張弢，王淼舟，張艷虹，朱國龍，李天如

(1青海省婦女兒童醫(yī)院，西寧810007；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

·臨床研究·

維生素D受體基因ApaⅠ、TaqⅠ多態(tài)性與青藏高原藏族兒童結(jié)核病易感性的關(guān)系

張弢1，王淼舟2，張艷虹1，朱國龍1，李天如1

(1青海省婦女兒童醫(yī)院，西寧810007；2青海大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的探討維生素D受體基因ApaⅠ、TaqⅠ多態(tài)性與青藏高原藏族兒童結(jié)核病易感性的關(guān)系。方法選擇青藏高原藏族活動(dòng)性肺結(jié)核患兒162例(觀察組)和有分枝桿菌接觸史的青藏高原藏族健康兒童167例(對(duì)照組)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析法檢測兩組外周血維生素D受體基因ApaⅠ、TaqⅠ多態(tài)性。結(jié)果觀察組ApaⅠ基因型為AA、Aa、aa者分別為10例(6.2%)、72例(44.5%)、80例(49.4%)，對(duì)照組分別為22例(13.2%)、79例(47.3%)、66例(39.5%)，觀察組aa基因型頻率高于對(duì)照組(P<0.05)。觀察組A、a等位基因頻率分別為28.4%、71.6%，對(duì)照組分別為36.8%、63.2%，兩組A、a等位基因頻率比較P均<0.05。觀察組TaqⅠ基因型為TT、Tt、tt者分別為138例(85.2%)、24例(14.8%)、0例，對(duì)照組分別為146例(87.4%)、21例(12.6%)、0例，兩組TaqⅠ基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組T、t等位基因頻率分別為92.6%、7.4%，對(duì)照組分別為93.7%、6.3%，兩組T、t等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性與青藏高原藏族兒童肺結(jié)核易感性相關(guān)，其aa基因型可能是發(fā)病相關(guān)因素；TaqⅠ多態(tài)性與青藏高原藏族兒童肺結(jié)核易感性無關(guān)。

維生素D受體；ApaⅠ基因；TaqⅠ基因；肺結(jié)核；藏族；青藏高原；兒童

結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸除與病原體的致病能力及環(huán)境因素有關(guān)外，還與宿主遺傳因素密切相關(guān)[1]。研究顯示，結(jié)核病的遺傳易感性是多基因相關(guān)的，相關(guān)基因包括人類白細(xì)胞抗原(HLA)、非HLA基因、維生素D受體基因、甘露糖結(jié)合植物凝集素基因等[2]。藏族居民世居于高原，因交通不便，與外來人口交流少，故結(jié)核病菌暴露時(shí)間短，歷史上受自然選擇的影響相對(duì)較弱，導(dǎo)致攜帶結(jié)核易感基因的人有更大概率存活并繁殖后代，使結(jié)核易感基因得以遺傳。故現(xiàn)居高原的藏族居民可能攜帶較多的結(jié)核易感基因[2]。本研究探討維生素D受體基因ApaⅠ、TaqⅠ多態(tài)性與青藏高原藏族兒童結(jié)核病易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2015年12月青海省婦女兒童醫(yī)院收治的青藏高原藏族活動(dòng)性肺結(jié)核患兒162例為觀察組，其中男72例、女90例，年齡0～16歲?；純壕鶕?jù)病史、臨床表現(xiàn)、細(xì)菌學(xué)及影像學(xué)檢查確診，且除外患有自身免疫性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、HIV感染及長期使用腎上腺皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑者。選擇同期接受健康查體的有結(jié)核分枝桿菌接觸史的青藏高原藏族健康兒童167例為對(duì)照組，其中男76例、女91例，年齡0～16歲。結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)硬結(jié)反應(yīng)平均直徑<5 mm，經(jīng)胸透無異常發(fā)現(xiàn)，隨訪1年未發(fā)現(xiàn)罹患結(jié)核。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，受試者監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 外周血維生素D受體基因ApaⅠ、TaqⅠ多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析法。抽取兩組外周血200 μL，以DNeasy Blood & Tissue Kit從血中分離白細(xì)胞，并獲得DNA。行PCR擴(kuò)增，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。ApaⅠ上游引物為5′-TCAAGTTCCAGGTGGGACTGA-3′， 下游引物為5′-CAAGGG-

