金蓮錦，李云矗，李罡，徐春燕，孫平

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院；3牡丹江腫瘤醫(yī)院)

人乳腺癌組織和細(xì)胞中TNFR1表達(dá)及其對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響

金蓮錦1，李云矗2，李罡1，徐春燕3，孫平2

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011；2牡丹江醫(yī)學(xué)院；3牡丹江腫瘤醫(yī)院)

目的 觀察人乳腺癌組織和細(xì)胞中腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)的表達(dá)，以及抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中TNFR1表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。方法 取新鮮乳腺癌組織及癌旁組織各30例、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7、MDA-MB-231、T47D)和人正常乳腺細(xì)胞，采用Real-time PCR法檢測(cè)組織和細(xì)胞中的TNFR1 mRNA；將MCF-7細(xì)胞分為3組，A組不轉(zhuǎn)染，B組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒，C組轉(zhuǎn)染siRNA-TNFR1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染72 h后分別采用MTT法及流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞增殖及凋亡，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8(Caspase-8)及核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)。結(jié)果 人乳腺癌組織和癌旁組織中TNFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.41±0.08和0.38±0.05，癌組織與癌旁組織相比P<0.05；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、T47D中TNFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.48±0.06、1.51±0.02、1.66±0.01，人正常乳腺細(xì)胞中TNFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.09，人乳腺癌細(xì)胞與人正常乳腺細(xì)胞相比P均<0.05。A、B、C組細(xì)胞增殖能力(吸光度值)分別為0.96±0.09、0.93±0.11、0.62±0.05，細(xì)胞凋亡率分別為8.23%±3.50%、9.92%±3.19%、24.61%±2.46%，C組與A、B組比較P均<0.05。A、B、C組細(xì)胞中Caspase-8蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.40±0.03、0.42±0.05、0.82±0.01，NF-κB蛋白表達(dá)相對(duì)量分別為0.79±0.03、0.76±0.04、0.32±0.06，C組與A、B組比較P均<0.05。結(jié)論 人乳腺癌組織和細(xì)胞中TNFR基因高表達(dá)，其可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路抑制Caspase-8的表達(dá)來(lái)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞亡。

乳腺癌；MCF-7細(xì)胞;腫瘤壞死因子受體1;半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8；核轉(zhuǎn)錄因子κB

據(jù)2012年全球范圍統(tǒng)計(jì)，每年大約有167萬(wàn)女性被確診為乳腺癌患者，死亡人數(shù)接近52萬(wàn)[1]。目前乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因此研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)迫在眉睫。研究表明，癌癥的發(fā)生和發(fā)展與慢性炎癥形成的微環(huán)境有關(guān)。微環(huán)境中大量的炎癥因子在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用[2～4]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)是腫瘤微環(huán)境中的重要一員，主要通過(guò)與兩個(gè)TNF-α受體(TNFR1和TNFR2)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，而TNFR1是介導(dǎo)TNF-α發(fā)揮生物學(xué)功能的主要受體[5～7]。目前，關(guān)于乳腺癌TNFR1的表達(dá)、作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道不多。2015年9月～2016年7月，我們采用Real-time PCR檢測(cè)乳腺癌組織和細(xì)胞中TNFR1 mRNA的表達(dá)，并利用RNAi技術(shù)構(gòu)建靶向TNFR1的siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，觀察抑制TNFR1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制，旨在明確TNFR1在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2015年9月～2016年1月牡丹江腫瘤醫(yī)院切除的新鮮乳腺癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣約5 cm)各30例，置于液氮罐內(nèi)冷凍保存?zhèn)溆?。人乳腺癌?xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、T47D(上海細(xì)胞研究所)。siRNA-TNFR-1質(zhì)粒(中國(guó)萬(wàn)類(lèi)公司)，TRIzol試劑、LipofectamineTM2000 (美國(guó)Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)，2×SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國(guó)碧云天公司)，DMEM、胎牛血清(中國(guó)四季青公司)，Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(中國(guó)晶美公司)，鼠抗人TNFR-1抗體、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶8(Caspase-8)抗體、鼠抗人NF-κB抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，PCR引物由上海博亞生物工程公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳腺癌組織和細(xì)胞中TNFR-1 mRNA檢測(cè) 采用Real-time PCR法。用TRIzol法提取組織和細(xì)胞內(nèi)的總RNA，RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄cDNA, SYBR Premix Ex Taq試劑盒用于Real-time PCR定量檢測(cè)。引物序列：TNFR1上游引物為5′-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3′, 下游引物為5′-CCGTTGGTAGCGATACATTA-3′；內(nèi)參U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物為5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每個(gè)樣品重復(fù)3次，以2-ΔΔCT法計(jì)算TNFR-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 MCF-7 細(xì)胞分組與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將4×105個(gè)MCF-7 細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，接種于24孔板，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。將細(xì)胞分為三組，按LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。A組只加LipofectamineTM2000，B組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒，C組轉(zhuǎn)染siRNA-TNFR1質(zhì)粒,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。siRNA-TNFR1序列：上游引物為5′-GCCAGGAGAAACAGAACAC-3′，下游引物為5′-CCGTTGGTA GCGATACATTA-3′。轉(zhuǎn)染72 h后，于倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，B、C組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率均達(dá)95%左右。

