劉昆昂 張根偉 馬 宏 李書生 劉振國 付艷菊

（河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊050081）

金針菇（Flammulina velutipes）又名構(gòu)菌、冬菇、毛柄金錢菌等[1]，按子實體顏色的深淺可將金針菇分為黃色品系、白色品系、淡黃色品系[2]。黃色金針菇是我國傳統(tǒng)金針菇生產(chǎn)品種，相對于白色金針菇，具有產(chǎn)量高、口感好、抗性強等特點。金針菇菌種作為金針菇栽培的基礎(chǔ)生產(chǎn)資料，對產(chǎn)量和質(zhì)量起著關(guān)鍵性作用。然而黃色金針菇主要是散戶栽培，由于科研投入不足、管理不善，金針菇菌種在保藏及傳代過程中出現(xiàn)生產(chǎn)周期延長、產(chǎn)量下降、容易感染等退化現(xiàn)象。

菌種退化分為可逆和不可逆兩種類型，可逆的退化現(xiàn)象可通過提純復(fù)壯恢復(fù)其優(yōu)良特性[3]。生產(chǎn)上常用的菌種提純復(fù)壯方法有，（1）“斷橋法”和菌絲尖端分離提純復(fù)壯，其特點是僅可篩選出生長速度快的菌株，而生長速度快往往并非高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)食用菌菌株[4]；（2）原生質(zhì)體再生法:需要產(chǎn)生大量原生質(zhì)體，并對產(chǎn)生的大量原生質(zhì)體進行分離、篩選和出菇驗證，技術(shù)難度較大[5]。

研究以黃色金針菇蘇金6 號為樣本，通過在含有不同濃度結(jié)晶紫的PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用菌絲尖端分離和原生質(zhì)體再生相結(jié)合的方法進行提純復(fù)壯。此方法較常規(guī)金針菇提純復(fù)壯方法更簡便、更高效。

1 材料與方法

1.1 供試菌株黃色金針菇品種蘇金6 號，引自河北省創(chuàng)新食用菌研究所，生產(chǎn)中主要表現(xiàn)為污染率高、生產(chǎn)周期延長、產(chǎn)量下降、畸形菇增多等。

1.2 培養(yǎng)基①PDA 培養(yǎng)基（g/L）:馬鈴薯200，葡萄糖20，磷酸二氫鉀3，硫酸鎂1.5，蛋白胨2，瓊脂12；②再生培養(yǎng)基:PDA 培養(yǎng)基+ 0.6 mol/L 的甘露醇；③栽培培養(yǎng)料:棉籽皮83%，麩皮15%，石灰1%，石膏1%；料水質(zhì)量比1∶1.3；④木質(zhì)素酶顯色培養(yǎng)基:1%梨木屑煮汁＋0.02%愈創(chuàng)木酚＋1.2%瓊脂；⑤纖維素酶顯色培養(yǎng)基:0.2%微晶纖維素＋0.02%剛果紅＋1.2%瓊脂。

1.3 提純復(fù)壯培養(yǎng)取供試菌株試管種不同部位菌塊，分別接入含有0～40 mg/L 結(jié)晶紫的PDA 培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)，待菌絲將要長滿皿，挑取菌絲尖端，轉(zhuǎn)入PDA培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)，比較生長情況。

1.4 鎖狀聯(lián)合觀察計數(shù)菌株接入鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)，待菌絲長到玻璃紙上，400倍顯微鏡下觀察視野中鎖狀聯(lián)合數(shù)量。

1.5 酶解液1%蝸牛酶（Snailase）+1%溶壁酶（Sig?ma），用0.6 mol/L MgSO4配制，經(jīng)4000 r/min 離心20 min 后，上清液無菌條件下用0.45 μm 微孔濾膜過濾除菌后，分裝于10 mL 試管中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 原生質(zhì)體再生對提純復(fù)壯處理的菌株進行原生質(zhì)體再生，取金針菇斜面菌絲碎片，接入盛有30 mL 液體PDA 培養(yǎng)基的100 mL 三角瓶中，25℃左右靜置培養(yǎng)7 d。過濾收集菌絲體，分別用無菌水和0.6 mol/L 的MgSO4各洗滌1 次。按菌絲重∶酶液量為150 mg∶1 mL 的比例將菌絲置于酶解管中，30℃酶解3 h，每隔1 h 振蕩并鏡檢原生質(zhì)體釋放情況。酶解完畢后，用6 層擦鏡紙過濾，以除去殘留菌絲。濾液經(jīng)1000 r/min離心后棄上清液收集沉淀，用0.6 mol/L 的MgSO4洗滌2 次，得到純化的原生質(zhì)體。取0.1 mL 原生質(zhì)體懸液梯度稀釋，涂布于再生培養(yǎng)基平板，25℃下恒溫培養(yǎng)，4～6 d即見再生菌落[6]。

