姚方杰 于 婭 方 明 王 鵬 魯麗鑫 張友民* 張偉彤 姚允武

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黑木耳菌種區(qū)別性鑒定的對(duì)峙培養(yǎng)法及其應(yīng)用

姚方杰1于 婭1方 明1王 鵬1魯麗鑫1張友民1*張偉彤1姚允武2

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2. 吉林省海外農(nóng)業(yè)投資開(kāi)發(fā)集團(tuán)有限公司，吉林長(zhǎng)春 130000）

著重介紹黑木耳菌種區(qū)別性（供檢菌種和對(duì)照菌種的不符合性）鑒定的對(duì)峙培養(yǎng)法及其術(shù)語(yǔ)、定義和原理，試劑、材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法，以及效果。

黑木耳；菌種；區(qū)別性；鑒定；對(duì)峙培養(yǎng)法

黑木耳（）具有獨(dú)特生態(tài)、保健功能和極高比較效益（為水稻和玉米的10～15倍）。21世紀(jì)以來(lái)，以創(chuàng)新的“全光間歇彌霧栽培模式”為產(chǎn)業(yè)化載體，使黑木耳實(shí)現(xiàn)了“北耳南擴(kuò)”的產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略[1]，產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅速上升為我國(guó)第二大類(lèi)食用菌。2014年我國(guó)年產(chǎn)黑木耳579萬(wàn)噸，占食用菌總產(chǎn)量的17.71%。伴隨著黑木耳產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，菌種使用量急劇增加，黑木耳菌種市場(chǎng)混亂，出現(xiàn)惡意侵權(quán)、同物異名、同名異物等現(xiàn)象，給引種、栽培和開(kāi)發(fā)利用帶來(lái)諸多困難，導(dǎo)致產(chǎn)量低下，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，危及黑木耳產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2,3]。

科學(xué)的菌種鑒定是食用菌品種審定和生產(chǎn)應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，涉及知識(shí)面廣、技術(shù)性強(qiáng)，受到國(guó)際上的高度重視。然而，我國(guó)從國(guó)家層面到各地方，尚未建立科學(xué)有效的黑木耳菌種鑒定方法。雖曾發(fā)布實(shí)施通用的食用菌菌種區(qū)別性及真實(shí)性鑒定方法，但經(jīng)本項(xiàng)目組及同行們的研究，發(fā)現(xiàn)其主要參數(shù)不符合黑木耳菌種特性。因此，作者所在團(tuán)隊(duì)根據(jù)對(duì)100余個(gè)黑木耳菌株的試驗(yàn)及查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，采用體細(xì)胞不親和性等方法，從細(xì)胞學(xué)水平、生化水平和DNA水平對(duì)黑木耳菌種進(jìn)行區(qū)別性鑒定，以期為《全國(guó)食用菌菌種管理辦法》的貫徹執(zhí)行，防止菌種混雜退化，充分發(fā)揮優(yōu)良菌種種性，以及保護(hù)菌種知識(shí)產(chǎn)權(quán)提供規(guī)范的方法與技術(shù)支持，推動(dòng)我國(guó)食用菌菌種可追溯制度的建立與實(shí)施，促進(jìn)黑木耳乃至所有食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

菌種區(qū)別性是指供檢菌種與對(duì)照菌種的不符合性，對(duì)峙培養(yǎng)法是檢測(cè)食用菌菌種區(qū)別性的科學(xué)實(shí)用方法。該方法引用食用菌菌種區(qū)別性鑒定-拮抗反應(yīng)（NY/T 1845）標(biāo)準(zhǔn)，適用于黑木耳菌種區(qū)別性鑒定。

1 術(shù)語(yǔ)和定義

NY/T 1845界定的，以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文。為了便于使用，以下重復(fù)列出了NY/T 1845中的某些術(shù)語(yǔ)和定義。

（1）黑木耳（）。木耳科，子實(shí)體膠質(zhì)，朵型分為菊花型或簇生型，耳片黑色、褐色、灰色，子實(shí)層光滑或有褶皺。（2）菌種區(qū)別性（distinctness of spawn）。供檢菌種和對(duì)照菌種的不符合性[4]。（3）隆起型（ridgy）。對(duì)峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處菌絲隆起[4]。（4）溝壑型（chimb）。對(duì)峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌絲在交界處分別密集或稍微隆起，兩隆起之間出現(xiàn)一條溝壑狀分隔線(xiàn)。（5）色線(xiàn)型（color bar）。對(duì)峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處形成一條色素分界線(xiàn)。（6）隔離型（dividing line）。對(duì)峙培養(yǎng)的黑木耳菌株間拮抗表現(xiàn)特征之一，表現(xiàn)為兩菌株菌落交界處出現(xiàn)一條無(wú)菌絲的帶狀分隔區(qū)。

