左凱++薛棟++孔麗++夏修良

[摘要]目的 探討肝癌組織中富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）、Twist和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)及臨床意義。方法 收集濱州市人民醫(yī)院2006年2月～2012年2月手術(shù)切除的80例肝癌組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，其中配對(duì)癌旁組織（距離癌組織邊緣<3 cm）50例。采用免疫組化EnVision法檢測(cè)Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果 Pyk2在肝癌組織及癌旁肝組織中的陽性表達(dá)率分別為71.3%、12.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Twist在肝癌組織及癌旁肝組織中的陽性表達(dá)率分別為66.3%、6.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；E-cadherin在肝癌組織及癌旁肝組織中的陽性表達(dá)率分別為27.5%、90.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白陽性表達(dá)與肝癌病理分級(jí)、分化程度、血管侵犯及TNM分期均明顯相關(guān)（P<0.05），肝癌組織中，Pyk2與Twist表達(dá)成正相關(guān)（P<0.05），Pyk2和E-cadherin表達(dá)成負(fù)相關(guān)（P<0.05），Twist和E-cadherin表達(dá)也成負(fù)相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論 Pyk2、Twist及E-cadherin共同參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展，Pyk2可能通過上調(diào)Twist的表達(dá)促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移。

[關(guān)鍵詞]肝細(xì)胞癌；富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2；Twist；E-鈣黏蛋白；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）02（a）-0004-04

[Abstract]Objective To explore the expressions of Pyk2，Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinoma and their clinical significance.Methods 80 hepatocellular carcinoma tissues in our hospital from February 2006 to February 2012 were selected as the research objects，and 50 cases of adjacent paracancerous tissues were matched （from the edge of cancer tissue to less than 3 cm）.Immunohistochemistry of EnVision was used to detect the expression of Pyk2，Twist and E-cadherin in hepatocellular carcinomas and adjacent paracancerous tissues.The correlation between their expression and pathologic parameters were analyzed by statistics.Results The positive rate of Pyk2 in hepatocellular carcinomas was significantly higher than that in adjacent paracancerous tissues，with significant difference （71.3% vs. 12.0%，P<0.05）.Significant differences were also observed in the positive expression rate of Twist between the patients with hepatocellular carcinomas and paracancerous tissues （66.3% vs. 6.0%，P<0.01）.The positive rate of E-cadherin in hepatocellular carcinomas was significantly lower than that in adjacent paracancerous tissues （27.5% vs. 90.0%，P<0.01）.The positive expression of Pyk2，Twist，E-cadherin was significantly correlated with pathological grade，degree of differentiation，vascular invasion and clinical TNM stage （P<0.05）.The expression of Pyk2 was positively correlated with the expression of Twist in hepatocellular carcinoma （P<0.05），the expression of Pyk2 was negatively correlated with the expression of E-cadherin （P<0.05），and the expression of Twist was negatively correlated with the expression of E-cadherin （P<0.05）.Conclusion Pyk2，Twist and E-cadherin protein expression might be associated with the development，invasion，and metastasis of hepatocellular carcinoma.Pyk2 may play a role during invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by up-regulating the expression of Twist.

[Key words]Hepatocellular carcinoma；Proline-rich tyrosine kinase-2；Twist；E-cadherin；Immunohischemistry

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。肝癌惡性程度高，早期缺乏特異性癥狀，5年生存率較低[1]。部分肝癌患者確診時(shí)就出現(xiàn)了肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門靜脈癌栓甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)切除機(jī)會(huì)，因此，尋找肝癌早期診斷和臨床治療的分子標(biāo)志物已成為一個(gè)亟待解決的問題。富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2（proline-rich tyrosine kinase-2，Pyk2）是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，是黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）家族的一個(gè)新成員，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[2]。國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)，Pyk2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、膀胱癌[5]等腫瘤組織中高表達(dá)，并且與腫瘤分期及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Twist基因是堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)重要成員，Twist與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志分子[7]。本研究采用免疫組織化學(xué)EnVision方法探討Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌中的表達(dá)及臨床腫瘤學(xué)意義，旨在為臨床靶向治療肝癌提供一定的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2006年2月～2012年2月濱州市人民醫(yī)院肝細(xì)胞癌手術(shù)切除的80例臨床標(biāo)本，其中配對(duì)癌旁組織（距離癌組織邊緣<3 cm）50例；男性56例，女性24例；年齡33～79歲；53例腫瘤直徑<5 cm，27例腫瘤直徑≥5 cm。所有標(biāo)本病理診斷均為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，術(shù)前未接受過放、化療等抗腫瘤治療。臨床分期（2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)）：Ⅰ、Ⅱ期共51例，Ⅲ、Ⅳ期共29例。

1.2試劑和方法

選取病理科存檔的腫瘤組織蠟塊，病理科醫(yī)師重新切片診斷，進(jìn)一步行病理學(xué)分級(jí)，分別實(shí)施Pyk2、Twist和E-cadherin免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用免疫組化EnVision法檢測(cè)Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白的表達(dá)。兔抗人Pyk2單克隆抗體、兔抗人Twist多克隆抗體及兔抗人E-cadherin多克隆抗體均購自美國(guó)Santa Cruz公司，工作濃度均為1∶200。EnVision試劑盒購自丹麥Dako公司，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照，陽性對(duì)照為試劑公司提供的強(qiáng)陽性標(biāo)本切片，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗。