表1 不同質(zhì)量濃度結(jié)晶紫培養(yǎng)基培養(yǎng)對蘇金6號的提純復(fù)壯作用

1.7 再生菌株的篩選挑取再生菌株到PDA 培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)，挑選生長快、長勢好、菌絲粗壯、鎖狀聯(lián)合多而整齊；同法接入栽培料中，測定生長速度，重復(fù)3次[7]。

1.8 再生菌株的酶活測定變色圈法測定木質(zhì)素和纖維素酶活性。菌塊接入PDA 培養(yǎng)基平皿中部，滿皿后用打孔器在菌落邊緣取直徑50 mm 的菌餅，接入顯色培養(yǎng)基中，分別在5、10、15、20、25℃和30℃培養(yǎng)3 d，測定變色圈直徑[8]。

1.9 栽培試驗用聚丙烯塑料袋（17.5 cm×40 cm×0.005 cm）裝料，每袋約裝干料400 g，以套環(huán)封口。高壓滅菌（121～126℃）維持2 h，待料溫降至25℃以下，按無菌操作規(guī)范接種，各接30袋。置于20～28℃培養(yǎng)室內(nèi)發(fā)菌，菌絲滿袋后按再生法進行催蕾—開袋—抑制—再生菇培養(yǎng)等工藝進行出菇管理[9]。當(dāng)子實體長至16 cm 左右，菌蓋直徑小于1 cm 及時采收。復(fù)壯效果。

圖1 出發(fā)菌株及再生菌株的菌絲形態(tài)觀察

2.2 原生質(zhì)體再生菌株篩選

2.2.1 提純復(fù)壯培養(yǎng)對原生質(zhì)體再生的影響 對20 mg/L 結(jié)晶紫提純復(fù)壯培養(yǎng)的菌株進行原生質(zhì)體再生，并設(shè)出發(fā)菌株對照。挑取再生菌株各100株，初篩各得到60株長勢較強、生長快的菌株，經(jīng)傳代3次后在PDA 培養(yǎng)基上進行比較。處理組篩選得到的菌絲生長速度≥7 mm/d 的菌株為45 個，達到75.0%，而對照僅14個，占13.3%；處理組400倍顯微鏡下，視野中平均鎖狀聯(lián)合數(shù)量為28.6 個，而對照組平均鎖狀聯(lián)合數(shù)量為22.4 個。可見，含有結(jié)晶紫PDA 培養(yǎng)基提純復(fù)壯培養(yǎng)，可以顯著提高金針菇原生質(zhì)體再生的篩選效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提純復(fù)壯培養(yǎng)結(jié)果一定質(zhì)量濃度的結(jié)晶紫可抑制金針菇菌絲生長，尤其對細胞壁不完整的退化菌絲產(chǎn)生更大的殺傷作用；而抗性強的菌絲，可以觀察到:菌絲生長停頓1～2周后，部分萌發(fā)點成扇形向外生長。由表1可知，在含有1～40 mg/L結(jié)晶紫的PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隨著濃度增加，滿皿時間逐步延后；20～40 mg/L 處理時，提純復(fù)壯的菌株，平均生長速度、長勢和菌絲密度達到最大；如圖1 所示，400 倍顯微鏡下觀察可見菌絲生長整齊、粗壯，鎖狀聯(lián)合數(shù)量最多，而且組間差異不顯著。因此，含有20 mg/L 結(jié)晶紫的PDA 培養(yǎng)基即可以達到最佳提純

