王宏亮 呂甜甜 邢瑋 韓靜 吳晏 張子劍 王偉

·論著·

活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜組織中microRNA表達的影響

王宏亮 呂甜甜 邢瑋 韓靜 吳晏 張子劍 王偉

目的 觀察活血解毒方對糖尿病大鼠視網膜組織中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達的影響，探討其改善糖尿病視網膜病變的機制。方法 選取SPF級雄性SD大鼠15只。一次性腹腔注射鏈脲佐菌素誘導糖尿病模型大鼠10只，隨機分為模型組和活血解毒方組，另設5只為正常對照組。造模成功后第20周開始給藥，給藥12周后摘取眼球，提取視網膜組織中的總RNA。采用Real-time PCR技術檢測microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表達。結果 與正常對照組相比，模型組microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表達降低(P<0.05，P<0.01，P<0.05，P<0.05，P>0.05)，microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達升高(P<0.01，P<0.05)；與模型組相比，活血解毒方組microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表達升高(P>0.05，P<0.05，P>0.05，P<0.01，P<0.05)，microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達降低(P<0.01，P<0.01)。 結論 推測活血解毒方是通過上調糖尿病大鼠視網膜組織中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p的表達，下調microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表達來起到延緩糖尿病視網膜病變的發(fā)生和發(fā)展進程的作用。

糖尿病視網膜病變； 活血解毒方； MicroRNA

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是目前最常見、最嚴重的糖尿病微血管并發(fā)癥之一[1]，具有高致殘率和嚴重危害個人生存質量的特點。在發(fā)達國家，DR是成年人致盲的首位原因[2]。DR的發(fā)病機制比較復雜，主要包括新生血管形成、血管內皮系統(tǒng)功能異常和細胞凋亡等，但其確切機制尚未完全闡明。MicroRNA(miRNA)是一種具有調控功能的非編碼小分子RNA，長約21～24個核苷酸[3]，可通過降解或抑制靶mRNA的翻譯，在轉錄后水平調控基因的表達[4]。近年來，越來越多的研究表明，miRNA參與調控機體內多個與DR有關的病理和生理環(huán)節(jié)。它可以促進內皮祖細胞的增殖、遷移及血管形成[5]，減少人臍靜脈內皮細胞形成微血管[6]，進而促進經氧化應激處理的神經元的凋亡[7]。另外，有實驗研究表明，在DR中發(fā)揮重要作用的缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)、內皮素-1(endothelin-1，ET-1)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等基因的表達均受到miRNA的調控[6，8]。以上研究提示，miRNA可能參與調控DR的發(fā)生和發(fā)展進程。

活血解毒方是臨床經驗方，主要由三七、黃連、鬼箭羽及天花粉組成，具有滋陰清熱、活血通絡的功效。經前期藥效學實驗證實，本方可保護視網膜神經細胞、改善血流動力學和抑制毛細血管內皮細胞的增生[9-11]，從而緩解DR的癥狀；分子生物學實驗表明，本方能通過干預與DR有關的多條信號轉導通路，調控相關基因的表達，從而改善DR的癥狀[12-13]。但是活血解毒方對miRNA的影響機制尚未探討過，因此，本實驗擬通過觀察microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p在糖尿病大鼠視網膜組織中的表達變化，闡明miRNA在DR中的作用機理，并探討活血解毒方通過調控miRNA的表達從而了解治療DR的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠15只，7周齡，體質量160～190 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001。大鼠在北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF實驗室飼養(yǎng)，室內溫度20～25℃、相對濕度50%～60%、換氣次數10～15次/小時，12小時/天光照維持、晝夜循環(huán)。

