劉順才 吳 琪 邢 鵬 夏志蘭
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茯苓種質(zhì)資源的研究進(jìn)展綜述
劉順才 吳 琪 邢 鵬 夏志蘭*
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南 長沙 410128)
茯苓以其較高的藥用價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值及獨(dú)特的保健作用而備受關(guān)注,科研工作者在茯苓種質(zhì)資源、有效成分檢測等方面的研究已取得一定成果。介紹茯苓的研究現(xiàn)狀和對(duì)茯苓基礎(chǔ)遺傳特性、種質(zhì)資源多樣性及有效成分含量檢測等方面所取得的研究成果,分析指出在茯苓種質(zhì)資源研究方面存在的問題。
茯苓;種質(zhì)資源;茯苓多糖;研究進(jìn)展
茯苓()隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、茯苓屬,又名茯靈、茯菟、松柏芋等[1]。根據(jù)產(chǎn)地的不同,又稱為云苓、安苓、閩苓、川苓等。野生茯苓常寄生在松科植物赤松或馬尾松的根部。日常所用的茯苓均為茯苓的菌核。我國人工栽培茯苓已有 1 500余年歷史,傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)為鄂、豫、皖交界的大別山區(qū),近年來貴州、福建、廣東、廣西、浙江、湖南、四川、云南等省均迅速發(fā)展[2]。
茯苓是我國傳統(tǒng)的常用中藥,《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為“上品”。茯苓具有益氣寧心、健脾胃、除濕熱、行水止瀉的功效,其味甘、淡,性平,歸心、肺、脾、腎經(jīng)。主要用于治療脾虛食少、水腫尿少、痰飲眩暈、便溏瀉泄、心神不安、驚悸失眠等癥[3~5]。茯苓的主要成分為茯苓多糖、三萜類化合物,以及少量的脂肪酸等[6,7]。據(jù)報(bào)道,從茯苓中提取的茯苓多糖、茯苓異多糖等具有促進(jìn)細(xì)胞分裂、補(bǔ)體激活、抗誘變、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等生物活性。近年來,隨著近代醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,茯苓以其較高的藥用價(jià)值,不僅成為多種中藥方劑配伍的重要成分,配伍率達(dá)70%以上,而且是眾多中成藥的重要原料,有“十藥九茯苓”之說[8]。其營養(yǎng)、保健及藥用價(jià)值久負(fù)盛名,具有廣闊的應(yīng)用前景。
1.1 分布
茯苓適應(yīng)能力強(qiáng),野生資源分布廣泛,以中國、日本、印度等一些東南亞國家分布較多,美洲及大洋洲等國家和地區(qū)也有分布。我國幅員遼闊、地形復(fù)雜、氣候多變,優(yōu)越的自然條件形成了豐富的茯苓種質(zhì)資源。黃河以南的湖南、廣西、湖北、福建、安徽、云南、四川、河南、廣東、浙江、貴州、山西、陜西等10多個(gè)省都有分布。我國是茯苓主產(chǎn)國,產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的70%。目前的茯苓產(chǎn)品以人工栽培為主。傳統(tǒng)茯苓產(chǎn)品以云南的“云苓”、安徽的“安苓”、福建的“閩苓”最為著名,湖北羅田、英山、麻城的“九資河茯苓”也較出名。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們較為關(guān)注茯苓種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用[9]。如中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CGMCC)、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所中國林業(yè)微生物菌種保藏中心(CFCC)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物菌種資源保藏和利用中心(CCAM)等科研單位都已建立了茯苓種質(zhì)資源庫,一些種質(zhì)資源比較豐富的地區(qū)也保藏許多茯苓種質(zhì)資源?,F(xiàn)今茯苓的栽培品種大約有40多個(gè),其中應(yīng)用較多的栽培種有:湖北的“同仁堂1號(hào)”,湖南的“湘靖28”,廣東的GIM5.99等。
1.2 開發(fā)與應(yīng)用歷史