1.3 結(jié)果判定

Pyk2蛋白陽性：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒；Twist蛋白陽性：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒；E-cadherin蛋白陽性：細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在不知任何背景資料的情形下，由兩位病理專家采用雙盲法進(jìn)行閱片。首先依據(jù)染色強(qiáng)度打分，無染色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分，染色需與背景著色相比較。再將陽性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行打分，無陽性細(xì)胞記為0分，陽性細(xì)胞所占百分比為1%～25%記為1分，陽性細(xì)胞所占百分比為>25%～50%記為2分，陽性細(xì)胞所占百分比為>50%～75%記為3分，陽性細(xì)胞所占百分比為 >75%～100%記為4分。最后根據(jù)染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比乘積進(jìn)行評(píng)分，≥4分記為陽性表達(dá)，<4分記為陰性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肝癌組織及癌旁組織中Pyk2蛋白的表達(dá)

Pyk2陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核未見明顯染色，染色為棕黃色或棕褐色，呈小片狀或彌漫性分布（圖1）。Pyk2在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為71.3%，在癌旁肝組織中的陽性表達(dá)率為12.0%，兩種肝組織中的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2肝癌組織及癌旁組織中Twist蛋白的表達(dá)

Twist蛋白的陽性著色位于細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色顆粒（圖2）。Twist在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為66.3%，而在癌旁肝組織的陽性表達(dá)率為6.0%，兩種肝組織中的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.3肝癌組織及癌旁組織中E-cadherin蛋白的表達(dá)

E-cadherin蛋白的陽性著色主要位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒（圖3）。E-cadherin在肝癌組織中的陽性表達(dá)率為27.5%，而在癌旁肝組織的陽性表達(dá)率為90.0%，兩種肝組織中的陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1）。

2.4 Pyk2、Twist和E-cadherin蛋白表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系

肝癌中Pyk2陽性表達(dá)與患者年齡、性別、AFP、腫瘤大小及包膜完整性無關(guān)（均P>0.05），與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵犯及臨床TNM分期有關(guān)（均P<0.05）。肝癌組織中Twist陽性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、AFP及包膜完整性無關(guān)（均P>0.05），與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵犯及TNM分期有關(guān)（均P<0.05）。肝癌組織中E-cadherin陽性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、AFP及包膜完整性無關(guān)（均P>0.05），與病理分級(jí)、腫瘤分化程度、血管侵犯及TNM分期有關(guān)（均P<0.05）。Pyk2、Twist共同高表達(dá)于分化程度低、血管侵犯、病理分級(jí)較差及分期較晚的肝癌組織中（表2）。

2.4 Pyk2、Twist和E-cadherin在肝癌組織中表達(dá)的關(guān)系

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，肝癌組織中Pyk2與Twist蛋白表達(dá)成正相關(guān)（r=0.425，P=0.032），Pyk2與E-cadherin的表達(dá)成負(fù)相關(guān)（r=-0.472，P=0.026）；Twist與E-cadherin的表達(dá)也成負(fù)相關(guān)（r=-0.308，P=0.037）。

3討論

Pyk2是一種富含脯氨酸的非受體酪氨酸蛋白激酶，定位于人第8號(hào)染色體（8 p21.1），基因全長(zhǎng)4.048 kbp。Pyk2依賴于鈣離子濃度的變化而被激活，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及侵襲[8-10]。Pyk2能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移[11]。本研究結(jié)果顯示，Pyk2在肝癌組織中高表達(dá)，在肝癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁肝組織（P<0.05），提示Pyk2基因與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步的研究還顯示，Pyk2陽性表達(dá)還與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵襲及TNM分期密切相關(guān)，提示Pyk2能在肝癌細(xì)胞分化、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

Twist不僅在胚胎形態(tài)發(fā)生中起關(guān)鍵調(diào)控作用，還參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移等過程[12]。胰腺癌中Twist高表達(dá)，并且與腫瘤分期、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。結(jié)直腸癌中也存在Twist高表達(dá)，并且沉默Twist基因后結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及遷移力顯著下降[14]。本研究結(jié)果顯示，Twist在肝癌組織中的表達(dá)率明顯高于癌旁肝組織（P<0.05），并且Twist陽性表達(dá)還與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵襲及臨床TNM分期有關(guān)（P<0.05），提示Twist在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。Twist在低分化、中晚期的肝癌中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步支持了Twist參與肝癌惡性進(jìn)展，這與車娜等[15]的研究報(bào)道一致。相關(guān)性分析顯示，Pyk2與Twist在肝癌中的表達(dá)成正相關(guān)（P<0.05），提示Pyk2與Twist共同參與了肝癌惡性侵襲，推測(cè)Pyk2可能通過上調(diào)Twist促進(jìn)了肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要機(jī)制，當(dāng)E-cadherin表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞間的黏附力下降，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。E-cadherin在甲狀腺乳頭狀癌組織中低表達(dá)，其表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin在肝癌組織中的陽性表達(dá)率顯著低于癌旁肝組織，E-cadherin陽性表達(dá)與病理分級(jí)、腫瘤分化、血管侵襲及TNM分期有關(guān)（P<0.05），提示E-cadherin與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌組織中異常表達(dá)，并且三者密切相關(guān)，提示Pyk2、Twist及E-cadherin在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了協(xié)同作用。

綜上所述，肝癌組織中存在Pyk2、Twist及E-cadherin異常表達(dá)，其共同參與了肝細(xì)胞的癌變及惡性侵襲轉(zhuǎn)移過程。Pyk2可能為肝癌的診斷和治療提供一個(gè)新的分子靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2016-12-26 本文編輯：祁海文）