楊永輝，李輝，郭素敏，李秀武，尹江凡，趙鵬，高莉,吳樹才

(1河北省胸科醫(yī)院·河北省肺癌防治研究中心，河北石家莊 050041；2 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

NK細(xì)胞對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H292的殺傷作用及對(duì)其β-catenin蛋白表達(dá)的影響

楊永輝1，李輝1，郭素敏1，李秀武1，尹江凡2，趙鵬2，高莉2,吳樹才1

(1河北省胸科醫(yī)院·河北省肺癌防治研究中心，河北石家莊 050041；2 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院)

目的探討自然殺傷(NK)細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞系NCI-H292的殺傷作用及對(duì)癌細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)的影響。方法無菌采集健康人外周血，培養(yǎng)NK細(xì)胞(NK組)，取培養(yǎng)14 d后的NK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，按1∶5的比例接種到NCI-H292細(xì)胞(NK+NCI-H292 組)培養(yǎng)板共培養(yǎng)24 h，單獨(dú)培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞(NCI-H292組)24 h。采用CCK-8法測(cè)算NK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞系NCI-H292的殺傷活性，采用Western blotting法檢測(cè)NCI-H292細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)。結(jié)果NK細(xì)胞對(duì)NCI-H292細(xì)胞的殺傷率為96.720%±1.081%，與NK及NCI-H292組比較，NK+NCI-H292組β-catenin表達(dá)降低(P均<0.01)。結(jié)論NK細(xì)胞對(duì)NCI-H292細(xì)胞具有殺傷力，同時(shí)能夠抑制NCI-H292細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)。

肺癌；NCI-H292細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞； Wnt/β-catenin信號(hào)通路;β-catenin蛋白

肺癌，又稱支氣管肺癌，發(fā)病率及病死率居癌癥之最[1]。肺癌包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其中，NSCLC的發(fā)病率占總肺癌發(fā)病率的80%～90%[2～5]。肺癌患者確診時(shí)多是晚期，錯(cuò)過治療的最好時(shí)期。雖然手術(shù)切除是目前治療該病的主要手段，但術(shù)后癌癥易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)治療藥物缺乏組織特異性，雖起到一定療效，但不良作用很大。目前國(guó)內(nèi)外權(quán)威性較高的第三代鉑類藥物與新藥共同治療，總生存率僅上升4.2%[6，7]。鑒于該病高危害性致使人類不斷探索新的治療手段，生物治療[8]的出現(xiàn)使肺癌治療提升到一個(gè)新的平臺(tái)。2015年1月～2016年1月，本實(shí)驗(yàn)探討了NK細(xì)胞對(duì)肺腺癌細(xì)胞系NCI-H292的殺傷作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類非小細(xì)胞肺癌NCI-H292細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；NK細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自制；1640細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640)購自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任有限公司；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素2(IL-2) 購自Peprotech公司；抗人CD3單抗購自武漢生物制品研究所；SDS蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；β-catenin多克隆抗體購自Abcam公司；β-actin多克隆抗體購自晶美公司。流式細(xì)胞儀購自德國(guó)BD公司，CO2培養(yǎng)箱購自美國(guó)Themro公司， MK3 酶標(biāo)儀購自美國(guó)Thermo公司，蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離及培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞，每天使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行1/2傳代培養(yǎng)。無菌、靜脈采集28歲健康志愿者外周血，用EDTA抗凝，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血，獲得PBMC細(xì)胞，以無血清的PRMI-1640培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到5×106/mL，細(xì)胞移入6孔板中，3 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁3 h后，輕搖培養(yǎng)板，貼壁細(xì)胞去掉，未貼壁細(xì)胞用來培養(yǎng)NK細(xì)胞。

1.3 分組及處理 在上述未貼壁細(xì)胞中加入細(xì)胞因子IL-2(2 500 U/mL)、IL-15(1 000 U/mL)、IL-4、GSF(10 ng/mL)、RPMI-1640的培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液，并及時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞因子培養(yǎng)NK細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H292細(xì)胞，計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為NK組(將誘導(dǎo)的NK細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)24 h)、NK+NCI-H292 組(取培養(yǎng)14 d后的NK細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL，按1∶5的比例接種到NCI-H292細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h)、NCI-H292組(單獨(dú)培養(yǎng)NCI-H292細(xì)胞24 h)，每組細(xì)胞的接種濃度相同。