據(jù)記載,茯苓的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用在我國已經(jīng)有2 000多年的歷史,但人工栽培的探索起源于1 500年前,歷經(jīng)千年探索和積累,至南宋時(shí)已較成熟,主要產(chǎn)區(qū)分布在山東、河南、陜西一帶。明代初期到20世紀(jì)70年代初期,在大別山一帶產(chǎn)區(qū)規(guī)模逐漸穩(wěn)定,形成了完備的栽培技術(shù)體系。主要特點(diǎn)是:栽培場、培養(yǎng)料提前進(jìn)行選擇和處理,并且使用鮮苓(新鮮菌核)作為種源(俗稱“肉引”)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖。20世紀(jì)70年代末至90年代末,栽培技術(shù)有了較大的改進(jìn),茯苓產(chǎn)區(qū)迅速擴(kuò)大,主要表現(xiàn)在采用人工分離培育的“菌種”代替?zhèn)鹘y(tǒng)的“肉引”作為種源。這一時(shí)期稱之為“菌種栽培期”。2000年后,為穩(wěn)定茯苓藥材質(zhì)量,全國推行茯苓規(guī)范化種植及GAP基地建設(shè)。湖北 “茯苓藥材規(guī)范化種植研究”攻關(guān)研發(fā)出“誘引”栽培專利技術(shù)及茯苓木接引培育方法,篩選的優(yōu)良菌株“同仁堂1號(hào)”得到了大面積的示范推廣,在英山、羅田、麻城等地形成了“九資河茯苓”基地。福建“茯苓松蔸栽培優(yōu)良菌株的選育及標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)的研究”和“茯苓松蔸GAP栽培關(guān)鍵技術(shù)研究”攻關(guān)項(xiàng)目,篩選出適宜茯苓松蔸栽培的優(yōu)良菌株“閩苓A5”,獲得“一種低碳高產(chǎn)栽培茯苓的方法”的發(fā)明專利,大面積推廣茯苓松蔸規(guī)范化栽培,實(shí)現(xiàn)茯苓產(chǎn)業(yè)發(fā)展與生態(tài)保護(hù)的和諧統(tǒng)一。
國內(nèi)外茯苓研究主要在藥理和藥效上,而對(duì)茯苓基本遺傳特性的研究仍較少。茯苓遺傳來源問題,仍存在比較大的分歧。余元廣等認(rèn)為茯苓擔(dān)孢子有正負(fù)性,單孢菌株的初生菌絲的細(xì)胞核不一定是單個(gè),也可能是多個(gè),茯苓是異宗結(jié)合擔(dān)子菌[10]。單毅生等的研究表明,茯苓菌絲體為有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的雙核菌絲,是一種二極性異宗結(jié)合真菌[11]。楊新美等報(bào)道稱茯苓是具有鎖狀聯(lián)合的異宗結(jié)合真菌[1]。寧平等通過對(duì)茯苓菌絲核及染色技術(shù)的研究,認(rèn)為茯苓菌絲是多核菌絲體,但仍無法辨別其菌絲是否具有鎖狀聯(lián)合[12]。日本菌物學(xué)者富永保人通過實(shí)驗(yàn)觀察,得出的結(jié)論是茯苓菌絲體為無隔膜無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的雙核菌絲,擔(dān)孢子為單核,是一種異宗結(jié)合真菌[13]。李霜等、熊杰等和王昭等的研究都表明,茯苓菌絲體為具有明顯隔膜無鎖狀聯(lián)合的多核菌絲[14~16]。李霜等以茯苓栽培種“大泡引”為研究材料,發(fā)現(xiàn)茯苓菌絲為無鎖狀聯(lián)合的多核茵絲,擔(dān)孢子中雙核孢子占75.3%、單核孢子占2.4%、無核孢子占22.3%,對(duì)30個(gè)單孢株進(jìn)行單孢配對(duì)結(jié)果,具拮抗現(xiàn)象占總數(shù)的26.7%,其菌株具有單孢結(jié)實(shí)現(xiàn)象,占單孢株總數(shù)的18%,結(jié)果初步推測茯苓菌為同宗結(jié)合真菌[14]。熊杰對(duì)茯苓的性模式進(jìn)行了系統(tǒng)研究,單孢配對(duì)試驗(yàn)結(jié)果表明,同一菌株和不同菌株的原生質(zhì)體分離株間的配對(duì)均能和諧生長,同一菌株的擔(dān)孢子間的配對(duì)均產(chǎn)生拮抗線,但其中有少數(shù)配對(duì)在交接區(qū)形成扇形區(qū)域,拮抗線隨后消失;而不同菌株擔(dān)孢子的配對(duì)全部形成穩(wěn)定的口欄型菌落。說明茯苓擔(dān)孢子中的兩個(gè)細(xì)胞核具有遺傳互補(bǔ)性,能表達(dá)成獨(dú)立個(gè)體的異雙核,由此推斷茯苓為次級(jí)同宗結(jié)合真菌[15]。徐雷應(yīng)用原生質(zhì)體技術(shù)結(jié)合同工譜分析研究,結(jié)果表明茯苓擔(dān)孢子中的2個(gè)核是異質(zhì)的,在原生質(zhì)體制備過程中能有效分離,產(chǎn)生兩種不同類型的單核或同核原生質(zhì)體分離株,并且這2個(gè)核具有遺傳互補(bǔ)性。鑒于其單個(gè)擔(dān)孢子可以完成生活史,推斷茯苓是一種次級(jí)同宗結(jié)合真菌[17]。熊歡和王曉霞的研究也得出茯苓是同宗結(jié)合真菌的結(jié)論[18, 19]。
