王國(guó)云，楊旭，徐天舒

(常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州213000)

VEGF-C在口腔頜面部淋巴管瘤組織中表達(dá)變化及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

王國(guó)云，楊旭，徐天舒

(常州市第一人民醫(yī)院，江蘇常州213000)

目的探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)在口腔頜面部淋巴管瘤(OML)發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法收集OML組織(OML組)和瘤旁正常組織(Control組)各54例份，采用qRT-PCR法檢測(cè)組織中VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用免疫組化法檢測(cè)VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)率。將體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304隨機(jī)分為兩組，分別轉(zhuǎn)染sh-VEGF-C質(zhì)粒(觀察組)和對(duì)照質(zhì)粒sh-control(對(duì)照組)，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，分別采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)VEGF-C mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力(以吸光度值表示)。結(jié)果OML組與Control組VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.061±0.284、0.801±0.098，VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.10%(42/54)、10.13%(5/54)，兩組比較P<0.05或<0.01。觀察組與對(duì)照組VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.200±0.058、0.967±0.017，VEGF-C蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.319±0.021、0.965±0.039，吸光度值分別為0.393±0.015、0.975±0.004，兩組比較P均<0.01。結(jié)論VEGF-C在OML組織中高表達(dá)；降低VEGF-C表達(dá)可抑制人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

口腔頜面部淋巴管瘤；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖

口腔頜面部淋巴管瘤(OML)是高發(fā)于面部皮膚、口腔黏膜及皮下組織等頭頸部多個(gè)部位的淋巴管病變，在兒童中發(fā)病率較高[1]。淋巴管的形成由多種促進(jìn)因子和抑制因子共同調(diào)控，兩者平衡一旦被打破，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量發(fā)生改變，可能導(dǎo)致淋巴管瘤或脈管畸形[2]。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移與增殖常依賴于淋巴管的轉(zhuǎn)運(yùn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)是重要且特異的促淋巴管形成內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤如乳腺癌、胃癌中異常表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展密切相關(guān)[3,4]。目前關(guān)于VEGF-C與OML的關(guān)系鮮見報(bào)道。為此，我們于2015年7月～2016年12月進(jìn)行了本研究，旨在探討VEGF-C在OML發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 ①組織樣本：收集我院病理科存檔的54例OML患者的瘤組織標(biāo)本(OML組)及瘤旁正常組織標(biāo)本(Control組)。OML患者男27例、女27例，年齡0.3～32(11.4±10.5)歲，口腔頜面部毛細(xì)管型淋巴管瘤、海綿狀淋巴管瘤和囊腫淋巴管瘤各18例?；颊咝g(shù)前均未接受硬化等治療。②細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化與細(xì)胞生物學(xué)研究所。將ECV304細(xì)胞置于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)收集細(xì)胞，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋，制備密度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種至6孔板。細(xì)胞融合至60%～80%時(shí)隨機(jī)分為兩組，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒sh-VEGF-C(觀察組)及sh-control(對(duì)照組)。③主要試劑：兔抗人VEGF-C單抗和兔抗人GAPDH多抗(美國(guó)CST公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；VEGF-C抑制性慢病毒載體質(zhì)粒sh-VEGF-C及對(duì)照空載體質(zhì)粒sh-control(美國(guó)GeneCopoeia公司構(gòu)建)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Life Technologie公司)，qSYBR-Green-containing PCR kit試劑盒(美國(guó)GeneCopoeia公司)，兩步法免疫檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Dako公司)，MTT細(xì)胞生長(zhǎng)增殖/毒性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 組織標(biāo)本VEGF-C表達(dá)檢測(cè) ①VEGF-C mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用qRT-PCR法。取OML組和Control組標(biāo)本，TRIzol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；以cDNA為模板，參照qRT-PCR說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)CT值。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量。②VEGF-C蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組化法。取OML組和Control組標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋后切片，梯度乙醇脫蠟?？乖迯?fù)，血清封閉，滴加VEGF-C抗體(1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS沖洗5 min×3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min；顯色劑顯色后蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片；顯微鏡下(×200)采集圖像。VEGF-C蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，以陽(yáng)性細(xì)胞在全部細(xì)胞中所占比例和陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度綜合判定結(jié)果：A：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1/3為1分，1/3～<2/3為2分，≥2/3為3分；B：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。A×B=0判斷為-，1～2為+，3～4為++，5～9為+++。+、++、+++均為陽(yáng)性，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性表達(dá)率。

1.3 細(xì)胞VEGF-C表達(dá)及細(xì)胞增殖能力檢測(cè) ①VEGF-C mRNA表達(dá)：采用qRT-PCR技術(shù)。TRIzol法提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48 h的觀察組和對(duì)照組細(xì)胞RNA，檢測(cè)VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量，具體步驟參照1.2中①。②VEGF-C蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48 h的觀察組和對(duì)照組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。分別取30 μg樣本進(jìn)行10% SDS-PAGE。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% BSA室溫封閉1～2 h，加入1∶1 000的兔抗人VEGF-C和GAPDH抗體，4 ℃孵育過(guò)夜后TBST洗膜，1∶2 000羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL發(fā)光劑并用X片曝光、顯影、定影、掃描，保存條帶圖片。采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。③細(xì)胞增殖能力：采用MTT法。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48 h的觀察組和對(duì)照組細(xì)胞接種到96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合至接近90%時(shí)，每孔加入滅菌MTT液30 μL(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h；每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min；采用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(A)值。

2 結(jié)果

2.1 OML組與Control組VEGF-C表達(dá)比較 OML組與Control組VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.061±0.284、0.801±0.098，兩組比較P<0.05。VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)，少量見于細(xì)胞膜，OML組及Control組VEGF-C蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.10%(42/54)、10.13%(5/54)，兩組比較P<0.01。