1.2.3 MCF-7 細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。將三組MCF-7細(xì)胞密度調(diào)整為1×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染72 h后,加入MTT標(biāo)記混合液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清液。每孔加入DMSO震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度值(波長(zhǎng)490 nm)，以此表示細(xì)胞增殖能力。

1.2.4 MCF-7細(xì)胞凋亡觀察 采用流式細(xì)胞儀。收集轉(zhuǎn)染72 h后的三組細(xì)胞，均加入Annexin V凋亡試劑，常溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡率為染有Annexin V的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 MCF-7細(xì)胞中Caspase-8及NF-κB蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。提取三組細(xì)胞的總蛋白，以BCA檢測(cè)定量，等量總蛋白12%凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素膜，先后加入鼠抗人TNFR1抗體(1∶500)、Caspas-8抗體(1∶500)和NF-κB蛋白(1∶500)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶1 000)二抗，β-actin(1∶4 000)作為內(nèi)參。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，以目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 人乳腺癌組織和細(xì)胞中TNFR1 mRNA表達(dá)比較 人乳腺癌組織和癌旁組織中TNFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.41±0.08和0.38±0.05，癌組織與癌旁組織相比P<0.05。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、T47D中TNFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.48±0.06、1.51±0.02、1.66±0.01，人正常乳腺細(xì)胞中TNFR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.09，人乳腺癌細(xì)胞與人正常乳腺細(xì)胞相比P均<0.05。

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較 A、B、C組細(xì)胞增殖能力分別為0.96±0.09、0.93±0.11、0.62±0.05，C組與A、B組比較P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較 A、B、C組細(xì)胞凋亡率分別為8.23%±3.50%、9.92%±3.19%、24.61%±2.46%，C組與A、B組比較P均<0.05。

2.4 各組細(xì)胞中Caspase-8和NF-κB蛋白表達(dá)比較 A、B、C組細(xì)胞中Caspase-8蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.40±0.03、0.42±0.05、0.82±0.01，NF-κB蛋白表達(dá)相對(duì)量分別為0.79±0.03、0.76±0.04、0.32±0.06，C組與A、B組比較P均<0.05。

3 討論

TNFR1作為介導(dǎo)TNF-α生物學(xué)效應(yīng)的主要受體，存在于多種正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞表面[8，9]。徐潔等[10]采用Western blot和免疫組化法檢測(cè)了膽脂瘤上皮組織中TNFR1的表達(dá)和分布，發(fā)現(xiàn)TNFR1在膽脂瘤上皮組織中呈高表達(dá)；閆錫釗等[11]同樣證實(shí)，TNFR1在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均與宮頸癌癌變呈正相關(guān)。Rivas等[12]發(fā)現(xiàn)，大鼠乳腺癌細(xì)胞C4HD中TNFR1表達(dá)上調(diào)，選擇性抑制TNFR1的表達(dá)可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。但是，關(guān)于人乳腺癌組織和細(xì)胞中TNFR1的表達(dá)研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究采用Real-time PCR檢測(cè)TNFR1基因在乳腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果TNFR1 基因表達(dá)明顯升高，表明TNFR1在乳腺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

