基本成分與植物油成分相似,但多富含多不飽和脂肪酸[31-32],而多不飽和脂肪酸是人體必需的營養(yǎng)物質,具有十分重要的作用。部分微藻因其可進行高密度異養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng),是工業(yè)化生產(chǎn)富含多不飽和脂肪酸微藻油的優(yōu)質來源,如裂壺藻、隱甲藻等。微藻油中脂肪酸的分離提取也愈發(fā)成為人們的研究熱點[33-34]。Simon[35]等利用HSCCC和氣質聯(lián)用技術(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer-computer GC-MS)分離提純亞歷山大藻的脂肪酸。首先將收獲的藻油進行酯交換,然后利用HSCCC進行分析。結果表明,在未分級樣品中HSCCC能夠分離提純出20種含量較高的脂肪酸如豆蔻酸,棕櫚酸,油酸,α-亞麻酸,EPA和芥酸等;此外HSCCC還能夠分離提純出另外22種含量約占總脂肪酸0.01%～0.2%間的微量脂肪酸,包括幾種支鏈脂肪酸以及幾乎沒有報道過的脂肪酸,如18∶2-4,9。Lu[36]等利用HSCCC分離純化ThraustochytriumATCC 26185中的角鯊烯。用有機溶劑萃取藻油,然后應用HSCCC進一步分離純化角鯊烯,采用正己烷-乙醇(2∶1)的溶劑系統(tǒng)進行分離純化。結果表明,該方法可從150 mg粗角鯊烯(0.14%)得到0.2 mg角鯊烯,純度為96%,回收率為95%。榮輝[37]等采用HSCCC與蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用技術分離純化微小小球藻Chlorellaminutissima中的EPA。采用乙腈-正庚烷-乙酸-甲醇(5∶4∶1∶1)的兩相溶劑系統(tǒng)進行分離。結果表明,最佳的條件為流速3.0 mL/min,轉速913 r/min,分離溫度21 ℃。EPA的純度高達90%以上。說明利用HSCCC分離純化微藻油中的脂肪酸是一個十分有效的方法。

3.2.2 HSCCC分離純化魚油脂肪酸 魚油是魚體內(nèi)的全部油類物質的統(tǒng)稱,包括體油、肝油和腦油,大多從多脂魚類中提取獲得,魚油富含ω-3系多不飽和脂肪酸,是EPA和DHA的主要來源。Li[38]等研究通過HSCCC從酯交換魚油中分離純化出十六碳四烯酸脂肪酸(16∶4n-1)甲酯,采用正己烷-甲醇-水(350∶175∶2)的溶劑系統(tǒng)來進行分離純化。結果表明,魚油中的大多數(shù)脂肪酸為多不飽和脂肪酸。HSCCC可以很好地分離6、9、12、15十六碳四烯酸脂肪酸(16∶4n-1)甲酯。其中15～18 min中脂肪酸的分離純度高達78%。Brodier[39]等通過GC-MS和HSCCC對深海鯊魚(葉鱗刺鯊)的肝油進行脂肪酸甲酯的表征和純化。結果表明,魚肝油可皂化的脂肪酸主要由14～24個碳原子的線性飽和和線性單不飽和脂肪酸組成。只有二十二碳六烯酸這一多不飽和脂肪酸被識別和純化。該研究表明HSCCC是一種從魚油中分離提純脂肪酸的有效方法。

3.2.3 HSCCC分離純化其他來源脂肪酸及脂肪酸酯 HSCCC除了可應用于魚油和微藻油脂肪酸分離純化外,人們還不斷拓展,將HSCCC應用到其他來源脂肪酸以及脂肪酸酯的分離純化中。Cao[26]等對HSCCC分離純化葡萄籽油油脂成分進行了研究。首先采用超臨界萃取的方法對葡萄籽油進行了提取,并經(jīng)過皂化后,選用正庚烷-乙腈-冰乙酸-甲醇(4∶5∶1∶1)的兩相有機溶劑系統(tǒng),利用HSCCC對葡萄籽油可皂化物中的幾種脂肪酸進行分離。因脂肪酸無紫外吸收,Cao采用了蒸發(fā)光散射檢測器進行監(jiān)測。結果表明1.0 g油可以分離產(chǎn)生約430 mg純度為99%的亞油酸,而油酸、棕櫚酸以及硬脂酸所占比例不高,同時有少量的γ-亞麻酸分離出來。Sun[40]等研究通過HSCCC從長松蘿松蘿酸中分離純化脂肪酸,采用聚對苯二甲酸乙二醇酯-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶5∶3∶7)作為兩相溶劑制備體系,分離純化獲得純度為95.7%的己酸。