2.2 觀察組與對(duì)照組VEGF-C表達(dá)及細(xì)胞增殖能力比較 觀察組與對(duì)照組VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.200±0.058、0.967±0.017，VEGF-C蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.319±0.021、0.965±0.039，A值分別為0.393±0.015、0.975±0.004，兩組比較P均<0.01。

3 討論

OML是由淋巴管擴(kuò)張或增生而成的口腔頜面部常見良性腫瘤，可造成由內(nèi)皮細(xì)胞排列的管腔內(nèi)充滿大量淋巴液，且一般不會(huì)自行消退[5,6]；臨床上多采用冷凍治療、硬化治療、放療、化療或手術(shù)治療等，以手術(shù)治療為主。近年來(lái)平陽(yáng)霉素瘤內(nèi)注射，同時(shí)針狀型微波輻射器刺入瘤內(nèi)熱凝等方法應(yīng)用于治療OML，雖治療效果明顯提升，但易導(dǎo)致內(nèi)皮增生等多種不良反應(yīng)[7,8]。血管新生及內(nèi)皮增生均需要多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的共同作用才可實(shí)現(xiàn)，其中VEGF家族可直接或間接調(diào)控血管或淋巴管生成，提高血管通透性并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖[9]。VEGF是目前促血管生成作用最為顯著的生長(zhǎng)因子，為多功能的細(xì)胞因子家族，其家族成員包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)。其中VEGF-C在人類胚胎組織及成熟組織中均存在，其分布特點(diǎn)是外周血白細(xì)胞、胸腺、肝臟和腦中表達(dá)量較低，心臟、卵巢、胎盤和小腺體中表達(dá)量較高[10,11]。

本研究結(jié)果顯示，OML組織中VEGF-C mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常組織，即VEGF-C在OML患者瘤組織中高表達(dá)，提示VEGF-C高表達(dá)促進(jìn)OML的發(fā)生[12,13]。ECV304細(xì)胞可通過(guò)自發(fā)轉(zhuǎn)化獲得，細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)呈單層鵝卵石狀，具有接觸抑制效應(yīng)，且培養(yǎng)時(shí)不需要添加任何特殊的生長(zhǎng)因子即可獲得良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，是理想的OML研究模型。本研究分別轉(zhuǎn)染VEGF-C的抑制質(zhì)粒sh-VEGF-C及其對(duì)照質(zhì)粒sh-control到ECV304細(xì)胞中，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示抑制VEGF-C表達(dá)可顯著降低ECV304細(xì)胞的增殖能力，提示VEGF-C具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的作用[14]。VEGF及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)可構(gòu)成VEGF/VEGFR生物軸，該生物軸由多重受體和配體相互疊加構(gòu)成，由于受體和配體的結(jié)合具有專一性，因此不同細(xì)胞中VEGF/VEGFR表達(dá)和功能各不相同，VEGF信號(hào)被激活時(shí)，可觸發(fā)信號(hào)通路的網(wǎng)狀傳導(dǎo)，最終促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移[15]。因此，在VEGF-C信號(hào)被抑制時(shí)其下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)也被阻斷，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

綜上所述，VEGF-C在OML組織中高表達(dá)；抑制VEGF-C表達(dá)可抑制人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。VEGF-C高表達(dá)可能參與了OML的發(fā)生、發(fā)展。

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ExpressionofVEGF-Cinoralandmaxillofaciallymphangiomaanditseffectonproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcells

WANGGuoyun,YANGXu,XUTianshu

(ChangzhouFirstPeople′sHospital,Changzhou213000,China)

ObjectiveTo explore the expression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) in the occurrence and development of oral and maxillofacial lymphangioma (OML).MethodsThe tumor tissues (OML group) and the adjacent normal tissue (control group) from OML patients were collected. The real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression of VEGF-C mRNA in the tissues. Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the positive rate of VEGF-C protein expression in the tissues. ECV304 cells cultured in vitro were randomly divided into two groups: the observation group which was transfected with sh-VEGF-C plasmid and the control group transfected with control plasmid sh-control. After 48-hour transfection, qRT-PCR and Western blotting were used to detect the relative expression of VEGF-C protein, and MTT assay was used to detect the proliferation of the cells (absorbance value).ResultsIn the OML group and control group, the expression of VEGF-C mRNA was 1.061±0.284 and 0.801±0.098, respectively; the positive expression rates of VEGF-C protein was 84.10% (42/54) and 10.13% (5/54), respectively (P<0.05 orP<0.01). In the observation group and control group, the relative expression levels of VEGF-C mRNA were 0.200±0.058 and 0.967±0.017, respectively; the relative expression levels of VEGF-C protein were 0.319±0.021 and 0.965±0.039, respectively; the A values were 0.393±0.015 and 0.97±0.004, respectively; significant differences were found between these two groups (allP<0.01).ConclusionsVEGF-C is highly expressed in the OML tissues, and decreasing VEGF-C can inhibit the proliferation of human umbilical vein endothelial cells.

oral and maxillofacial lymphangioma; vascular endothelial growth factor-C; human umbilical vein endothelial cells; cell proliferation

江蘇省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)資助項(xiàng)目(2016562)。

王國(guó)云(1980-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榭谇活M面部腫瘤整復(fù)治療。E-mail： chenzehui9578@qq.com

楊旭(1983-)，男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)榭谇活M面部惡性腫瘤整復(fù)治療。E-mail： lihunzhinan@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.007

R739.81

A

1002-266X(2017)44-0026-03

2017-07-05)