王文耀，張鴻飛，唐淼，王立超，劉龍龍

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 普通外科，河北 石家莊 050000）

肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約80%～90%是原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[1]，有研究數(shù)據(jù)顯示，肝癌的發(fā)病率和病死率均在惡性腫瘤的排名中靠前，全球每年約有60多萬(wàn)的新增肝癌患者，其中約有58萬(wàn)人死于肝癌[2]。肝癌是一種起源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，肝癌的最主要病因目前被認(rèn)為是病毒感染（例如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒）、非病毒因素（酒精以及黃曲霉素）以及遺傳性肝病和肝硬化[3]。在我國(guó)，目前肝癌的主要致病因素為乙型肝炎病毒[4]。目前雖然肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全闡明，但抑癌基因的異常失活以及癌基因的過(guò)度激活被認(rèn)為是造成肝癌發(fā)生的主要因素[5]。

微小RNA（miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，一般可以在轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[6]。近年來(lái)，很多研究[7-8]表明miRNA在各種生物學(xué)功能和疾病的調(diào)節(jié)方面起到重要的作用，某些miRNA的表達(dá)異常可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前有很多研究報(bào)道指出，肝癌的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后復(fù)發(fā)均與一系列特定的miRNA表達(dá)異常密切相關(guān)。因此通過(guò)對(duì)miRNA的研究可以為更好的發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)病機(jī)制、并且為肝癌的分子診斷治療提供理論依據(jù)、與此同時(shí)也可以作為判斷肝癌預(yù)后的新的標(biāo)準(zhǔn)。miR-21作為典型的致癌性miRNA被廣泛研究。有研究[9]表明，miR-21在很多腫瘤中存在過(guò)度表達(dá)的情況，例如乳腺癌、宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌以及肝癌中均有miR-21過(guò)表達(dá)的報(bào)道。miR-21的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，此外，也有研究[10]指出PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）可以作為miR-21的一個(gè)靶基因，miR-21通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。但是目前關(guān)于miR-21調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖情況的報(bào)道較少。

本研究通過(guò)分析119對(duì)肝癌標(biāo)本來(lái)檢驗(yàn)miR-21和PTEN在肝癌中的表達(dá)情況與它們之間的聯(lián)系，并且探討了miR-21在肝癌的發(fā)展中的作用。進(jìn)一步通過(guò)HepG2細(xì)胞進(jìn)行了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-21如何通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖，以期待由此能找到肝癌新的診療手段。

1 材料與方法

1.1 材料

119例術(shù)前未接受過(guò)放化療的經(jīng)診斷確診為肝癌的肝癌患者，取其腫瘤組織及癌旁組織，組織取下后置于液氮中備用。人肝癌HepG2細(xì)胞株（實(shí)驗(yàn)室凍存），DMEM培養(yǎng)基（hyclone，美國(guó)），胎牛血清（hyclone，美國(guó)），TRIzol（上海生工），氯仿（上海生工），異丙醇（上海生工），抗體:PTEN，cyclin D1，AKTpSer-473和GAPDH（美國(guó)Santa），SYBR Green（美國(guó)Promega）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在25 mL 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，并加入適量含10%胎牛血清的無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)液于5%CO2，37 ℃的孵箱條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 分別將miR-21模擬物及對(duì)照及miR-21抑制物及對(duì)照（上海吉?jiǎng)P生物）轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞中，培養(yǎng)12 h后，分別于0、12、24、36、48 h使用MTT方法測(cè)量細(xì)胞增殖情況，在490 nm處記錄吸光值。細(xì)胞增殖的抑制率計(jì)算公式為:抑制率=1-（劑量組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。miR-21模擬物:AGC TAA AAA TAG CTT ATC AGA CTG ATG TTG AG；miR-21反義序列:GAT CCT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA TTT TT。

