張文娟，曾曉莉,2，趙博，何治

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002；2湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院)

HCN通道的結(jié)構(gòu)與功能及其功能調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞分子機(jī)制研究進(jìn)展

張文娟1，曾曉莉1,2，趙博1，何治1

(1三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002；2湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院)

超極化激活環(huán)核苷酸陽離子門控通道(HCN通道)參與許多重要的生理活動(dòng)，包括竇房結(jié)自律性、學(xué)習(xí)和記憶、突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放、樹突整合等，并且與癲癇、神經(jīng)病理性疼痛、腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。HCN通道除受細(xì)胞內(nèi)cAMP調(diào)節(jié)外，還受細(xì)胞內(nèi)外小分子物質(zhì)(cGMP、cCMP及離子、磷脂酰肌醇絲氨酸)、蛋白質(zhì)(小分子蛋白、蛋白激酶)及一些神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、γ-氨基丁酸、乙酰膽堿、神經(jīng)肽類物質(zhì)、去甲腎上腺素、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、NO、嘌呤類神經(jīng)遞質(zhì))的調(diào)節(jié)，這些物質(zhì)除了調(diào)節(jié)HCN通道的開放以外，還調(diào)控該通道的表達(dá)、分布及功能特性，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理功能。

超極化激活環(huán)核苷酸陽離子門控通道；電生理功能；細(xì)胞分子機(jī)制

超極化激活環(huán)核苷酸陽離子門控通道(HCN通道)最早在兔的竇房結(jié)中被發(fā)現(xiàn)，隨后在海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)，可介導(dǎo)超級(jí)化激活的內(nèi)向非特異性電流Ih。研究表明，HCN通道參與許多重要的生理活動(dòng)，如竇房結(jié)自律性、學(xué)習(xí)和記憶、突觸神經(jīng)遞質(zhì)釋放、樹突整合等，并且與癲癇、神經(jīng)病理性疼痛、腦血管疾病發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)聯(lián)[1]。本文就HCN通道的結(jié)構(gòu)與功能及其功能調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞分子調(diào)節(jié)機(jī)制作一綜述。

1 HCN通道的結(jié)構(gòu)與功能

HCN通道有4種亞型，分別為HCN1～HCN4，4種亞型的結(jié)構(gòu)非常相似，均由同源或異源四聚體聚合而成。HCN通道與電壓門控的鉀通道具有高度同源性，均介導(dǎo)超級(jí)化激活的內(nèi)向非特異性電流。HCN通道的分子結(jié)構(gòu)是一種跨膜的膜蛋白，由3個(gè)重要的模塊組成，包含6個(gè)跨膜核心區(qū)、COOH-末端和NH2-末端。6個(gè)跨膜核心區(qū)分別稱為 S1～S6，該區(qū)域有兩個(gè)重要的功能區(qū)域，即能感受正電荷的電壓感受區(qū)域S4和特殊的小孔結(jié)構(gòu)P區(qū) 。HCN分子在胞內(nèi)區(qū)的NH2-末端是糖基化位點(diǎn)，與S1相連接，只有在發(fā)生糖基化以后該通道才能發(fā)揮作用。在與S6連接的COOH-末端還含有一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)區(qū)域，即環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)(CNBD)，該結(jié)構(gòu)能與cAMP直接結(jié)合，通過其在細(xì)胞內(nèi)水平變化來調(diào)控通道開放[2]。HCN通道的分布主要集中于心臟和神經(jīng)系統(tǒng)，具備有許多生理功能：①穩(wěn)定靜息膜電位；②突觸整合；③抑制海馬長時(shí)程，參與學(xué)習(xí)記憶；④參與循環(huán)系統(tǒng)傳導(dǎo)；⑤參與丘腦自發(fā)節(jié)律調(diào)節(jié)等[3]。

2 HCN通道功能調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞分子機(jī)制

2.1 HCN通道功能調(diào)節(jié)相關(guān)的小分子物質(zhì)

2.1.1 cAMP、cGMP及cCMP cAMP是HCN通道調(diào)控的重要分子，能超極化激活HCN通道。Chow等[4]發(fā)現(xiàn)，在缺乏或是抑制cAMP表達(dá)的動(dòng)物模型中，HCN通道的COOH-末端連接區(qū)會(huì)被抑制，限制HCN通道S6區(qū)移動(dòng)，使通道的內(nèi)在活性被減弱；而提高cAMP濃度后，其與通道CNBD區(qū)結(jié)合發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)， COOH-末端連接區(qū)的抑制作用得到緩解，HCN通道被激活。cGMP與cCMP結(jié)合的親和力雖不及cAMP，但也可以使CNBD區(qū)發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)，從而促使HCN通道激活[5]。