2 原 理

兩個(gè)不同的菌株對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)發(fā)生拮抗反應(yīng)，是黑木耳菌株識(shí)別異己保持群體遺傳多樣性的反映。它是由基因組內(nèi)異核體不親和位點(diǎn)控制的。當(dāng)不親和的兩個(gè)菌株對(duì)峙培養(yǎng)時(shí)，在菌株交界處形成隆起、溝壑、色線(xiàn)或隔離，產(chǎn)生拮抗，防止遺傳上明顯不同的個(gè)體間菌絲融合，以保持個(gè)體遺傳上的獨(dú)立和穩(wěn)定。

3 試劑、材料和儀器設(shè)備

培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），其中馬鈴薯200 g（用浸出汁），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水或相當(dāng)純度的水1000 mL，pH?值自然。生化恒溫培養(yǎng)箱：精度±0.1 ℃。分析天平：感量0.01 g。

4 試驗(yàn)步驟

供檢黑木耳菌株與對(duì)照菌株在相同條件下培養(yǎng)，將固體菌種從試管斜面接種到直徑?90 mm的固體PDA平板上，25 ℃?避光培養(yǎng)?15天。

（1）接種組合與重復(fù)次數(shù)。黑木耳供檢菌株與對(duì)照菌株的拮抗反應(yīng)接種組合為?3?組，每組重復(fù)?3?次。第一組：供檢菌株與對(duì)照菌株對(duì)峙培養(yǎng)；第二組：供檢菌株與供檢菌株對(duì)峙培養(yǎng)；第三組：對(duì)照菌株與對(duì)照菌株對(duì)峙培養(yǎng)。

（2）接種操作。嚴(yán)格按無(wú)菌操作，用直徑?5 mm?打孔器分別打取活化后適齡的黑木耳供檢菌株與對(duì)照菌株菌落邊緣做接種塊。菌絲朝上，兩接種塊間隔?30 mm，置于平板中心位置。

（3）培養(yǎng)條件。在通風(fēng)、避光、溫度為?25 ℃?條件下培養(yǎng)至接種塊菌絲間接觸，約需?20?～25天。

（4）數(shù)據(jù)處理。在自然光下，觀察對(duì)峙培養(yǎng)的兩株菌落交界處菌絲，有隆起型、溝壑型、色線(xiàn)型、隔離型四者之一的拮抗反應(yīng)，判定為不同菌株[5]。

5 討 論

我國(guó)是黑木耳生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，占世界產(chǎn)量的98%以上[6]。世界上其他國(guó)家沒(méi)對(duì)黑木耳此類(lèi)的專(zhuān)項(xiàng)研究，因此也就沒(méi)有相對(duì)有效的方法可以借鑒或者直接利用。國(guó)內(nèi)迄今也尚無(wú)黑木耳菌種區(qū)別性鑒定的相關(guān)方法的報(bào)道。

目前，對(duì)于黑木耳菌種的區(qū)別性鑒定主要采用對(duì)峙培養(yǎng)法、RAMP法和ITS PCR-RFLP法。其中，賈定洪于2010年采用ITSPCR-RFLP方法對(duì)5個(gè)野生木耳屬菌株進(jìn)行分析，通過(guò)6個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化獲得了20條多態(tài)性DNA條帶，使用NTSYSpc2.1生物軟件對(duì)DNA條帶信息進(jìn)行分析，結(jié)果表明，ITSPCR-RFLP技術(shù)可為區(qū)別黑木耳和毛木耳菌株提供重要信息[7,8]。湯海峰利用RAMP法標(biāo)記鑒定在吉林省黑木耳生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的品種，對(duì)22個(gè)黑木耳品種比較分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中存在同種異名現(xiàn)象[9,10]。但是上述兩種方法操作起來(lái)相比對(duì)峙培養(yǎng)法要復(fù)雜，標(biāo)記過(guò)程會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力，并且對(duì)操作技術(shù)的要求很高，不適合普遍推廣。而采用對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行黑木耳區(qū)別性鑒定，操作方便、成本低，且鑒定結(jié)果易于觀察，更適合推廣使用。如陳影等和方明等在進(jìn)行木耳的新品種選育過(guò)程中運(yùn)用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)黑木耳進(jìn)行區(qū)別性鑒定，通過(guò)觀察菌落交界處的拮抗反應(yīng)進(jìn)行前期試驗(yàn)，從而簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟[11, 12]。孫露在2010年研究黑木耳種質(zhì)資源多樣性時(shí)也采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)黑木耳菌種進(jìn)行區(qū)別性鑒定[13]。

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2095-0934（2017）03-163-03

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（CARS-24）

*通訊作者：張友民，男，教授，現(xiàn)從事植物學(xué)和植物生態(tài)研究工作。E-mail：zhangymf@yahoo.com.cn