姜力文, 聶鴻濤, 李東東, 霍忠明, 李妹妍, 閆喜武

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 遼寧省貝類(lèi)良種繁育工程技術(shù)研究中心, 遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)之一。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)顯示, 2016年全世界蛤仔產(chǎn)量約400萬(wàn)t, 我國(guó)大陸沿海養(yǎng)殖蛤仔產(chǎn)量約占 90%[1]。在海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)中, 殼色的繽紛多彩倍受人們關(guān)注, 人們更愿意選擇色彩豐富的貝類(lèi), 隨之提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值, 以殼色為目標(biāo)性狀進(jìn)行定向選育, 對(duì)貝類(lèi)遺傳育種有重要指導(dǎo)意義。

酪氨酸酶(單酚, DOPA; 氧化還原酶, tyrosinase,E.C.1.14.18.1)是一種含銅金屬酶, 主要作用酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成多巴, 多巴氧化形成多巴醌反應(yīng), 同時(shí)多巴醌能自發(fā)地相互反應(yīng)或與氨基反應(yīng),使相關(guān)蛋白相互交聯(lián), 形成具有化學(xué)惰性的深色不溶性蛋白聚合物[2-4], 在哺乳動(dòng)物酪氨酸酶催化產(chǎn)生的黑色素被分泌進(jìn)入到表皮和毛發(fā)的角質(zhì)細(xì)胞中,使體表著色, 從而起保護(hù)皮膚和眼睛、抵御紫外線(xiàn)的輻射和防止內(nèi)部組織過(guò)熱等作用[5]。在雙殼類(lèi)動(dòng)物中TYR基因的研究也一直在進(jìn)行, 在牡蠣的4種殼色研究中表明酪氨酸酶與金色殼色形成有關(guān)[6]。目前在扇貝研究中報(bào)道, 酪氨酸酶家族可能參與生物礦化和黑色素的生物合成[7]。Yu等[8]克隆了長(zhǎng)牡蠣的酪氨酸酶基因, 并對(duì)其各個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析, 研究表明酪氨酸酶在色素帶中的含量最多。Huan等[9]在長(zhǎng)牡蠣稚貝中克隆和分析了酪氨酸酶表達(dá), 表明酪氨酸酶可能參與早期幼蟲(chóng)殼的形成。井巖[10]克隆獲得文蛤 TYR基因 cDNA全長(zhǎng), 并利用熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法對(duì)4種不同殼色文蛤中 TYR基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析, 表明 TYR基因在黑殼中表達(dá)量最高, 為以后利用殼色作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行品種改良與雜交育種提供理論基礎(chǔ)。在合浦珠母貝傷口愈合過(guò)程中, 酪氨酸酶均在外套膜中特異性表達(dá), 推測(cè)參與了角質(zhì)層及外殼柱狀層形成[11]。其中最主要的是酪氨酸酶控制黑色素細(xì)胞的活性, 是黑色素合成的關(guān)鍵酶之一[12]。在菲律賓蛤仔中, 還未有對(duì)TYR基因表達(dá)特性的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)二代測(cè)序得到菲律賓蛤仔TYR基因,并對(duì)不同殼色蛤仔及不同組織進(jìn)行相對(duì)定量分析,分析不同殼色蛤仔 TYR基因的表達(dá)特性, 以期揭示色素控制基因與殼色及組織之間關(guān)系, 為下一步深入研究其不同殼色表達(dá)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用 4種殼色菲律賓蛤仔, 分別為: 斑馬蛤(Z)、白斑馬蛤(WZ)、白蛤(W)和橙蛤(O)。2005年從福建莆田野生菲律賓蛤仔群體中采用選育技術(shù), 經(jīng)過(guò)連續(xù)7代選育而成。獲得具有穩(wěn)定性狀的個(gè)體。采自瓦房店養(yǎng)殖場(chǎng)基地殼長(zhǎng)20.0 mm±0.5 mm。在實(shí)驗(yàn)室中暫養(yǎng)2周, 每種殼色取3個(gè)個(gè)體作為生物學(xué)重復(fù), 對(duì)每個(gè)個(gè)體的7種不同組織分別進(jìn)行分析。7種組織分別為:鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、水管、性腺和消化腺。