2.1.2 離子 ①質(zhì)子：HCN通道激活與細(xì)胞內(nèi)、外的質(zhì)子也存在密切關(guān)系。HCN通道分子結(jié)構(gòu)的S4與S5連接區(qū)存在組氨酸殘基位點(diǎn)，該位點(diǎn)能感受細(xì)胞內(nèi)外pH值的變化[6]。②Cl-：HCN通道也受Cl-的調(diào)節(jié)，主要研究集中在心臟功能方面，具體機(jī)制目前尚不清楚。研究顯示，Cl-對(duì)HCN通道的調(diào)節(jié)與心率存在一定關(guān)系，可能與HCN通道對(duì)竇房結(jié)自律性的調(diào)節(jié)有關(guān)[7]。

2.1.3 磷脂酰肌醇絲氨酸(PIP2) 除cAMP外，PIP2也是HCN通道的變構(gòu)激活劑，能使HCN通道發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)而被激活。PIP2能作用于HCN通道的電壓感應(yīng)區(qū)域，其激活的曲線向去極化方向偏移約20 mV，使HCN通道電壓依賴性門控孔道在不依賴環(huán)磷酸腺苷的情況下處于穩(wěn)定化或活化狀態(tài)[8]。

2.2 HCN通道功能調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)

2.2.1 小分子蛋白 一些小分子蛋白也與HCN通道的調(diào)控密切相關(guān)，其能通過與HCN通道COOH-末端的相互作用來介導(dǎo)HCN通道開放，如肌動(dòng)結(jié)合蛋白APB-280(Filamin A)、腦特異性胞質(zhì)蛋白TRIP8b。Gravante等[9]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ilamin A能通過與CNBD區(qū)下游的含22個(gè)氨基的酸性區(qū)域結(jié)合來調(diào)控HCN1通道表達(dá)，表明Filamin A是HCN1通道的特異性調(diào)節(jié)因子。Piskorowski等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TRIP8b(1a-4)能使COOH-末端的CNBD區(qū)發(fā)生變構(gòu)效應(yīng)，從而促進(jìn)樹突表達(dá)HCN1，但TRIP8b(1a)卻可以下調(diào)HCN1通道表達(dá)，這種相反調(diào)節(jié)作用可能是為了防止HCN1通道的錯(cuò)誤表達(dá)。

2.2.2 蛋白激酶

2.2.2.1 酪氨酸激酶(SRC) SRC是HCN通道的重要調(diào)節(jié)因子。SRC激酶介導(dǎo)酪氨酸磷酸化，其在竇房結(jié)起搏細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及神經(jīng)元均有表達(dá)。研究表明，SRC能夠通過SH3結(jié)構(gòu)域來調(diào)控HCN通道開放[11]。在氙卵母細(xì)胞和天然組織中應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑染料木素可以降低HCN通道活化，降低Ih誘導(dǎo)的幅度[12]。

2.2.2.2 p38MAPK p38MAPK屬于分裂原激活的蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中一員，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的主要信號(hào)分子。研究發(fā)現(xiàn)，降低海馬神經(jīng)元CA1區(qū)p38MAPK活性會(huì)抑制樹突中的HCN通道開放，使Ih電流減少，從而導(dǎo)致癲癇發(fā)生，說明p38MAPK可能通過調(diào)控HCN通道而參與癲癇的發(fā)生[13]。

2.2.2.3 蛋白激酶C(PKC) PKC是神經(jīng)遞質(zhì)的重要下游靶標(biāo)，之前研究認(rèn)為其激活能抑制HCN通道[14,15]，但近期有研究證實(shí)PKC激活可雙向調(diào)控HCN通道[16]。該研究在海馬CA1錐體神經(jīng)元內(nèi)活化PKC后發(fā)現(xiàn)HCN1通道表達(dá)減少，Ih振幅被抑制，但HCN相關(guān)的絲氨酸磷酸化狀態(tài)反而增強(qiáng)，說明PKC激活對(duì)HCN通道的表達(dá)存在雙向調(diào)控作用。

2.3 HCN通道功能調(diào)節(jié)相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)

2.3.1 谷氨酸 谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，包含離子型谷氨酸受體和代謝性谷氨酸受體。Noam等[17]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸能夠激活離子型谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)受體，導(dǎo)致鈣離子超載、HCN1表達(dá)升高。Bender等[18]發(fā)現(xiàn)，谷氨酸能夠通過Ca2+/CaMKⅡ信號(hào)通路激活神經(jīng)元限制性沉默因子(NRSF)，從而抑制HCN1通道轉(zhuǎn)錄；另一方面，谷氨酸能與代謝型谷氨酸受體m1GluRs結(jié)合，通過激活下游PLC-PKC信號(hào)途徑來抑制HCN通道。

