王彩霞 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

雞大腸桿菌的分離鑒定及自家滅活苗在生產(chǎn)中的應(yīng)用

王彩霞 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

雞病是由病原性大腸桿菌引起的雞的局部或全身性感染的總稱。常見的病型有敗血癥、胚胎及和幼雛死亡、眼炎及腫頭綜合癥、臍炎和肉芽腫。本病從雞的胚胎期到產(chǎn)蛋期可發(fā)生，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害很大，造成巨大的損失。大腸桿菌對(duì)很多抗菌藥物有耐藥性，通過分離到的大腸桿菌制備了自家滅活苗，結(jié)果顯示自家滅活苗有很好的效果。

大腸桿菌屬于腸桿菌科、埃希氏屬，致病性的有敗血性大腸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、產(chǎn)類志賀腸毒素大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌和尿道致病性大腸桿菌五大類，其中雞敗血性大腸桿菌危害最大。雞群爆發(fā)大腸桿菌病時(shí)，常發(fā)生繼發(fā)感染。大腸桿菌革蘭氏染色陰性，無(wú)芽孢，除少數(shù)菌株外，一般無(wú)莢膜，最適宜生長(zhǎng)pH7.2～7.4，在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24h，呈均勻生長(zhǎng)，管底有少量沉淀，液面與管壁形成菌膜，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、隆起、半透明、濕潤(rùn)、無(wú)色或灰白色的菌落。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 根據(jù)雞群發(fā)病情臨床癥狀及剖檢變化，取新鮮病死雞的肝臟。

1.2 分離細(xì)菌 初次分離的大腸桿菌，用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，劃線接種，在37℃需氧培養(yǎng)12～18h后長(zhǎng)出淡紅色菌落。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 挑取圓形、隆起、半透明、濕潤(rùn)、無(wú)色或灰白色的菌落涂片進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4 生化試驗(yàn) 將分離的細(xì)菌分別作糖發(fā)酵試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)和三糖鐵瓊脂試驗(yàn)，均在37℃恒溫下培養(yǎng)，觀察結(jié)果，逐一鑒定篩選。

1.5 純化細(xì)菌 挑選典型的菌落作純培養(yǎng)，然后移植到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～18h的培養(yǎng)物即為種子(一級(jí)種子)，再接種到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物為二級(jí)種子，……。使用一段時(shí)間后要復(fù)壯種子。

1.6 增菌培養(yǎng) 取種子液接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或者馬丁肉湯培養(yǎng)基中，接種量為培養(yǎng)基量的2%～4%。37℃培養(yǎng)10～14h或18～24h后呈現(xiàn)均勻渾濁。

1.7 測(cè)定菌數(shù) 活菌計(jì)數(shù)大于等于100億/ml培養(yǎng)基。

1.8 滅活 活菌計(jì)數(shù)后，將增菌培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中加入0.3-0.6%福爾馬林，37℃培養(yǎng)24-48h，每隔2～4h搖振一次，無(wú)菌檢驗(yàn)合格后備用。

1.9 加佐劑配苗 （1）油相制備：10號(hào)白油94份、司本-80 6份、硬脂酸鋁2份，先取適量10號(hào)白油與硬脂酸鋁混合，加熱熔化后再與其余的10號(hào)白油和司本-80混合，115℃高壓滅菌30min，冷卻后備用。（2）水相制備：取滅活好的菌液96份，加入冷卻后的吐溫-80 4份，充分振搖，使其溶解。（3）菌苗乳化：先將油相和水相1:1加入膠體磨中，10000rpm高速攪拌5min，充分乳化制成油包水的乳劑疫苗，分裝待檢。（4）無(wú)菌檢驗(yàn)：將油苗接種于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48～96h，觀察有無(wú)細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)。

1.10 安全性檢驗(yàn) 7～20日齡健康雛雞10只，每只肌肉注射1ml或其它量，設(shè)對(duì)照組10只注射生理鹽水，觀察2天，記錄有無(wú)不良反應(yīng)，同時(shí)檢查注射部位有無(wú)異常。

1.12 效力檢驗(yàn) 7～20日齡健康雛雞10只，每只肌肉注射1ml或其它量，設(shè)對(duì)照組10只注射生理鹽水，20d后，用1～10億個(gè)/只同型致病性大腸桿菌活菌混合液肌肉注射0.2ml，觀察10d，免疫組中保護(hù)率80%以上判為合格。

2 結(jié)論

雞大腸桿菌自家滅活苗針對(duì)性強(qiáng)，使用有局限性，使用一段時(shí)間后可能出現(xiàn)保護(hù)率低的問題，此時(shí)要更換菌種。經(jīng)試驗(yàn)證明油苗的各項(xiàng)性能安全，保護(hù)率高，應(yīng)激反應(yīng)小。

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