HSCCC技術除了可以用來分離提純游離脂肪酸外,還可以應用到其他的脂肪酸酯的分離純化中。曾慧英[41]等研究利用HSCCC分離提純葵花油氧化產(chǎn)物中的三亞油酸甘油酯單氫過氧化物。采用正己烷-二氯-甲烷-乙腈(4∶1∶3)的溶劑系統(tǒng)來進行分離純化。結果表明,在流速1.5 mL/min、轉速850 r/min、上樣5 g、分離時間195 min的條件下所得的三亞油酸甘油酯單氫過氧化物純度為96.3%,產(chǎn)率為52.3%。沒食子酸亦稱“五倍子酸”,學名“3,4,5-三羥基苯甲酸”,分子式C7H6O5,廣泛存在于掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物中,在食品、生物、醫(yī)藥、化工等領域有廣泛的應用[42]。李忠琴[43]等研究通過HSCCC分離純化中藥訶子中的沒食子酸,采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5)為兩相溶劑制備體系。結果表明,主機轉速850 r/min、流動相流速2 mL/min、檢測波長254 nm的條件下,沒食子酸的分離純度可以達到96.04%。陳平[44]對HSCCC分離制備EGCG單脂肪酸酯進行了研究,并申請了發(fā)明專利。采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1∶1∶2∶1),分離純度可以達到95%以上。上述相關研究表明HSCCC簡便、快速、重復性好,同樣適用于脂肪酸酯的分離純化。

4 展望

盡管目前HSCCC已經(jīng)實現(xiàn)了上百毫克甚至數(shù)十克的制備分離,但離數(shù)百克甚至數(shù)公斤級的制備分離還相距甚遠,需要解決儀器放大過程中的關鍵性問題[45];同時分離柱本身的分離理論塔板數(shù)很低,因此在手性分離中的應用范圍不廣[46]。HSCCC需要經(jīng)過多次實驗才可以篩選出合適的溶劑系統(tǒng),溶劑消耗量大,靈敏度不高。但HSCCC具有易放大、操作簡便、成本低廉等優(yōu)勢;相比較其他的色譜分離方法,HSCCC由于采用液體溶劑做固定相,在高純度目標成分的分離純化和制備方面具有巨大的優(yōu)勢。在分析化學的基礎上,人們不斷進行研究,開發(fā)出了雙向逆流色譜以及pH-區(qū)帶精制逆流色譜等技術,其中雙向逆流色譜具有能同時實現(xiàn)正向和反向兩種模式的分離,分離純化后所得的物質純度高的優(yōu)點;pH-區(qū)帶精制逆流色譜具有進樣量高、分離純化后所得的物質純度高、溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化較為容易的優(yōu)點?？傊?隨著液相色譜理論研究的不斷深入以及技術的不斷發(fā)展,HSCCC在脂肪酸等生物大分子的分離純化領域將發(fā)揮越來越重要的作用。

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Research progress in separation and purification of fatty acidsby high-speed countercurrent chromatography

RONG Hui1,WU Bing-bing1,2,YANG Xian-qing1,*,LI Lai-hao1,3,DENG Jian-chao1,LI Chun-sheng1

(1.Key Lab of Aquatie Product Processing,Ministry of Agriculture,National Research and Development Center for AquaticProduct Processing,South China Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510300,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Fishery Ecology Environment,Guangzhou 510300,China)

High-speed countercurrent chromatography(HSCCC)is a kind of liquid-liquid partition chromatography,which has the unique features of high efficiency and continuous processing capability. It has been widely used in the separation and purification of Chinese heabal medicines,the natural products and food,as well as in biochemistry and in environmental chemistry analysis. In this paper,the principle and characterization of high-speed countercurrent chromatography and its application in separation and purification of fatty acids and corresponding esters from microalgae oil,fish oil and other sources were summarized,and the application future in separation and purification of fatty acids by high-speed countercurrent chromatography were predicted.

high-speed countercurrent chromatography;fatty acid;detection and analysis;separation and purification

2016-12-29

榮輝(1981-)，男，博士，主要從事微藻油的提取及多不飽和脂肪酸的分離純化研究，E-mail：ronghui8915@163.com。

*通訊作者:楊賢慶(1963-)，男，本科，研究員，主要從事水產(chǎn)品加工及質量安全方面的研究，E-mail：yxqgd@163.com。

廣東省科技計劃項目(2014A010107019)；國家重點研發(fā)計劃項目-生物產(chǎn)業(yè)共性技術標準研究項目(2016YFF0202300)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目(2014TS24)；農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室開放基金項目(NYJG201407)；廣東省農(nóng)業(yè)標準化專項資金項目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0319-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.060