陳 紅 方 英 徐春志 袁翠霞 景書(shū)灝

（貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng) 550000）

豬藍(lán)耳病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

陳 紅 方 英 徐春志 袁翠霞 景書(shū)灝

（貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng) 550000）

豬藍(lán)耳病又被成為豬繁殖與呼吸障礙綜合癥，這種疾病在臨床上能夠引發(fā)發(fā)燒、耳朵發(fā)紫以及伴有咳嗽的呼吸困難等癥，具有極高致死率的傳染性疾病，一旦發(fā)生，危害性極大，可能導(dǎo)致母豬的流產(chǎn)、繁殖障礙，大大增加了豬仔的死亡率。目前在豬藍(lán)耳病上，并沒(méi)有有效手段與藥物進(jìn)行治療，所以能夠提前診斷，找到快速診斷的技術(shù)顯得非常的關(guān)鍵。本文對(duì)豬藍(lán)耳病病毒的分離鑒定，分子生物學(xué)等診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為豬藍(lán)耳病的診斷和防控提供了一定理論依據(jù)。

豬藍(lán)耳??；病原學(xué)診斷；血清學(xué)診斷；分子生物學(xué)診斷

由病毒引起的豬藍(lán)耳病，會(huì)導(dǎo)致妊娠期母豬的早產(chǎn)、死胎、弱胎，導(dǎo)致豬的呼吸困難，不進(jìn)食等問(wèn)題，這種病毒被稱(chēng)作豬繁殖與呼吸綜合征病毒。楊漢春認(rèn)為我國(guó)目前流行的這種病毒屬于美洲型的毒株，湯德元將美洲型的毒株分為四種亞群，我國(guó)流行其中的三種，這三種病毒的傳播速度很快，在養(yǎng)豬密集、頻繁流轉(zhuǎn)的經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家，這種病毒更加危險(xiǎn)。豬繁殖與呼吸綜合征病毒導(dǎo)致的病證較為復(fù)雜，包括病毒的繼發(fā)感染等臨床癥狀。在診斷時(shí)，應(yīng)當(dāng)借助實(shí)驗(yàn)室的診斷技術(shù)幫助，從而為豬藍(lán)耳病提供診斷與防控的技術(shù)支持。

1 病毒的分離鑒定

病毒的分離鑒定，是一種比較切合實(shí)際的鑒定方法，能夠診斷PRRSV分離細(xì)胞，例如豬肺泡巨噬細(xì)胞、HS.2H克隆細(xì)胞等。對(duì)于用歐洲株來(lái)進(jìn)行分離PRRSV，只可以利用PAM細(xì)胞進(jìn)行。這種細(xì)胞來(lái)源于血清、脾臟、扁桃體、肺臟。在進(jìn)行PRRSV分離中，我們可以快速的從急性感染的豬身上得到。PRRSV的分布也有所不同，死胎脾臟、淋巴巨噬細(xì)胞分布多存在于流產(chǎn)的情況，新生的豬多分布在肺臟之中。冷藏冷凍能夠在遠(yuǎn)距離運(yùn)輸中保證采集的樣品的活性，在進(jìn)行特殊處理后，使其接種在單層PAMs細(xì)胞后，等待4d左右，就可以看到細(xì)胞病變。一開(kāi)始病變細(xì)胞出現(xiàn)膨大、圓形，而后開(kāi)始脫落、皺縮。接種在CL-2621細(xì)胞后，細(xì)胞病變變得遲緩很多，需要等待6d左右出現(xiàn)細(xì)胞的感染。接種在Marc-145細(xì)胞2d左右，則呈現(xiàn)激烈的細(xì)胞病變。在進(jìn)行毒株的細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)中，一些毒株不能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)帶來(lái)理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。而且，還應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)間接免疫熒光試驗(yàn)、免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)方法的驗(yàn)證。

2 血清學(xué)診斷方法

血清學(xué)試驗(yàn)應(yīng)用廣泛，是比較傳統(tǒng)的PRRSV診斷方法。血清學(xué)試驗(yàn)方法可以有較為明顯的特異性，但是缺乏足夠的敏感度。