1.2 藥物與試劑

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，SigmaS0130，由北京創(chuàng)信生物公司分裝；活血解毒方由北京中醫(yī)藥大學藥學院提供、制備。Total RNA提取試劑盒(05060810)、Quanto-miR cDNA合成試劑盒(07060301)、Quanto-miR參照試劑盒(05102816)均購自北京曠博生物技術有限公司；Quanto-miR qPCR引物由北京曠博生物技術有限公司設計并合成；熒光定量試劑盒(10802200)，購自Roche。

1.3 實驗儀器

Optium Xceed“安妥超越”血糖儀與Optium試紙，購自雅培糖尿病護理有限公司；NanoDrop 2000分光光度計，購自Thermo scientific；反轉錄儀，購自Bio-Rad C1000；StepOnePlus Real-time PCR儀，購自Applied Biosystems。

1.4 方法

1.4.1 造模 隨機選取10只大鼠，禁食12小時，給予STZ(65 mg/kg)一次性腹腔注射，其余5只作為正常對照組，注射等量的檸檬酸鈉溶液(0.1 mmol/L)。1周后尾靜脈采血檢測血糖，以禁食6小時血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型造模成功的標準。

1.4.2 分組與給藥 將10只糖尿病大鼠隨機平均分為模型組和活血解毒方組，每組5只。造模成功后第20周開始給藥?；钛舛痉接晒砑稹⑷?、天花粉和黃連按1∶1∶1∶1的比例配比而成。鬼箭羽用60%乙醇提取后AB-8 樹脂上樣，然后以50%乙醇解吸附；三七以70%乙醇提取后HPD-300樹脂上樣，60%乙醇解吸附；天花粉與黃連混合水提、濃縮，60%乙醇醇沉靜置24小時，取上清液。各提取物混勻后濃縮干燥成粉末，配成1.54 g/mL的水溶液，給予15.4 g/kg(相當于臨床用藥量的14倍)灌胃，1次/天；正常對照組和模型組給予等體積的純凈水灌胃，1次/天。每月檢測1次血糖。32周后摘取大鼠眼球，提取視網膜組織中的總RNA。

1.5 檢測指標

Real-time PCR法檢測microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表達。

反轉錄反應體系：(1)總RNA 1 μg，10×buffer 2 μL，10 μM ATP 2μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，聚合酶1 μL，Quanto-EC3外參1 μL，加DEPC水至20 μL，將此mix離心15秒，再置于PCR儀37℃孵育1小時；(2)5×buffer 8 μL，10 mM dNTP 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，DEPC水8 μL，反轉錄酶1 μL，與第(1)步反應產物20 μL合并，共計40 μL。

反應條件：50℃反應50分鐘，70℃ 15分鐘終止反應。反應結束后，放-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。以IC1作為內參進行Real-time PCR反應。反應體系：cDNA 1 ng，2×PCR Mix 10 μL，10×UPM 2 μL，miRNA及IC1引物2 μL，加DEPC水至20 μL。反應條件：50℃預熱2分鐘，95℃變性10分鐘，95℃退火15秒鐘，50℃延伸1分鐘，共40個循環(huán)。反應結束后，得到每份樣品中miRNA以及IC1的CT值，以2-△△Ct計算每份樣品miRNA的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

與正常對照組相比，模型組microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達升高(P<0.05，P<0.05)，microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表達降低(P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05，P>0.05)；與模型組相比，活血解毒方組microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表達升高(P>0.05，P>0.05，P>0.05，P<0.05，P<0.05)，microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達降低(P<0.05，P<0.05)。見表1～2。

表1 各組大鼠視網膜中microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05。

3 討論

研究顯示，miRNA參與多種調節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖與凋亡及脂肪代謝等，能調控上百個靶基因的表達[14]，它與DR的關系已成為國內外的研究熱點。近年來，一些研究表明，某些特異性的miRNA在DR的發(fā)生和發(fā)展進程中發(fā)揮不同的作用，其中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p的表達可能與新生血管形成或細胞凋亡的機制相關[15-22]。活血解毒方是臨床經驗方，全方具有滋陰清熱、活血通絡的功效，主要針對DR陰虛內熱、絡脈瘀阻之病機進行治療。前期研究發(fā)現，本方可降低糖尿病大鼠視網膜VEGF的表達，并促進色素上皮衍生因子的表達[23]，還能夠保護視網膜神經細胞、改善血流動力學和抑制毛細血管內皮細胞的增生[9-11]，對DR癥狀有明顯的改善作用。

