高淑娟 （山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

豬流行性腹瀉病毒的分子結(jié)構(gòu)和遺傳特性

高淑娟 （山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局 271000）

中圖分類號(hào)：S858.28文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-1733(2017)08-0058-02

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為主要特征[1]。PED于1971年在英國的養(yǎng)殖場首次出現(xiàn)，隨后傳遍整個(gè)歐洲大陸，以冬季零星爆發(fā)為主要特征。

PEDV粒子具有與冠狀病毒科冠狀病毒屬其他成員同樣的形態(tài)特征。病毒的抵抗力不強(qiáng)，對(duì)乙醚、氯仿等敏感，一般的消毒劑即可將其殺滅，病毒沒有血凝性，無法凝集豬、鼠、山羊、馬和人等12種不同動(dòng)物的紅細(xì)胞。PEDV適應(yīng)株經(jīng)60℃或以上處理30min即可失去感染能力。PEDV接種到Vero細(xì)胞，在無血清的培養(yǎng)液中加入10～100μg/ml胰蛋白酶的前提下，產(chǎn)生細(xì)胞病變，并可以傳代培養(yǎng)。

1 PEDV的分子結(jié)構(gòu)

PEDV是被膜病毒，線性正鏈RNA，基因組約28kb，兩端帶有帽子結(jié)構(gòu)(Cap)和Poly(A)尾巴?；蚪M包含5′非編碼區(qū)、3′非編碼區(qū)和7個(gè)開放閱讀框(ORF)。這7個(gè)開放閱讀框編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白)和3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a、復(fù)制酶1b和ORF3)，ORF3編碼一個(gè)未知功能并具有多態(tài)性的產(chǎn)物。

PEDV S基因編碼的S蛋白是種位于病毒粒子表面的纖突Ⅰ型糖蛋白，由1383個(gè)氨基酸(aa)組成，分子量為150-220kDa之間。從N端到C端分成4個(gè)主要結(jié)構(gòu)：包含一個(gè)信號(hào)肽區(qū)(1-18aa），四個(gè)中和位點(diǎn)區(qū)域(499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa)，一個(gè)跨膜區(qū)(1334-1356aa)和一個(gè)較短的胞內(nèi)區(qū)(Sato et al., 2011)。根據(jù)冠狀病毒S蛋白的同源性可以將其分為S1(1-789aa)和S2(790-1383)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，S2更為保守。S1負(fù)責(zé)識(shí)別和結(jié)合特異性受體，因病毒多樣性而變化結(jié)構(gòu)域，S2負(fù)責(zé)融合病毒膜與細(xì)胞膜的融合，使得其結(jié)構(gòu)相對(duì)單一。S蛋白位于病毒粒子的表面，當(dāng)位于細(xì)胞表面上的受體與病毒粒子結(jié)合后，S蛋白就會(huì)通過膜融合方式侵入到宿主細(xì)胞內(nèi)并在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。此外，利用病毒在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，適應(yīng)增殖，體內(nèi)培養(yǎng)使之毒力減弱這一特性，S蛋白成為研制防疫PEDV新型有效疫苗主要的目的蛋白。同時(shí)，科學(xué)家們還利用S基因的結(jié)構(gòu)來探究PEDV各病毒株之間的遺傳關(guān)系，流行性病學(xué)以及基因突變和病毒遺傳進(jìn)化等多個(gè)功能方面的研究。

2 PEDV的遺傳特性

（1）PEDV的M基因?yàn)?81bp，編碼226個(gè)氨基酸。M基因非行保守，分子病原學(xué)檢測PCR用到的引物一般是擴(kuò)增M基因的。M蛋白是一種跨膜蛋白，病毒粒子被膜中含量最多的一種成份，分子量為20～30kDa。M蛋白由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：處于病毒囊膜中大的C末端區(qū)、暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端區(qū)和位于中間位置的α螺旋區(qū)[2]。M蛋白與核衣殼的結(jié)合，在病毒粒子的裝配和出芽過程中起重要作用，M蛋白介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生a干擾素，同時(shí)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)，所以M蛋白也可以作為PEDV基因工程疫苗的候選基因[3]。（2）PEDV的N基因是最早被人們克隆認(rèn)識(shí)的，長約1326bp，編碼441個(gè)氨基酸序列的基礎(chǔ)性的磷酸化的核蛋白[4]。N蛋白分子量為58 kDa，在細(xì)胞質(zhì)中與病毒的基因組RNA結(jié)合，并相互纏繞形成螺旋狀的核衣殼。高表達(dá)量的抗N蛋白的抗體在PEDV感染早期的豬體內(nèi)就能產(chǎn)生，所以N蛋白可以作為早期PEDV感染診斷的目標(biāo)之一。（3）PEDV的E基因是最小的結(jié)構(gòu)蛋白基因，全長才231nt，同其他冠狀病毒一樣具有高同源性。E基因編碼76個(gè)氨基酸的小酸性II型囊膜蛋白E，分子量為8.3kD，是病毒包膜的組成部分。研究者發(fā)現(xiàn)將E基因與M基因共同導(dǎo)入pS2FV甲病毒載體中，經(jīng)過體外誘導(dǎo)成功表達(dá)。E蛋白與M蛋白相互協(xié)作形成病毒粒子，參與復(fù)制與出芽，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。（4）ORF3基因編碼223或224個(gè)氨基酸的包膜蛋白，有一個(gè)由6個(gè)His氨基酸組成的尾巴。因自身結(jié)構(gòu)的特性使得ORF3具有多態(tài)性，野生型與弱毒株的ORF3基因有個(gè)標(biāo)志性的區(qū)別，17個(gè)氨基酸的差異，專家推測這與病原性密切相關(guān)，導(dǎo)致病毒毒力不同[5]。（5）復(fù)制酶多聚蛋白ORF1a(12354nt)和ORF1b(8037nt)是一個(gè)多功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，位于5’UTR的下游，占據(jù)整個(gè)基因組的2/3，預(yù)測分子量為753kDa。與病毒基因子的復(fù)制相關(guān)[6]。

[1] Pensaert MB, Debouck P. A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine [J]. Arch Virol, 1978, 58 (3) : 243-247.

[2] Utiger A, Tobler K and Bridgen A. Identification of Protein Specified by Porcine Epidemic Diarrhea Virus[J]. Adv Exp Med Biol, 1995, 380: 287-290.

[3] Cornelis AM, Kuo L, Masters PS, Vennena H and Peter JM. Coronavirus particle assembly: primary structure requirements of the membrane protein[J]. J Virol, 1998, 72(8): 6838-6850.

[4] Narayanan K, Maeda A, Maeda J, Makino S. Characterization of the coronavirus M protein and nucleocapsid interaction in infected cells[J]. J Virol, 2000, 74(17): 8127-8134.

[5] Park SJ, Moon HJ, Yang JS, Lee CS, Song DS, Kang BK and Park BK. Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]. Virus Genes, 2007, 35(2): 321-332.

[6] Brian DA and Baric RS. Coronavirus genome structure and replication. Curr Top Microbiol Immunol, 2005, 287: 1-30.

2017–03–27）