茯苓種質(zhì)資源多樣性的研究起步雖然比較晚,但隨著同工酶以及DNA分子標(biāo)記技術(shù)在食用菌上的研究逐漸成熟,其種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究得到了廣泛的應(yīng)用。李劍采用酯酶同工酶和ISSR分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)我國茯苓栽培菌株及部分野生菌株的遺傳多樣性的分析結(jié)果,27個(gè)供試茯苓菌株共檢測到186條酯酶同工酶譜帶,每個(gè)菌株所具有的酶帶數(shù)為5~9條不等,多數(shù)為6~8條,27個(gè)供試菌株共有17種酶譜類型,其中部分菌株之間酶譜完全相同。聚類分析結(jié)果表明,在81%的相似水平上,供試的27個(gè)菌株可分為七個(gè)大類[20]。梁清樂通過對(duì)茯苓5個(gè)菌株的拮抗試驗(yàn),同工酶譜分析和生長速度及多糖產(chǎn)量的分析,顯示出不同菌株之間酶帶的差異,揭示了菌株間的遺傳差異[21]。程水明等對(duì)來自不同地域的12個(gè)茯苓菌株進(jìn)行了酯酶的酶譜多樣性分析[22],結(jié)果顯示羅田茯苓在栽培技術(shù)、種植環(huán)境、種質(zhì)資源等方面和其他地區(qū)相比具有明顯的優(yōu)勢。屈直等采用RAPD技術(shù)研究23個(gè)供試茯苓菌株的親緣關(guān)系結(jié)果表明:不同來源的茯苓菌株親緣關(guān)系非常相近,僅在某些引物的擴(kuò)增物上存在較小的差異[23]。賈定洪等利用ITS序列分析技術(shù)研究19個(gè)茯苓菌株的遺傳親緣關(guān)系的結(jié)果表明,17個(gè)茯苓菌株組成1個(gè)大群,2個(gè)菌株各自單獨(dú)聚為一個(gè)群[24]。謝賢安等利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)不同來源的茯苓菌株進(jìn)行指紋圖譜分析[25],蔡丹鳳應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)14個(gè)茯苓栽培菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果顯示:在53%的相似值時(shí)14個(gè)茯苓栽培菌株可分為2大類群,而在93%相似值時(shí)可分為13個(gè)類群[26]。蔡志欣對(duì)32個(gè)茯苓菌株進(jìn)行SRAP分析結(jié)果表明,32個(gè)茯苓菌株雖然源自不同地區(qū),但遺傳相似系數(shù)較高,表明32個(gè)茯苓菌株的整體遺傳背景較窄[27]。上述研究表明,不同來源和不同地區(qū)的茯苓菌株呈現(xiàn)出種質(zhì)資源的多樣性,應(yīng)用DNA分子標(biāo)記新技術(shù)可以清晰揭示出茯苓菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;NTSYS聚類分析表明有些來源于同一省份的菌株劃在同一類中,還有一些菌株的譜帶相似系數(shù)較高,親緣關(guān)系可能很近,推測有可能存在同種異名現(xiàn)象。
隨著研究技術(shù)的進(jìn)步,人們對(duì)茯苓的化學(xué)成分、藥理作用等的研究結(jié)果表明,其化學(xué)成分有多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶等[28],以多糖和三萜類化合物為主。茯苓多糖具有抗腫瘤、保肝、利尿、抗衰老、抗炎、降血脂、增強(qiáng)免疫、催眠等作用;茯苓三萜具有抗腫瘤、保肝、抗衰老、抗炎、增強(qiáng)免疫等作用[29]。李慧等研究茯苓多糖發(fā)酵過程中碳源、氮源、pH值對(duì)多糖積累的影響結(jié)果,葡萄糖、玉米粉、蛋白胨均有利于菌絲的生長和多糖的形成;通過實(shí)驗(yàn),還確定了茯苓多糖的最佳發(fā)酵工藝[30]。姜輝利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了菌絲體多糖的提取工藝[31]。豐朝霞等用分光光度法進(jìn)行茯苓多糖含量測定[32]。