2.3.2 γ-氨基丁酸(GABA) GABA是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體分為GABAA、GABAB、GABAC三種亞型。Mcquail等[19]發(fā)現(xiàn)，GABA信號(hào)通路與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能降低密切相關(guān)。Luo等[20]研究證實(shí)，GABAB激動(dòng)劑巴氯芬能通過上調(diào)大鼠神經(jīng)元中HCN2通道表達(dá)來改善其學(xué)習(xí)記憶功能。

2.3.3 乙酰膽堿(Ach) Ach通過激活不同類型的mAchR來改變Ih的功能，其既能夠上調(diào)Ih也能下調(diào)Ih，但通常對(duì)Ih發(fā)揮抑制作用。Heys等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Ach能與mAchR受體結(jié)合并偶聯(lián)至G蛋白Gi，抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)活性，降低cAMP水平，從而導(dǎo)致Ih下調(diào)，使運(yùn)動(dòng)相關(guān)神經(jīng)元興奮性降低，限制了運(yùn)動(dòng)過程中某些神經(jīng)元的參與。

2.3.4 神經(jīng)肽類物質(zhì) HCN通道能通過多種神經(jīng)肽進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些神經(jīng)肽類物質(zhì)包括食欲素、阿片樣肽、神經(jīng)肽Y、血管活性腸肽(VIP)、神經(jīng)降壓素、血管緊張素Ⅱ和物質(zhì)P等，其能通過介導(dǎo)抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)而降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平或通過激活磷脂肌醇信號(hào)途徑(PLC-PKC)來降低Ih幅度，從而調(diào)節(jié)HCN通道[22]。

2.3.5 單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)和多巴胺等單胺能神經(jīng)遞質(zhì)能影響神經(jīng)元興奮性、突觸傳遞、整合和可塑性。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)，NE能通過抑制AC降低cAMP水平，從而抑制HCN通道活化。另有研究表明，可卡因能促進(jìn)中腦腹側(cè)蓋區(qū)(VTA)多巴胺的釋放，激活多巴胺受體后偶聯(lián)至G蛋白Gi，使cAMP水平下降，導(dǎo)致Ih電流振幅下調(diào)，從而增強(qiáng)可卡因的藥物成癮性[24]。

2.3.6 NO NO雖然是一種氣體，但也是神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸后或突觸前神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Wenker等[25]使用穿孔補(bǔ)丁記錄技術(shù)發(fā)現(xiàn)，NO能夠誘導(dǎo)HCN通道激活，使Ih幅度發(fā)生可逆性增加；該研究還發(fā)現(xiàn)NO對(duì)HCN通道的調(diào)節(jié)除了潛在的cGMP依賴效應(yīng)外，還可能存在硝基化的調(diào)節(jié)作用。

2.3.7 嘌呤類神經(jīng)遞質(zhì) ATP及其降解產(chǎn)物腺苷在一些突觸中屬于嘌呤能神經(jīng)遞質(zhì)，兩者能夠通過調(diào)節(jié)HCN通道的活性影響神經(jīng)元興奮性，共同參與廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)。Huang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，ATP可能通過G介導(dǎo)蛋白偶聯(lián)的二磷酸腺苷受體受體調(diào)節(jié)Ih幅度，從而影響中樞感覺神經(jīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，HCN通道參與并介導(dǎo)了多種重要的生理功能，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。該通道自發(fā)現(xiàn)以來的短短幾十年里，學(xué)者們便對(duì)其結(jié)構(gòu)、分布、亞型、表達(dá)及功能進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。近年來，隨著基因敲除和分子克隆技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)成功克隆出HCN的4種亞型，對(duì)HCN通道功能調(diào)節(jié)的細(xì)胞分子機(jī)制研究也更加深入，為進(jìn)一步研究相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

[1] Brennan GP, Baram TZ, Poolos NP. Hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated (HCN) channels in epilepsy[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2016, 6(3):22384.

[2] Lee CH, Mackinnon R. Structures of the human HCN1 hyperpolarization activated channel[J]. Cell, 2017,168(1-2):111-120.

[3] 王巍,馮加純.超極化激活的環(huán)核苷酸門控的陽離子通道與神經(jīng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2012,29(10):940-942.

[4] Chow SS, Van PF, Accili EA. Energetics of cyclic AMP binding to HCN channel C terminus reveal negative cooperativity[J]. J Biol Chem, 2011,287(1):600-606.

[5] Deberg HA, Brzovic PS, Flynn GE, et al. Structure and energetics of allosteric regulation of HCN2 Ion channels by cyclic nucleotides[J]. J Biol Chem, 2016,291(1):371-381.

[6] Carlson AE, Rosenbaum JC, Brelidze TI, et al. Flavonoid Regulation of HCN2 Channels[J]. J Biol Chem, 2013,288(46):33136-33145.