2.1 中和試驗(yàn)

通過(guò)中和試驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)PRRSV抗體的特異性比較突出，但是敏感度不足，常常需要在等待將細(xì)胞感染后5周左右才能夠出現(xiàn)VN抗體，10周之后才可以達(dá)到最多。這主要是因?yàn)橹泻涂贵w出現(xiàn)的時(shí)間比較晚。與IPMA、IFA、ELISA等比較，可以發(fā)現(xiàn)中和試驗(yàn)的敏感度較低，不能夠很好的運(yùn)用到PRRSV感染的早期診斷之中。后人對(duì)這種情況進(jìn)行了研究與改進(jìn)，增加20%的豬的新鮮血清，從而提高了檢測(cè)的敏感程度，在10d左右的時(shí)間里得到了滴度較高的VN抗體。

2.2 間接熒光抗體試驗(yàn)

間接熒光抗體試驗(yàn)的特性與敏感度相似于免疫過(guò)氧物酶單層試驗(yàn)，并廣泛應(yīng)用在許多歐美發(fā)達(dá)國(guó)家之中。我國(guó)也在進(jìn)行相應(yīng)的IFA與微量IFA的試劑供應(yīng)。這種試劑能夠檢測(cè)到受到PRRSV感染6d之后的豬的抗體。抗體在30到50d左右達(dá)到峰值，然后逐漸下降，最后再4到6個(gè)月逐漸消失。這種方法在細(xì)胞培養(yǎng)上比較困難，對(duì)環(huán)境和人員的水平提出了很大的要求，而且只能得到PRRSV分離株。

2.3 免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)

免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)在眾多PPRSV抗體檢測(cè)中出現(xiàn)的最早，廣泛應(yīng)用在歐洲國(guó)家，其敏感度和特異性得到了普遍認(rèn)可。該方法能夠在感染病毒6d后的豬身上檢測(cè)到PRRSV抗體，這種方法是根據(jù)PAMs、CI-2621、Marc-145等完成的，然而這種方法的結(jié)果不能夠自動(dòng)顯示，需要人工觀察評(píng)判，其結(jié)果也容易受到背景著色的影響，出現(xiàn)偏差，而且還應(yīng)具備較高的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與倒置顯微鏡的觀測(cè)，成本較高，難以進(jìn)行大范圍的推廣。

3 PRRSV的分子生物學(xué)診斷

3.1 RT-PCR檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)在進(jìn)行PRRSV的檢測(cè)中，以其較高的敏感度得到了廣泛的應(yīng)用。其敏感度為pg水平。Suarez研究出了敏感度較高的RT-PCR方法，達(dá)到對(duì)隱性感染進(jìn)行檢測(cè)的水平。趙耘等運(yùn)用RT-PCR的診斷方法，能夠進(jìn)行更加簡(jiǎn)便的操作來(lái)增強(qiáng)檢測(cè)的敏感性。顧海洋等通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了高致病性豬藍(lán)耳病在基因上的87bp的連續(xù)缺失，這對(duì)豬的高致病性藍(lán)耳病的預(yù)測(cè)檢驗(yàn)方法提供了方向，建立了區(qū)別高致病性與低致病性豬藍(lán)耳病的一套方法。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)源于美國(guó)20世紀(jì)90年代，能夠合理的添加熒光基團(tuán)，通過(guò)熒光信號(hào)來(lái)監(jiān)測(cè)PCR過(guò)程，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到定量分析結(jié)果。這種方法能夠提高靈敏度、特異性、實(shí)時(shí)性，還可以實(shí)現(xiàn)DNA模版的定量化。當(dāng)前世界先進(jìn)領(lǐng)域例如分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域都在使用這種技術(shù)。

[1]胡玲玲，湯德元，曾智勇，等.豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J].豬業(yè)科學(xué)，2017，34（6）：113-116.

[2]陳叢琳.豬藍(lán)耳病診斷方法研究進(jìn)展[A].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)[C].2013：3.