1.2　序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

取約 0.03 g組織, 利用試劑盒海洋動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根)提取樣本總 RNA, 并在提取過(guò)程中用 RNase-Free DNase Set(天根)去除DNA。檢測(cè)總RNA濃度后, 利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)菲律賓蛤仔TYR基因保守區(qū)域使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒 (Axygen Bioscience)純化, 送到公司(上海生工)測(cè)序。利用Clustal X 2將蛤仔TYR蛋白序列與現(xiàn)有GenBank中的TYR蛋白序列進(jìn)行完全比對(duì)分析[13], 然后用MEGA 5.05[14]以鄰接法 (Neighbor-Joining, NJ)和Poisson模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 設(shè)置 Bootstrap重復(fù)分析1 000次[15]。

1.3　TYR基因相對(duì)定量分析和數(shù)據(jù)處理

根據(jù)菲律賓蛤仔TYR基因序列設(shè)計(jì)熒光定量擴(kuò)增引物 (表1)。以β-actin為內(nèi)參基因, 檢測(cè)4種殼色菲律賓蛤仔以及不同組織中TYR基因的表達(dá)水平。用TaKaRa SYBR Green Premix Ex TaqTM||試劑盒。在羅氏熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng), 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣品。熒光定量采用兩步法, PCR程序: 94℃ 30 s,94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40 個(gè)循環(huán); 溶解。用 2–ΔΔCt法處理各基因熒光定量所得數(shù)據(jù), 并用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 當(dāng) P<0.05時(shí), 表示差異顯著。

表1　TYR基因熒光定量引物Tab. 1 Primers used in TYR quantitative real-time PCR

2　結(jié)果

2.1　菲律賓蛤仔TYR基因序列多重比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

使用 Clustal X 2軟件將測(cè)序結(jié)果與其他物種TYR基因進(jìn)行多序列比對(duì), 其中測(cè)序得到的TYR3基因?yàn)?80 bp, TYR10基因?yàn)?50 bp。實(shí)驗(yàn)測(cè)序所得到的序列與之前設(shè)計(jì)引物的序列一致。發(fā)現(xiàn) TYR3與TYR10的同源性為48%。TYR3與馬氏珠母貝(Pinctada martensii)同源性最高為 64%, 其次為大珠母貝(Pinctada maxima)為63%。TYR10與加州雙斑蛸(Octopus bimaculoides)同源性最高, 為53%, 其次為大珠母貝(Pinctada maxima)為51%。均具有同源性(圖1)。

圖2為 TYR基因進(jìn)化樹(shù)。由圖可知, 菲律賓蛤仔的TYR3與TYR10最先聚為一支, 菲律賓蛤仔與長(zhǎng)牡蠣進(jìn)化關(guān)系最近, 遺傳距離最小, 最先聚為一支,再與珠母貝和合浦珠母貝聚為一支, 然后與其余貝類(lèi)聚為一支, 最后再與脊椎動(dòng)物聚為一大支。

圖1　菲律賓蛤仔TYR3和TYR10與其他物種 TYR 氨基酸序列多序列比對(duì)Fig. 1 Multiple alignment of the TYR3 and TYR10 amino acid sequence between Ruditapes philippinarum and other species

2.2　TYR基因在不同組織中的表達(dá)模式

TYR2基因在蛤仔7種組織中均有表達(dá), 在鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、性腺、內(nèi)臟團(tuán)以及水管的表達(dá)量不盡相同(圖 3)。TYR2基因在橙蛤的外套膜中表達(dá)量最高, 除白蛤外其他殼色的外套膜表達(dá)量也較高,與其他組織表達(dá)量差異顯著(P < 0.05)。鰓和唇瓣表達(dá)量次之?？傮w來(lái)說(shuō), TYR2基因在不同殼色蛤仔的7個(gè)組織中表達(dá)量最高的為外套膜, 閉殼肌中表達(dá)量最低。

2.3　TYR基因在四種殼色蛤仔外套膜中的表達(dá)模式

菲律賓蛤仔TYR基因在4種殼色外套膜中的表達(dá)量如圖4所示。不同TYR基因在4種殼色中均有表達(dá)。TYR2、TYR3、TYR6和TYR9基因均在白斑馬蛤仔殼色中有較高表達(dá), 同時(shí)與斑馬蛤和白蛤均差異顯著(P < 0.05)。TYR2、TYR6、TYR9、TYR10 和TYR11基因均在橙蛤中表達(dá)量較高, 其中 TYR2,TYR6和TYR10在橙蛤中表達(dá)量最高, 同時(shí)與斑馬蛤和白蛤均差異顯著(P < 0.05)。TYR11在斑馬蛤中表達(dá)量最高, 與白斑馬蛤和斑馬蛤殼色差異顯著(P <0.05)。(圖 4)。