RNAi是由雙鏈RNA引發(fā)的、序列特異的同源基因轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是一種高效、特異地抑制基因表達(dá)進(jìn)而研究基因功能的常用技術(shù)[13，14]。為明確TNFR1對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，我們構(gòu)建了靶向TNFR1的siRNA質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，然后逆向特定地觀察抑制TNFR1表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示，siRNA-TNFR1質(zhì)粒能明顯抑制MCF-7細(xì)胞增殖，促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡，提示TNFR1可能在乳腺癌細(xì)胞增殖加快、凋亡抑制中起作用。但是，TNFR1如何促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖以及相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。

研究表明，TNFR1通過(guò)內(nèi)化形成死亡信號(hào)復(fù)合體可激活下游的Caspase-8級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤和抗炎效應(yīng)[15]；同時(shí)，TNFR1也可以激活NF-κB介導(dǎo)細(xì)胞增殖及炎性反應(yīng)，具有抗凋亡效果[16]。Wen等[17]研究一種永生化的小膠質(zhì)細(xì)胞瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，該腫瘤細(xì)胞內(nèi)TNFR1 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而Diegmann等[18]研究人乳頭狀腎細(xì)胞癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，TNFR1可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖?？梢?jiàn)，TNFR1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為具有雙重作用，這種雙重作用的發(fā)揮取決于激活不同的信號(hào)傳導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)作用的強(qiáng)弱對(duì)比。為了探究乳腺癌內(nèi)TNFR1抗凋亡的機(jī)制，我們采用Western blot法檢測(cè)了siRNA-TNFR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞Caspase-8和NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制MCF-7細(xì)胞TNFR1表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-8蛋白表達(dá)水平明顯升高，而NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯下降。這提示乳腺癌細(xì)胞MCF-7中高表達(dá)的TNFR1很有可能通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路，抑制Caspase-8的活化發(fā)揮抗凋亡的作用。我們推測(cè)，在MCF-7細(xì)胞中TNFR1的功能以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，但這種作用被高度活化的NF-κB信號(hào)通路所抑制，因此細(xì)胞呈現(xiàn)增殖加速、凋亡減少的生物學(xué)行為。但是，在這一過(guò)程中TNFR1激活的Caspase-8 和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路是如何相互作用的還有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)TNFR1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用，為深入研究TNFR1介導(dǎo)的腫瘤生物學(xué)多效性機(jī)制提供了依據(jù)，從而為乳腺癌治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

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醫(yī)藥學(xué)名詞常見(jiàn)錯(cuò)誤及正確寫(xiě)法

藥品名稱(chēng)：錯(cuò)誤(正確)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，維甲酸(維A酸)，雙磷酸鹽(雙膦酸鹽)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博萊霉素(博來(lái)霉素)，開(kāi)浦蘭(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(異丙嗪)，四乙銨(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)(大環(huán)內(nèi)酯類(lèi))，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，頭胞哌酮(頭孢哌酮)。

疾病及其相關(guān)名稱(chēng)：錯(cuò)誤(正確)