TCACTGCACATTGCT-3′。TaqⅠ上游引物為5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3′，下游引物為5′-CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAG-3′。PCR反應(yīng)體系15 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物濃度。以ApaⅠ內(nèi)切酶及TaqⅠ內(nèi)切酶對(duì)維生素D受體基因的兩種多態(tài)性進(jìn)行分型，前者分為AA、Aa、aa三種基因型，后者分為TT、Tt、tt三種基因型。酶切產(chǎn)物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳(90 V電壓)分離酶切片段，用0.5 μg/mL溴乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并確定基因型。維生素D受體ApaⅠ基因型AA型為純合子，酶切得到長度501 bp的一個(gè)片段；aa型為純合子，酶切得到長度284、217 bp的兩個(gè)片段；Aa為雜合子，酶切得到長度501、284、217 bp的三個(gè)片段。TaqⅠ基因TT型為純合子，酶切得到長度494 bp的一個(gè)片段；Tt型為雜合子，酶切得到長度494、293、201 bp的三個(gè)片段；tt型為純合子，酶切得到長度293、201 bp的兩個(gè)片段。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件?；蛐图暗任换蝾l率均以率表示，結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組ApaⅠ基因型為AA、Aa、aa者分別為10例(6.2%)、72例(44.5%)、80例(49.4%)，對(duì)照組分別為22例(13.2%)、79例(47.3%)、66例(39.5%)，觀察組aa基因型頻率高于對(duì)照組(P<0.05)。觀察組A、a等位基因頻率分別為28.4%、71.6%，對(duì)照組分別為36.8%、63.2%，兩組A、a等位基因頻率比較P均<0.05。觀察組TaqⅠ基因型為TT、Tt、tt者分別為138例(85.2%)、24例(14.8%)、0例，對(duì)照組分別為146例(87.4%)、21例(12.6%)、0例，兩組TaqⅠ基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組T、t等位基因頻率分別為92.6%、7.4%，對(duì)照組分別為93.7%、6.3%，兩組T、t等位基因頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

近年來隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，遺傳因素在結(jié)核發(fā)生、發(fā)展中的作用得到證實(shí)[3]。維生素D受體是一種親核蛋白，屬于類固醇激素、甲狀腺受體超家族的成員，在維持機(jī)體鈣磷代謝、調(diào)節(jié)骨骼代謝方面具有重要作用，同時(shí)也與結(jié)核的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[4,5]。本研究結(jié)果顯示，兩組維生素D受體基因TaqⅠ各基因型頻率和等位基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性的各基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，aa基因型可能是發(fā)病相關(guān)因素。

維生素D受體基因ApaⅠ的多態(tài)性位點(diǎn)位于VDR基因3′的第8內(nèi)含子處，可發(fā)生A/C轉(zhuǎn)換，但其多態(tài)性不影響氨基酸的編碼序列[6]。Bornman等[7]研究結(jié)果顯示，維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性與西非患者結(jié)核易感性相關(guān)。而Lee等[8]對(duì)東亞人維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性與結(jié)核易感性關(guān)系進(jìn)行的Meta分析結(jié)果顯示，維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性與結(jié)核病無關(guān)，與Soborg等[9]對(duì)東非坦桑尼亞人群進(jìn)行的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，ApaⅠ多態(tài)性與藏族兒童結(jié)核發(fā)病具有相關(guān)性，提示該位點(diǎn)多態(tài)性導(dǎo)致結(jié)核的發(fā)生可能與民族、環(huán)境有一定關(guān)系。TaqⅠ多態(tài)性位點(diǎn)位于維生素D受體基因3′的第9外顯子中，可發(fā)生T/C突變，但這是一種同義突變，并不影響氨基酸的編碼順序。有研究顯示，TT基因型患者維生素D受體基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)量較tt基因型者分別高25.8%和62.9%[10]。Cao等[11]對(duì)東亞及西亞人進(jìn)行的Meta分析顯示，維生素D受體基因TaqⅠ多態(tài)性與結(jié)核具有相關(guān)性。而Lee等[8]對(duì)東亞人維生素D受體基因TaqⅠ多態(tài)性與結(jié)核易感性的關(guān)系進(jìn)行了Meta分析，結(jié)果顯示二者不具有相關(guān)性，因此推測TaqⅠ位點(diǎn)多態(tài)性可能亦與民族及環(huán)境有關(guān)。

綜上所述，青藏高原藏族兒童維生素D受體基因ApaⅠ多態(tài)性與結(jié)核易感性有關(guān)，而TaqⅠ多態(tài)性與結(jié)核易感性沒有相關(guān)性。本研究結(jié)果與其他民族有一定差異性，可能是青藏高原藏族人群的特點(diǎn)之一。

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青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013-Z-740)。

王淼舟(E-mail： 18609780039@163.com)

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R725.6

B

1002-266X(2017)44-0051-03

2016-11-10)