[7] Mistrík P, Pfeifer A, Biel M. The enhancement of HCN channel instantaneous currentfacilitated by slow deactivation is regulated by intracellular chloride concentration[J]. Pflügers Arch, 2006,452(6):718-727.

[8] Williams AD, Jung S, Poolos NP. Protein kinase C bidirectionally modulates Ih and hyperpolarization activated cyclic nucleotidegated (HCN) channel surface expression in hippocampal pyramidal neurons[J]. J Physiol, 2015,593(13):2779-2792.

[9] Gravante B, Barbuti A, Milanesi R, et al. Interaction of the pacemaker channel HCN1 with filamin A[J]. J Biol Chem, 2004,279(42):43847-43853.

[10] Piskorowski R, Santoro B, Siegelbaum SA. TRIP8b splice forms act in concert to regulate the localization and expression of HCN1 channels in CA1 pyramidal neurons[J]. Neuron, 2011,70(3):495-509.

[11] Wu JY， Cohen IS. Tyrosine kinase inhibition reduces i( f) in rabbit sinoatrial node myocytes[J] .Pflugers Arch, 1997,434(3):509-514．

[12] Yu HG, Lu Z, Pan Z, et al. Tyrosine kinase inhibition differentially regulates heterologously expressed HCN channels[J]. Pflugers Arch, 2004,447(4):392-400.

[13] Jung S, Bullis JB, Lau IH, et al. Downregulation of dendritic HCN channel gating in epilepsy is mediated by altered phosphorylation signaling.[J]. J Neurosci, 2010,30(19):6678-6688.

[14] Brager DH, Johnston D. Plasticity of intrinsic excitability during long-term depressi-on is mediated through mGluR-dependent changes in I(h) in hippocampal CA1 pyramidal neurons[J]. J Neurosci, 2007,27(51):13926-13937

[15] Li B, Chen F, Ye J, et al. The modulation of orexin A on HCN currents of pyrami-dal neurons in mouse prelimbic cortex[J]. Cerebral Cortex, 2010,20(7):1756-1767

[16] Flynn GE, Zagotta WN. Molecular Mechanism Underlying Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate-induced Inhibition of SpIH Channels[J]. J Biol Chem, 2011,286(17):15535-15542.

[17] Noam Y, Zha Q, Phan L, et al. Trafficking and surface expression of hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated channels in hippocampal neurons[J]. J Biol Chem, 2010,285(19):14724-14736.

[18] Bender RA, Kirschstein T, Kretz O, et al. Localization of HCN1 channels to presynaptic compartments: novel plasticity that may contribute to hippocampal maturation[J]. J Neurosci, 2007,27(17):4697-4706.

[19] Mcquail JA, Frazier CJ, Bizon JL. Molecular aspects of age-related cognitive decline: the role of GABA signaling[J]. Trends Mol Med, 2015,21(7):450-460.

[20] Luo P, Chen C, Lu Y, et al. Baclofen ameliorates spatial working memory impairments induced by chronic cerebral hypoperfusion via up-regulation of HCN2 expression in the PFC in rats[J]. Behav Brain Res, 2016,308:6-13.

[21] Heys JG, Giocomo LM, Hasselmo ME. Cholinergic modulation of the resonance properties of stellate cells in layer Ⅱ of medial entorhinal cortex[J]. J Neurophysiol, 2010,104(1):258-270.

[22] Zhang S, You Z, Wang S, et al. Neuropeptide S modulates the amygdaloidal HCN activities (Ih) in rats: implication in chronic pain[J]. Neuropharmacology, 2016,105:420-433.

[23] Wang M, Ramos BP, Paspalas CD, et al. Alpha2A-Adrenoceptors strengthen working memory networks by inhibiting cAMP-HCN channel signaling in prefrontal cortex[J]. Cell, 2007,129(2):397-410.

[24] Arencibia-Albite F, Vázquez R, Velásquez-Martinez MC, et al. Cocaine sensitization inhibits the hyperpolarization activated cation current Ih and reduces cell size in dopamine neurons of the ventral tegmental area[J]. J Neurophysiology, 2012,107(8):2271-2282.

[25] Wenker IC, Benoit JP, Chen X, et al. Nitric oxide activates hypoglossal motoneurons by cGMP-dependent inhibition of TASK channels and cGMP-independent activati-on of HCN channels[J]. J Neurophysiology, 2012,107(5):1489-1499.

[26] Huang W, Xiu Y, Yan JA, et al. Facilitation of Ih channels by P2Y1 receptors activation in Mesencephalic trigeminal neurons[J]. Neurosci Lett, 2010,482(2):156-159.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371318)；湖北省高等學(xué)校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃(T201403)。

何治(E-mail: hezhi2003@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.033

R696

A

1002-266X(2017)44-0101-03

2017-04-30)