1.2.3 雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 分別將miR-21模擬物及TK-PTEN與 PTEN WT及 PTEN DEL（PCR得到去除PTEN與miR-21結(jié)合的突變質(zhì)粒）共同轉(zhuǎn)染到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞中，將報(bào)告基因的細(xì)胞裂解液充分混勻，吸盡去除細(xì)胞培養(yǎng)液后可以直接加入報(bào)告基因細(xì)胞裂解液；充分裂解后，4 ℃ 下 10 000～15 000 g 離心 3～5 min，取上清用于測(cè)定。

1.2.4 Western blot 吸取 20～50 μg蛋白樣品，加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液 (6×Loading Buffer)，煮沸變性5 min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳濃縮膠電壓90 V，分離膠110 V，待溴酚藍(lán)電泳至凝膠的底部時(shí)停止電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗4 ℃過(guò)夜。二抗室溫1 h。

1.2.5 RT-PCR 取適量（50～100 mg）組織樣品粉碎組織，加1 mL TRIzol試劑在室溫下靜置1～5 min。加0.2 mL氯仿，振搖15 s，室溫靜置2～3 min。離心 15 min（12 000 g，2～8 ℃）。吸取上層水相，0.4～0.5 mL到新的Ep管中，加入0.5 mL異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置5～10 min。離心10 min（12 000 g，2～8 ℃）棄上清。加入75 %乙醇，振搖數(shù)次。離心5 min（7 500 g，2～8 ℃）。真空干燥后，用DEPC處理水30～40 μL溶解沉淀，55～60 ℃孵育 10～15 min。隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。所用引物為PTEN正向:5'-AGC TGG AAA GGG ACG AAC TG-3'，反向:5'-ACA CAC AGG TAA CGG CTG AG-3'；miR-21正向:5'-ACA CTC CAG CTG GGC CAG TGT TGG-3'，cyclin D1正 向:5'-CCG AGG AGC TGC TGC AAA TGG AG-3'，反向:5'-GAA ATC GTG CGG GGT CAT TGC G-3'；U6正向:5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，反向:5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'；GAPDH正向:5'-CATCCCTTCTCCCCACACAC-3'，反向:5'-AGT CCC AGG GCT TTG ATT TG-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。使用配對(duì)樣本檢驗(yàn)分析癌與癌旁組織的miR-21相對(duì)表達(dá)量的差異程度，使用Mann-Whitney 檢驗(yàn)分析miR-21相對(duì)表達(dá)量與肝癌患者臨床病理因素的相關(guān)性，使用Spearman's rank檢驗(yàn)分析miR-21相對(duì)表達(dá)量與PTEN相對(duì)表達(dá)量的關(guān)聯(lián)性。其中P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織中miR-21與PTEN的表達(dá)情況

RT-PCR結(jié)果顯示，肝癌患者的腫瘤組織中miR-21普遍高于癌旁組織，PTEN則相反（均P＜0.05）（圖1）；相關(guān)性分析顯示，miR-21與PTEN的表達(dá)具有一定相關(guān)性（r2=0.6767，P＜0.05）；報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中miR-21可以打靶PTEN并且抑制其表達(dá)（P＜0.05）（圖2）。

2.2 miR-21與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，miR-21的表達(dá)與肝癌患者AFP水平及TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

圖1 肝癌組織與癌旁組織中miR-21與PTEN的表達(dá)

圖2 miR-21對(duì)PTEN轉(zhuǎn)錄的抑制

表1 miR-21與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系分析

2.3 miR-21對(duì)響肝癌細(xì)胞增殖的影響

miR-21過(guò)表達(dá)后，肝癌細(xì)胞HepG2的增殖明顯增強(qiáng)，miR-21受到抑制后，肝癌細(xì)胞HepG2的增殖明顯抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同miR-21表達(dá)狀態(tài)HepG2細(xì)胞的增殖情況

2.4 miR-21對(duì)PTEN及其下游增殖相關(guān)通路蛋白的影響

miR-21過(guò)表達(dá)或抑制后，可以抑制或上調(diào)PTEN的表達(dá)，并影響其下游的Akt通路的磷酸化水平與cyclin D1的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 miR-21對(duì)PTEN及其下游增殖相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響 A:miR-21過(guò)表達(dá)；B:miR-21抑制