1.4 NK細(xì)胞作用后NCI-H292細(xì)胞增殖活力的檢測(cè) 采用CCK-8 法。在96孔板中配制細(xì)胞懸液100 μL。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，5% CO2)。向培養(yǎng)板加入不同濃度的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞10 μL。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育20 h。向每孔加入CCK8溶液10 μL 。 用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A值)。在各組細(xì)胞培養(yǎng)20 h時(shí)加入CCK-8，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)492 nm處的A值，并計(jì)算殺傷活性。計(jì)算公式：殺傷率(%)=[A(加NK細(xì)胞) -A(空白)]/[A(不加NK細(xì)胞)-A(空白)]×100。

1.5 NCI-H292細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blotting法。SDS裂解液裂解共培養(yǎng)的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)蛋白濃度，分裝蛋白，-20 ℃保存，計(jì)算上樣量。取60 μg蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，加入一抗，4 ℃過夜，洗膜，加入二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜，加化學(xué)發(fā)光液，進(jìn)行顯影。化學(xué)發(fā)光劑顯色后，蛋白凝膠成像系統(tǒng)分析樣品中目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn) NCI-H292細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)。PBMC在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)過程中，在細(xì)胞因子的刺激作用下，細(xì)胞個(gè)頭小，亮且圓，分布均勻，一段時(shí)間后，可見部分單個(gè)核細(xì)胞明顯分化擴(kuò)增為NK細(xì)胞，形成細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)第6天倒置顯微鏡觀察可見細(xì)胞增殖明顯，呈集落狀分布。培養(yǎng)第14天，可見細(xì)胞呈圓球狀，細(xì)胞核大且圓。

2.2 各組NCI-H292細(xì)胞增殖活力比較 NK、NK+NCI-H292、NCI-H292組細(xì)胞A值分別為2.629±0.071、3.018±0.114、3.937±0.202，NK+NCI-H292組A值低于NCI-H292組(P<0.05)。NK對(duì)NCI-H292細(xì)胞的殺傷率為96.720%±1.081%。

2.3 各組細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)比較 NK、NCI-H292、NK+NCI-H292組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.515±0.039、0.481±0.031、0.136±0.027，與NK及NCI-H292組比較，NK+NCI-H292組β-catenin表達(dá)降低(P均<0.01)。

3 討論

NK細(xì)胞是大淋巴細(xì)胞，平均直徑為12～15 μm，胞質(zhì)較多，具有腎形核結(jié)構(gòu)，在胞質(zhì)內(nèi)有許多大小不等的嗜天青顆粒，故又稱大顆粒淋巴細(xì)胞，核呈卵圓形。NK細(xì)胞不需抗原激活，更不需抗體的協(xié)助，可直接殺傷靶細(xì)胞，例如殺傷被病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，且這種抗感染和抗腫瘤的殺傷作用是廣譜的，屬于天然免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞組成成分，具有免疫監(jiān)視和免疫清除功能[9，10]。70年代初NCI的研究人員在研究T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的特異殺傷時(shí)發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照小鼠的脾細(xì)胞可以象免疫小鼠的脾細(xì)胞一樣殺傷某些腫瘤細(xì)胞。由于這些被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞并不需要致敏或者提前免疫就會(huì)出現(xiàn)殺傷功能，因而取名為天然殺傷細(xì)胞[11，12]。NK細(xì)胞由骨髓造血干細(xì)胞發(fā)育形成，在骨髓中產(chǎn)生與分化，成熟后被釋放到血液中，占單個(gè)核細(xì)胞的5%～10%，其除能直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞外，也可通過ADCC效應(yīng)發(fā)揮殺傷作用。主要生物學(xué)作用包括4個(gè)方面：非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分；抗病毒感染；參與抗骨髓移植和移植物抗宿主反應(yīng)；參與免疫調(diào)節(jié)，NK細(xì)胞本身能夠產(chǎn)生IFNγ和IL-2等淋巴因子，對(duì)機(jī)體的免疫應(yīng)答具有一定的調(diào)節(jié)作用。