周燕霞等采用水煎煮、稀堿浸提茯苓中的多糖,通過正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝條件。結(jié)果表明,稀堿浸提茯苓中的多糖的工藝較為合理,其操作簡單,提取時(shí)間短,收率較高。并以苯酚-硫酸法制得有色糖醛衍生物,用分光光度法測定490 nm波長處吸光度,回歸方程線性關(guān)系好。方法簡單易行、穩(wěn)定、快速。很多研究者均采用硫酸-苯酚法測定茯苓多糖的含量,但提取方法各有不同,大多使用水提醇沉法,少數(shù)使用了稀堿法提取[33~42]。段啟等報(bào)道稱茯苓多糖運(yùn)用稀堿法提取效果最佳[36],衛(wèi)華等分別用水和稀堿為溶劑提取茯苓多糖,結(jié)果茯苓中水溶性多糖最高達(dá)7.03%,最低為 3.27%;堿溶性多糖最高達(dá) 92.72%,最低為65.85%。同時(shí)得出茯苓多糖在稀堿中的溶解度大于在水中的溶解度,茯苓中堿溶性多糖含量明顯高于水溶性多糖的結(jié)論[35]。這些研究提供了較穩(wěn)定的提取茯苓多糖及其檢測的方法,為今后的科研工作提供了較好的參考價(jià)值。
我國具有廣泛的茯苓資源,但由于我國茯苓種質(zhì)資源的研究工作起步較晚,沒有較好地保護(hù)野生種質(zhì)資源,導(dǎo)致野生茯苓被濫采濫挖。種質(zhì)資源是研究遺傳變異和進(jìn)行遺傳育種的重要材料,當(dāng)前的任務(wù)是加快建立茯苓野生資源保護(hù)區(qū),提高茯苓野生資源的儲(chǔ)量,促進(jìn)我國茯苓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。同時(shí)應(yīng)加快建立更加完善的茯苓種質(zhì)資源信息庫,深入開展生理生化指標(biāo)的研究和細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)方面的分析及DNA分子標(biāo)記分析等,以有效解決當(dāng)前國內(nèi)的茯苓菌種管理混亂、同種異名、同名異種的問題。
由于不同地域不同品種的茯苓中含有的有效成分不同,其應(yīng)用效果也有所差別,所以對(duì)茯苓有效成分含量的檢測是不可或缺的,其也有助于完善種質(zhì)資源信息,而高有效成分含量也可能成為將來的育種目標(biāo)之一。當(dāng)前茯苓生產(chǎn)中存在的許多問題仍不同程度地制約著茯苓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,只有加大科研力度,重視種質(zhì)資源的研究和創(chuàng)新,才能促進(jìn)茯苓產(chǎn)業(yè)的升級(jí)和可持續(xù)發(fā)展。
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Research progress ofgermplasm resources
Liu Shuncai Wu Qi Xing Peng Xia Zhilan*
(College of Horticulture and Landscape Architecture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Poria is of great concern for its high medicinal value, nutritional value and unique health care. Researchers have made some achievements in the research of Poria cocosaceous germplasm resources and active ingredient detection. This paper introduces the research status of Poria cocos, and expatiates on the research results of Poria cocosical genetic characteristics, germplasm resources diversity and active ingredient content detection, and analyzes the existing problems in the research of Poria germplasm resources for the future study.
; germplasm resources;polysaccharide; research progress
S567.3+2
A
2095-0934(2017)03-171-05
*為通訊作者