3 討 論

肝癌作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年的肝癌患者新增數(shù)量約占惡性腫瘤的4%，目前每年肝癌的新增病例超過(guò)62萬(wàn)例，肝癌的發(fā)病居惡性腫瘤的第6位，肝癌的病死率居腫瘤相關(guān)死亡的第3位[11]。目前我國(guó)的肝癌發(fā)病率在世界居高不下，我國(guó)的發(fā)病人數(shù)約占全球的50%以上，是國(guó)內(nèi)僅次于肺癌的腫瘤相關(guān)死亡疾病[12]。肝癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種細(xì)胞通路的異常調(diào)控，肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞相比會(huì)出現(xiàn)增殖、分化、凋亡與侵襲轉(zhuǎn)移等多種功能蛋白的異常表達(dá)[13]。

miRNA能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄后蛋白水平，并且通過(guò)調(diào)節(jié)各種信號(hào)分子（生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子等）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖、分化、新陳代謝、侵襲轉(zhuǎn)移等的調(diào)控[14]。目前的研究指出，miRNA與人類的多種重大疾病如病毒感染、腫瘤、心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。大量證據(jù)表明正常組織中的miRNA表達(dá)圖譜與腫瘤組織中有明顯差異，很多腫瘤中有很多miRNA被被報(bào)道存在異常表達(dá)，這些miRNA在腫瘤中可能發(fā)揮著類似抑癌基因或原癌基因的作用[15]。miRNA即可以作為抑癌基因下調(diào)原癌基因的活性，也可以作為原癌基因下調(diào)抑癌基因的表達(dá)[16-17]，這些均說(shuō)明miRNA可以作為一種潛在的腫瘤標(biāo)志物用于腫瘤的診斷或者預(yù)后評(píng)估。miRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，很多miRNA被證明可以直接參與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、分化與侵襲轉(zhuǎn)移[18]。因此，對(duì)于miRNA的研究不但可以用于診斷肝癌、以及肝癌的個(gè)體化治療還可以作為判斷肝癌預(yù)后的重要工具。

miR-21在多種腫瘤中被認(rèn)為起到促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種靶基因的表達(dá)來(lái)參與腫瘤的調(diào)控[19]。研究表明，在膠質(zhì)瘤中miR-21可以通過(guò)調(diào)節(jié)TIMP3與RECK以及基質(zhì)金屬蛋白酶來(lái)調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展；在乳腺癌中miR-21也可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；在腸癌細(xì)胞系中的研究證實(shí)，miR-21可以通過(guò)調(diào)節(jié)PDCD4以及相關(guān)蛋白來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的侵襲能力；肝癌細(xì)胞中，miR-21也被證明是高表達(dá)的[19]，并且其可以通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[20-21]，但是關(guān)于其如何調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖報(bào)道較少。研究[22]表明多種腫瘤中PTEN基因的缺失或者突變可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，有報(bào)道指出PTEN可以通過(guò)調(diào)節(jié)下游的PI3K/AKT通路來(lái)影響細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。并且也有研究[23]表明約27%的肝癌中存在PTEN的雜合性缺失。

本研究通過(guò)分析119例肝癌患者的組織以及癌旁組織發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腫瘤組織中miR-21的表達(dá)普遍高于癌旁組織，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在對(duì)患者組織樣本進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中PTEN的表達(dá)明顯低于癌旁組織并且與miR-21具有一定相關(guān)性。由此推斷PTEN可能與miR-21具有一定相關(guān)性，通過(guò)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，印證了miR-21可以特異性的打靶并且抑制PTEN的表達(dá)。由于PTEN可以調(diào)節(jié)腫瘤的一系列生物學(xué)功能，尤其是對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有很明確的調(diào)節(jié)作用，因此對(duì)miR-21是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)來(lái)影響HePG2細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了分析，MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。接下來(lái)我們通過(guò)Western blot與RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析了miR-21對(duì)PTEN下游經(jīng)典的AKT通路的作用，發(fā)現(xiàn)miR-21通過(guò)抑制PTEN來(lái)抑制其下游Akt通路的磷酸化水平，也提高了cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的增殖水平。

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