張愛東 張美華 陳峰 仕治達(dá) 于建春 邱毅 劉以訓(xùn)

精子發(fā)生對溫度非常敏感，睪丸局部溫度升高能導(dǎo)致睪丸生精功能障礙甚至不育。研究發(fā)現(xiàn)，隱睪導(dǎo)致的不育與生精細(xì)胞大量凋亡有關(guān)［15］，但生精細(xì)胞凋亡的機制尚未完全明確。Gou等［6］將食蟹猴每天放置在43℃溫水中，對其睪丸局部溫浴30 min，連續(xù)2天共60 min后，在終止溫浴的1個月內(nèi)，發(fā)現(xiàn)精液中精子數(shù)比溫浴前下降了80%。本文對正常成年男性睪丸局部溫?。釅海┖蟮木簠?shù)、精子頂體酶活性及精液內(nèi)表皮生長因子（EGF）的改變進(jìn)行了觀察，報告如下。

對象與方法

1對象：選取2012年5月—2015年10月已育成年健康男性志愿者30例。臨床試驗入選標(biāo)準(zhǔn)為無心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無傳染病史，需采取避孕措施節(jié)育，身體健康、已婚且至少生育有1個子女的男性（32～48歲，有二胎生育指標(biāo)），志愿接受43℃男性避孕裝置避孕試驗。填寫知情同意書，一式3份，受試者1份，課題組1份，科研科存檔1份。

2男性檢查：男性第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、睪丸、附睪等。每次睪丸熱壓（testis heat treatment，THT）后進(jìn)行陰囊皮膚、睪丸大小、張力等檢查，并詢問自愿受試者的性生活情況，有無勃起功能障礙、不射精等發(fā)生。本臨床試驗經(jīng)過山東省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

3陰囊外部放置恒溫加熱帶（睪丸熱壓，testis heat treatment，THT）：熱壓溫度 40～43℃，每周 2次，每次30～50 min，連續(xù)進(jìn)行3個月。進(jìn)入試驗前進(jìn)行3次精液常規(guī)檢查和1次血生殖激素T、FSH、LH檢測，試驗期間每月進(jìn)行2次精液常規(guī)檢查，T、FSH、LH檢測1次，停止THT試驗后2周、1個月、2個月、3個月、半年抽血查T、LH、FSH含量及精液常規(guī)分析；禁欲3～5 d取精液進(jìn)行常規(guī)檢查。

4男用陰囊局部“熱壓”裝置帶的研制及實驗器材：恒溫控制器、定時器及交流電變壓裝置的設(shè)計和研制。變壓裝置輸入電壓200～250 V，輸出電壓為12 V，時間控制器為1～60 min；選擇無毒性的化學(xué)材料，制作“熱壓”帶，溫度控制在43℃左右（425～435℃），安置在特制的內(nèi)用褲頭上。

5精液常規(guī)分析及精子低滲腫脹實驗（HOS）：精液常規(guī)分析每月取平均值進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計。THT試驗前后進(jìn)行自身對照。

按照WHO規(guī)定的方法進(jìn)行精液常規(guī)分析［7］。

6T、FSH、LH測定：化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定血清生殖內(nèi)分泌激素T、FSH、LH。常規(guī)抽空腹靜脈血2 ml，將血樣置于37℃水浴箱30 min，待測血液完全凝固后再取出，1 500 rpm／min離心15 min，分離血清，取3000μl血清上機檢測。

7精子染色質(zhì)擴散（SCD）實驗：根據(jù)文獻(xiàn)［89］略加修改。用中草藥皂角提取液代替原精子裂解液中的三羥甲基氨基甲烷硼酸鹽乙二胺四乙酸二鈉鹽（Tris Borate EDTA，TBE）緩沖液，效果相同，且皂角無毒性。（1）精液標(biāo)本處理：精液標(biāo)本用磷酸鹽緩沖液（pH 68）調(diào)至 10×106／ml，37℃孵育；精子混合液滴在瓊脂預(yù)處理過的載玻片上，4℃放置5 min。（2）精子變性及裂解：標(biāo)本載玻片浸入008 mol／L的鹽酸（HCl）內(nèi)變性 7 min；然后浸入精子裂解液內(nèi)（pH 73）20 min。（3）脫水：然后將標(biāo)本載玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脫水。（4）染色：在標(biāo)本上滴 50 ml（2μg／ml）DAPI染色，立即在熒光顯微鏡下觀察。如用普通光學(xué)顯微鏡觀察，需進(jìn)行瑞氏姬姆薩染色。（5）結(jié)果判斷：計數(shù)500個精子，觀察精子光暈大小。根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無光暈4個等級，大和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。小光暈以≤精子頭直徑1／4為判斷標(biāo)準(zhǔn)，中光暈＞精子頭直徑四分之一而≤精子頭直徑2／3，大光暈＞精子頭直徑 2／3。