2.2.2 原生質(zhì)體再生菌株篩選 篩選生長快、長勢強、菌絲密度大、鎖狀聯(lián)合數(shù)量多的菌株。如表2所示，5 株菌在PDA 培養(yǎng)基和棉籽皮基質(zhì)上菌絲長速都快于出發(fā)菌株，而且長勢強、菌絲密度大、鎖狀聯(lián)合規(guī)則而且多；但兩種基質(zhì)上的生長速度并不成正比，例如，在PDA 培養(yǎng)基以13D10 生長最快，達到9.25 mm/d，但在棉籽皮基質(zhì)上菌絲生長速度排第二位，為4.90 mm/d；而棉籽皮基質(zhì)上生長速度最快的13B7，達到5.01 mm/d，PDA 培養(yǎng)基上生長速度排第三位，為8.93 mm/d。

2.2.3 木質(zhì)素、纖維素酶活性比較 對篩選的再生菌株進行木質(zhì)素和纖維素酶活測定。結(jié)果如表3、表4 所示，再生菌株木質(zhì)素和纖維素酶活性均高于對照。20～30℃條件下，木質(zhì)素酶活性由高到低依次為:13B7＞13C9＞13C10＞13D10＞13A2＞CK；纖維素酶活性由高到低依次為:13B7＞13C9＞13D10＞13A2=13C10＞CK。5～15℃條件下，木質(zhì)素酶活性由高到低依次為:13D10＞13B7＞13C9＞13A2＞13C10＞CK；纖維素酶活性由高到低依次為:13C9＞13B7＞13D10＞13A2=13C10＞CK。其中，13B7在中高溫具有最高的酶活性，低溫酶活性排在第二位；13A2 在各溫度點酶活均相對低。

2.3 出菇試驗結(jié)果選取13B7、13D10、13C9 和13C10四株生長速度快、酶活高的再生菌株進行出菇試驗。結(jié)果如表5 所示，再生菌株可縮短滿袋時間5～6 d，提高產(chǎn)量11.2%～15.5%，均為優(yōu)于親本的高產(chǎn)菌株。以13B7產(chǎn)量最高，達到381 g/袋，增產(chǎn)15.5%，生物學(xué)效率為95.3%。同時發(fā)現(xiàn)，生長速度慢于13D10 和13C9 的13B7 出菇最早，而且產(chǎn)量最高，可見菌株的長速與產(chǎn)量之間并不一定存在正相關(guān)性，提示我們菌株篩選要從多方面考慮，以免漏篩。

表2 在PDA培養(yǎng)基和栽培料（棉子殼）上原生質(zhì)體再生菌株的菌絲生長情況

表3 在不同溫度下再生菌株的木質(zhì)素酶活（變色圈直徑）/mm

表4 在不同溫度下再生菌株的纖維素酶活性（變色圈直徑）/mm

表5 復(fù)篩（再生）菌株與出發(fā)菌株的出菇試驗

3 小結(jié)與討論

在食用菌菌株的脫毒復(fù)壯中，采用的方法主要有菌絲尖端脫毒法、原基組織脫毒法、原生質(zhì)體再生法等。相比原生質(zhì)體再生法，菌絲尖端分離不容易得到純的提純復(fù)壯的菌株，但以退化的菌株直接進行原生質(zhì)體再生，無疑增加了篩選的工作量，也很難達到滿意的效果。研究提供的提純復(fù)壯方法，不但使退化菌株在生長速度、木質(zhì)素和纖維素酶活和產(chǎn)量均有提高，而且在形態(tài)上也有差異，退化的菌株細胞壁破損、穿孔，菌絲生長不整齊，而再生菌株生長快，鎖狀聯(lián)合多而且規(guī)則。另外，當(dāng)培養(yǎng)溫度在20～30℃時，在生長速度相近的情況下，產(chǎn)量與木質(zhì)素酶活、纖維素酶活成正相關(guān)。這可能和試驗中中溫發(fā)菌培養(yǎng)有關(guān)。試驗結(jié)果表明，在優(yōu)良菌株提純復(fù)壯篩選過程中，可以從不同溫度下酶活、形態(tài)特征角度進一步篩選。此外，筆者還對黃色金針菇雜19進行了提純復(fù)壯，從菌絲形態(tài)角度判斷雜19菌株退化較輕，提純復(fù)壯菌株增產(chǎn)幅度低于蘇金6號。初步判斷，此方法更適合于退化的金針菇菌株的提純復(fù)壯。