Wnt信號(hào)通路是一條能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的信號(hào)通路，涉及個(gè)體發(fā)育，細(xì)胞增殖、分化、凋亡和壞死等多個(gè)方面。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的核心蛋白成分[13]。在Maria等[14]建立的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中，激活的Wnt信號(hào)增加了腫瘤的概率。大量研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在乳腺癌、大腸癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中均異常表達(dá)。Wnt信號(hào)通路的活性與β-catenin有關(guān)。Mazieres等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Wnt蛋白(Wnt-1、Wnt-2)表達(dá)上調(diào)，Wnt對(duì)抗物WIF-1、DKK轉(zhuǎn)錄終止，進(jìn)一步研究表明，β-catenin在包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤細(xì)胞中高表達(dá)。

本試驗(yàn)通過Ficoll密度梯度離心法分離健康志愿者PBMC，加入不同的細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)NK細(xì)胞，與肺腺癌細(xì)胞NCI-H292聯(lián)合培養(yǎng)后測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1∶5的比例混合共培養(yǎng)后，NK能夠殺傷NCI-H292細(xì)胞，殺傷率為96.72%±1.081%。與NK及NCI-H292組比較，NK+NCI-H292組β-catenin表達(dá)降低。提示NK細(xì)胞可能通過下調(diào)Wnt信號(hào)通路從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，為肺癌患者的免疫療法提供了一定的理論依據(jù)。

[1] She J, Yang P, Hong Q, et al. Lung cancer in China: challenges and interventions [J]. Chest, 2013,143(4):1117-1126.

[2] Dyawanapelly S, Ghodke SB, Vishwanathan R， et al. RNA interference-based therapeutics: molecular platforms for infectious diseases[J]. J Biomed Nanotechnol， 2014，10(9):1998-2037.

[3] Wei KR, Yu X, Zheng RS, et al. Incidence and mortality of liver cancer in China, 2010 [J]. Chin J Cancer, 2014,33(8):388-394.

[4] Swisher SG, Roth JA. Clinical update of Ad-p53 gene therapy for lung cancer[J]. Surg Oncol Clin N Am, 2002,11(3):521-535.

[5] 康倩,徐丹妮.EGFR-TKIs治療晚期非小細(xì)胞肺癌的成本-效果分析[J].藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)研究,2013,30(6):377-380.

[6] Reed E. Platinum-DNA adduct, nucleotide excision repair and platinum based anti-cancer chemotherapy[J]. Cancer Treat Rev, 1998,24(5):331-344.

[7] Mendrola JM, Berger MB, King MC, et al. The single transmembrane domains of ErbB receptors self-associate in cell membranes [J]. J Biol Chem, 2002,277(7):4704-4712.

[8] 郝希山,任秀寶.實(shí)體腫瘤細(xì)胞免疫治療[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：93-95 .

[9] Lefterova P, M?rten A, Buttgereit P, et al. Targeting of natural killer-like T immunologic effector cells against leukemia and lymphoma cells by reverse antibody-dependent cellular cytotoxicity[J]. J Immunother, 2000,23(3):304-310.

[11] Medrano RFV, Hunger A, Mendona SA, et al. Immunomodulatory and antitumor effects of type I interferons and their application in cancer therapy[J]. Oncotarget, 2017,8(41):71249-71284.

[12] Schmidt-Wolf IG, Lefterova P, Mehta BA, et al. Phenotypic characterization and identification of effector cells involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cells[J]. Exp Hematol， 1993，21(13):1673-1679.

[13] Kesiraju S, Ch UM, Paritala P, et al. Unexplained post-renal transplant tolerance: a case report[J]. Immunol Res, 2016,64(3):791-794.

[14] Maria R, Guillermo A, Guadalupe A, et al. Stem cell and lung cancer development: blaming the Wnt, Hh and Notch signalling pathway[J]. Clin Transl Oncol, 2011,13(2):77-83.

[15] Mazieres J, He B, You L, et al. Wnt signaling in lung cancer[J]. Cancer Lett, 2005，222(1):1-10.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.45.010

R734.2

A

1002-266X(2017)45-0033-03

河北省省級(jí)重大醫(yī)學(xué)研究課題(ZD2013063)。

吳樹才(E-mail:freebirdgo@163.com)

2017-02-23)