8精子頂體酶活性檢測：按照深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供的試劑盒說明書（改良Kennedy法）進(jìn)行檢測。

9精液EGF檢測：按照南京建成生物工程研究所［Bioengineering Institute of Nanjing Jiancheng（Nanjing，Jiangsu，China）］提供的試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

10統(tǒng)計學(xué)處理：采用 SPSS 130統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗，p＜005為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1THT試驗前后陰囊、睪丸改變及性生活情況：每次THT試驗后陰囊皮膚輕微發(fā)紅，無其他損傷，睪丸張力在1個月時無改變，2～3個月時有個別受試者睪丸張力輕微減低，睪丸大小無明顯改變。THT試驗前后性生活均正常，無改變。

2THT試驗前后精子濃度、活動率、正常形態(tài)精子、HOS結(jié)果：試驗1、2、3個月和停止THT試驗1個月后的精子濃度、活動率、正常形態(tài)精子及正常HOS與THT試驗前比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；停止THT試驗2、3個月后的精子濃度、活動率與THT試驗前比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。THT試驗1個月后有1例出現(xiàn)無精子，2個月后精子密度下降到15×106／ml以下 5例（167%，5／30），精子活動率 ＜20%11例（367%，11／30）；3個月后，精子密度下降到 15×106／ml以下 6例（200%，6／30），精子活動率 ＜20%9例（300%，9／30）。停止THT試驗1個月后精子密度仍＜15×106／ml 2例（66%，2／30），精子活動率 ＜20%2例（66%，2／30）。停止THT試驗2個月后正常形態(tài)精子及SCD均恢復(fù)到試驗前水平，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。停止THT試驗2個月和3個月分別有2例和6例受試者失訪。

表1 THT試驗前、后各項數(shù)據(jù)比較（x±s）

3THT試驗前后血清生殖內(nèi)分泌激素T、FSH、LH及SCD測定結(jié)果：THT試驗1個月后精液量、血清LH及FSH較試驗前無變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；血清睪酮（T）水平比試驗前明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。THT試驗3個月后精液量、T水平明顯低于試驗前，LH和FSH高于試驗前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。停止THT試驗3個月后，精液量、T、FSH、LH均恢復(fù)到試驗前水平。SCD實驗顯示，試驗1個月、2個月和3個月后，精子DNA完整比率較試驗前下降明顯，停止試驗1個月后精子DNA完整比率下降仍然非常明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；停止試驗2、3個月后精子DNA完整比率與試驗前無差異，見表1。

4精子頂體酶活性及精液表皮生長因子（EGF）改變：THT試驗 1、2、3個月及停試驗 1、2個月后精子頂體酶活性比試驗前下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；停止試驗2個月后上述各項指標(biāo)又恢復(fù)到試驗前水平。試驗前后EGF含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 THT試驗前后精子頂體酶活性及表皮生長因子改變（珋x±s）