甲狀腺機(jī)能(甲狀腺功能)，血沉(紅細(xì)胞沉降率)，X光片(X線(xiàn)片)，帕金森癥(帕金森病)，食道(食管)，適應(yīng)征、適應(yīng)癥(適應(yīng)證)，禁忌征、禁忌癥(禁忌證)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，腦梗塞(腦梗死)，毒副反應(yīng)(不良反應(yīng))，肌肉注射(肌內(nèi)注射)，心率失常(心律失常)，中風(fēng)(卒中)，生理機(jī)能(生理功能)，返流(反流)，血液動(dòng)力學(xué)(血流動(dòng)力學(xué))，機(jī)能(功能)，人流(人工流產(chǎn))，藥動(dòng)學(xué)(藥代動(dòng)力學(xué))，綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)，機(jī)理(機(jī)制)，圍產(chǎn)期(圍生期)，氧和指數(shù)(氧合指數(shù))，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)，血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶抑制劑(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑)，咳血(咯血)，心房纖顫(心房顫動(dòng))，腦溢血(腦出血)，穩(wěn)定性心絞痛(穩(wěn)定型心絞痛)，法樂(lè)四聯(lián)癥(法洛四聯(lián)癥)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤(視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)，剖腹產(chǎn)術(shù)(剖宮產(chǎn)術(shù))。

其他：錯(cuò)誤(正確)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滯(黏滯)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘質(zhì)沙雷菌(黏質(zhì)沙雷菌)，層黏聯(lián)蛋白(層黏連蛋白)，機(jī)率、幾率(概率)，脫臘(脫蠟)，側(cè)枝循環(huán)(側(cè)支循環(huán))，縱膈(縱隔)，紅血球(紅細(xì)胞)，白血球(白細(xì)胞)。

Expression of TNFR1 in human breast cancer tissue and cells and its effecton proliferation and apoptosis of MCF-7 cells

JINLianjin1,LIYunchun,LIGang,XUChunyan,SUNPing

(1TheAffiliatedHongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniverstiy,Mudanjiang157011,China)

Objective To observe the expression of tumor necrosis factor receptor-1 (TNFR1) in the human breast cancer tissues and cells and the effect of inhibiting TNFR1 expression on the proliferation and apoptosis of MCF-7 cells, and to discuss the mechanism. Methods The TNFR1 mRNA expression was detected in 30 cases of human breast cancer tissues and adjacent tissues, and cells (MCF-7, MDA-MB-231 and T47D) by real-time PCR. MCF-7 cells were divided into 3 groups: groups A, B and C. Group A (control group) was not transfected, group B was transfected with negative vector and group C was transfected with siRNA-TNFR1 vector. After transfection for 72 h, MTT and flow cytometry were used to detect proliferation and apoptosis of MCF-7 cells, respectively; and Western blot was performed to determine the Caspase-8 and nuclear factor-κB (NF-κB). Results The relative expression of TNFR1 in the human breast cancer tissues and adjacent tissues was 1.41±0.08 and 0.38±0.05, respectively. The relative expression of TNFR1 in MCF-7, MDA-MB-231, T47D and normal breast cells was 2.48±0.06, 1.51±0.02, 1.66±0.01 and 1.00±0.09, respectively. TNFR1 expression in the breast cancer tissues and cells was higher than that of the control group (P<0.05). The optimal density in proliferation of groups A, B and C was 0.96±0.09, 0.93±0.11 and 0.62±0.05, respectively. The apoptosis rates of groups A, B and C were 8.23%±3.50%, 9.92%±3.19% and 24.61%±2.46%, respectively. Significant difference was found in the proliferation and apoptosis rate between groups A, B and C (allP<0.05). The Caspase-8 expression in the groups A, B and C was 0.40±0.03, 0.42±0.05, 0.82±0.01, and the NF-κB protein expression was 0.79±0.03, 0.76±0.04 and 0.32±0.06, respectively. Significant difference was found between groups A, B and C (allP<0.05).Conclusion TNFR1 is highly expressed in human breast cancer tissues and cells and probably promotes the cell proliferation and suppresses the apoptosis by activating NF-κB signaling pathway and inhibiting Caspase-8 expression.

breast carcinoma; MCF-7 cells; tumor necrosis factor receptor-1; Caspase-8; nuclear factor-κB

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(H201377)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2012-285)。

金蓮錦(1977-)，女，副教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤與炎癥的關(guān)系。E-mail: jinlianjin0410@163.com

孫平(1973-)，女，副教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤與炎癥的關(guān)系。E-mail: spmy73@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.004

R730.21

A

1002-266X(2017)18-0012-04

2016-12-15)