表2 各組大鼠視網膜中microRNA表達的比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

本實驗采用Real-time PCR技術檢測發(fā)現：與正常對照組相比，模型組大鼠視網膜組織中microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p和microRNA-30c-5p表達降低，在應用了活血解毒方治療后，上述miRNA表達均有所升高；與正常對照組相比，模型組microRNA-153-3p和microRNA-423-5p表達升高，在應用了活血解毒方治療后，二者表達均降低。以上研究結果提示，microRNA-125a-3p、microRNA-212-3p、microRNA-290、microRNA-129-5p、microRNA-30c-5p、microRNA-153-3p和microRNA-423-5p可能通過影響DR中新生血管形成或細胞凋亡的基本病理改變，參與DR發(fā)生和發(fā)展過程，推測活血解毒方是通過調控上述miRNA的表達，進而影響細胞和血管功能，從而改善DR癥狀。

本實驗不僅表明miRNA在DR進程中發(fā)揮重要作用，可能成為未來治療DR的新靶點；而且證明活血解毒方可能通過調控某些miRNA的表達干預DR的發(fā)展，改善DR癥狀，為進一步揭示活血解毒方防治DR的分子機制奠定基礎。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effect ofHuoxueJiedurecipe on the expressions of microRNA in the retina of diabetic rats

WANGHongliang，LVTiantian，XINGWei，etal.

CollegeofBasicMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor：WANGWei，E-mail：wangwei26960@126.com

Objective To observe the effects ofHuoxueJiedurecipe(HJR)on microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290,microRNA-129-5p,microRNA-30c-5p,microRNA-153-3p and micro RNA-423-5pin diabetic rats with retina to explore the mechanism of HJR in improving diabetic retinopathy.Methods 15 SPF male SD rats wereenrolled in this study.Single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ) was used to induce diabetic models.The diabetic rats were randomly divided into model and HJR.The rest 5 normal rats were treated as control group.After 20 weeks,the HJR group given HJR.The rats’ retina was removed after 12 weeks of treatment,total RNA was extracted from the retina.Real-time PCR method was used to determine the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290, microRNA-129-5p,microRNA-30c-5p,microRNA-153-3p and microRNA-423-5p.Results Compared with the control group,the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290,microRNA-129-5p and microRNA-30c-5p in model group were decreased(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05,P>0.05),the expressions of microRNA-153-3p and microRNA-423-5p were increased(P<0.01,P<0.05).Compared with the model group,the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p, microRNA-290,microRNA-129-5p and microRNA-30c-5p in HJR group increased(P>0.05,P<0.05,P>0.05,P<0.01,P<0.05),the expressions of microRNA-153-3p and microRNA-423-5p were decreased(P<0.01,P<0.01).Conclusion HJR may up-regulating the expressions of microRNA-125a-3p,microRNA-212-3p,microRNA-290,microRNA-129-5p,microRNA-30c-5pand down-regulating the expressions of microRNA-153-3p,microRNA-423-5p

Diabetic retinopathy；Huoxuejiedurecipe； MicroRNA

國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”專項(2009ZX09103-320)

100029 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院[王宏亮(碩士研究生)、呂甜甜(碩士研究生)、邢瑋(碩士研究生)、韓靜、吳晏、張子劍、王偉]

王宏亮(1989-)，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：中西醫(yī)結合藥理學研究。E-mail：17801084715@163.com

王偉(1964- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：中西醫(yī)結合藥理學研究。E-mail：wangwei26960@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.03.001

2016-03-11)