討論

精子發(fā)生是在比體溫低4～5℃的陰囊內(nèi)完成。隱睪癥患者不育，長期處于高溫工作環(huán)境下的青年男性生育力下降，43℃局部溫浴睪丸誘發(fā)生精細(xì)胞凋亡，精液中精子數(shù)下降，提示溫度影響精子發(fā)生［2］。Guo等［6］建立了兩種“熱壓”動物模型：（1）通過隱睪手術(shù)將一側(cè)睪丸移入腹腔，對側(cè)睪丸留在陰囊作為對照。對大鼠和恒河猴的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隱睪后1～5周睪丸內(nèi)圓形精子和變態(tài)精子幾乎全部凋亡，而精原細(xì)胞不受影響；（2）另一種動物模型就是將睪丸局部浸入43℃溫水中每天溫浴30 min，每天一次，連續(xù)2天。在終止溫浴的1個月內(nèi)，精液中的精子數(shù)目比溫浴前降低了80%，熱激處理后84天，恢復(fù)正常的生精過程。熱激不僅直接誘發(fā)生精細(xì)胞凋亡［4］，且也可通過影響支持細(xì)胞去分化過程促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡。實驗證實，這兩個過程都是可逆的。本試驗顯示，THT試驗1～3個月后精子數(shù)量、活動率、精子正常形態(tài)、精子DNA完整率及精子頂體酶活性開始下降，與試驗前比較有差異。實驗1個月后有1例出現(xiàn)無精子，即馬上減低陰囊加熱溫度，從43℃加05℃度降低到41℃，防止睪丸造成不可逆損傷。精子濃度、活動率和正常形態(tài)在試驗2個月后開始下降，這可能與人的生精過程有關(guān)。因為一個生精周期大約需要70天。控制性和短時的外界溫度的升高，對抑制人類睪丸精子產(chǎn)生是一個相對緩慢的過程，可能是機體在環(huán)境條件改變的情況下，進(jìn)行的自身緩慢調(diào)節(jié)，是適應(yīng)生理反應(yīng)和生理閾值的。如果是超高溫和硬性損傷，超過了機體生理閾值范圍，就可能導(dǎo)致睪丸永久失去生精功能，破壞睪丸的生精過程。因此，從停止THT試驗結(jié)果可知，精子密度、活動率和精子DNA完整率都能夠在停止2個月后（60 d）恢復(fù)，說明睪丸實體組織沒有受到不可逆性的損害。THT與其他方法（小劑量激素或體外殺精子劑）聯(lián)合應(yīng)用，是有其避孕價值的，也為男性參與計劃生育提供了一種可行和有效的方法。

研究表明，“熱壓”不明顯影響實驗動物體內(nèi)FSH和 LH變化［2，6］。隱睪手術(shù)后外周血睪酮（T）水平從第1天起明顯降低，之后一直保持較低水平，這可能與孤兒受體LHR1和LXRs在睪丸中表達(dá)異常有關(guān)。本研究通過對志愿受試者的試驗觀察，試驗1個月后血清水平明顯增高，可能與試驗剛開始機體保護性反應(yīng)有關(guān)，實驗3個月后，血清T明顯下降，LH及FSH水平明顯增高，與試驗前比較有差異。精漿EGF水平無明顯改變，說明THT對睪丸上皮細(xì)胞的影響不大。

初步試驗證明，睪丸“熱壓”主要影響早ⅠⅣ和晚ⅫⅩⅣ期生精細(xì)胞的凋亡。Guo等［6］對60余只食蟹猴的實驗證實，43℃局部溫浴睪丸合并長效睪酮埋植對生精細(xì)胞凋亡則有疊加效應(yīng)，處理后到28 d后即可達(dá)到避孕目的，到40＋d后達(dá)到無精效果。在84 d，抽出睪酮埋植膠囊，到144 d精液中精子數(shù)恢復(fù)處理前水平。這些發(fā)現(xiàn)為設(shè)計簡單方便的睪丸熱壓避孕或熱壓組合長效睪酮男性避孕措施提供了重要的可行的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。本研究觀察到人THT 1個月、2個月和3個月后，精子正常形態(tài)和精子DNA完整率明顯下降，說明THT能夠?qū)有螒B(tài)和精子DNA造成損傷。

睪丸熱壓試驗是為男性參與計劃生育提供參考數(shù)據(jù)，真正用于臨床男性避孕還需要與其他避孕方法聯(lián)合應(yīng)用以加強避孕效果。但目前能夠用于男性避孕節(jié)育的方法不多，而控制人口數(shù)量仍然是我國計劃生育長期的目標(biāo)。通過睪丸溫浴引起精子質(zhì)量下降達(dá)到避孕目的。本文進(jìn)行了初步臨床試驗，特別是睪丸溫浴后精子DNA、形態(tài)及功能等變化，也可能為男性不育的研究提供一些參考數(shù)據(jù)。睪丸局部溫度過高在人類1個月即可出現(xiàn)精子功能、DNA、結(jié)構(gòu)及數(shù)量的異常，個別可達(dá)無精子狀態(tài)。因此，不育男性應(yīng)該引起注意，避免較長時間在高于體溫環(huán)境下生活或工作。

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