3　討論

圖2　菲律賓蛤仔 TYR3和TYR10與其他物種TYR 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of the TYR amino acid sequences between R. philippinarum and other species

圖3　菲律賓蛤仔不同殼色TYR2基因在7種組織的表達(dá)量Fig. 3 Expression of TYR2 in seven tissues of four shell color strains of Manila clam

在貝類(lèi)的發(fā)育過(guò)程中, 外套膜外表皮細(xì)胞中色素細(xì)胞不斷分泌色素顆粒, 色素顆粒通過(guò)微絨毛到達(dá)外套膜的表面聚集形成色素帶, 從而能夠在貝殼的表面形成不同的顏色花紋[16-17]。菲律賓蛤仔外套膜位于左右貝殼內(nèi)面, 從軟體部背側(cè)向腹側(cè)伸展,將內(nèi)臟團(tuán), 鰓等包圍起來(lái)。本研究發(fā)現(xiàn) 6個(gè) TYR基因在不同殼色外套膜中具有不同的表達(dá)特性, 可能是由于菲律賓蛤仔復(fù)雜的花紋, 在不同的殼色性狀中, 都有黑色素合成過(guò)程。進(jìn)一步驗(yàn)證酪氨酸酶與黑色素形成的關(guān)系。不同TYR基因在4種殼色中均有表達(dá)。TYR2、TYR3、TYR6和TYR9基因均在白斑馬蛤外套膜中有較高表達(dá), 白斑馬蛤作為斑馬蛤和白蛤的雜交后代, 具有抗逆性強(qiáng)等雜種優(yōu)勢(shì)[18]。TYR基因在白斑馬蛤中高表達(dá)可能由于雜種優(yōu)勢(shì), 與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。Mu?oz等[19]研究發(fā)現(xiàn), 用寄生蟲(chóng)感染3種雙殼類(lèi), 發(fā)現(xiàn)感染組的血淋巴以及血細(xì)胞中酪氨酸活性比對(duì)照組顯著增加, 證明了酪氨酸酶參與了貝類(lèi)天然免疫反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中, 褐黑色素能使毛發(fā)或皮膚表現(xiàn)為黃色和紅色, 真黑素表現(xiàn)為褐色和黑色, 它們的相對(duì)數(shù)量與分布決定了顏色深淺等多種表型[20-21]。橙蛤作為一種特殊的顏色性狀, TYR2、TYR6、TYR9、TYR10和TYR11基因均在橙蛤中表達(dá)量較高, 推測(cè)酪氨酸酶可能與橙蛤中橙色的形成有關(guān)。這與之前酪氨酸酶基因在金色牡蠣中表達(dá)量高的結(jié)果相似[11]。但酪氨酸酶在非黑色素細(xì)胞的作用尚不明確, 仍需進(jìn)一步研究。TYR11在斑馬蛤中表達(dá) 量最高, 可能與背景色形成有關(guān)。

圖4　 不同TYR基因在4種殼色蛤仔外套膜中的表達(dá)量Fig. 4 Analysis of expression difference of different TYR gene in the mautle of different shell colors of Ruditapes philippinarum

TYR基因在蛤仔7種組織中表達(dá)量有顯著差異,TYR2基因在外套膜和鰓中表達(dá)量較高, 可能與不同組織的功能有關(guān)。外套膜不斷分泌色素及殼形成相關(guān)成分, 鰓除了呼吸濾水外, 也是主要的免疫器官,可以調(diào)節(jié)自身免疫, TYR基因也有可能參與了免疫調(diào)節(jié)作用, 在其他物種中已被驗(yàn)證[22-23]。酪氨酸酶基因除黑色素形成機(jī)制外, 與免疫, 生長(zhǎng)等都有密切聯(lián)系。在光滑雙臍螺卵塊中檢測(cè)到了酪氨酸酶活性, 說(shuō)明與卵泡形成有著密切關(guān)系[24]。同時(shí)在貝類(lèi)足絲中也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸酶的存在, 說(shuō)明酪氨酸酶與軟體動(dòng)物足絲形成有關(guān)[25]。

綜上, 本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR研究了TYR基因在不同殼色蛤仔和不同組織中的表達(dá)特性,驗(yàn)證酪氨酸酶基因與黑色素形成的關(guān)系, 同時(shí)推測(cè)了酪氨酸酶基因與非黑色素形成的關(guān)系, 以及不同組織中酪氨酸酶基因表達(dá)量的變化。為進(jìn)一步對(duì)菲律賓蛤仔殼色的遺傳機(jī)制研究提供參考。

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