王曉蔚++康凱夫++羅小麗

[摘要]目的 分析Smad7與NF-κBp65在原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（HCC）中的表達(dá)、臨床意義及兩者之間的關(guān)系。方法 選擇2005年12月～2010年12月順德第一人民醫(yī)院外科手術(shù)切除送檢至病理科的臘塊標(biāo)本120例為研究對象，其中正常肝組織10例、肝炎組織30例、肝硬化組織30例、HCC組織50例。采用免疫組化S-P法和石蠟切片原位雜交法檢測各肝組織中Smad7 mRNA、NF-κBp65 mRNA及其蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 Smad7蛋白、NF-κBp65蛋白、Smad7 mRNA、NF-κBp65 mRNA在HCC組織中的陽性表達(dá)率均明顯高于肝硬化、肝炎和正常肝組織（P<0.01）。肝硬化組織中Smad7 mRNA、Smad7蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于正常肝組織（χ2=4.043、4.848，均P<0.05）。HCC中NF-κBp65蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑及Smad7蛋白的表達(dá)有關(guān)（χ2=5.592、4.578，均P<0.05）。結(jié)論 Smad7和NF-κBp65異常表達(dá)可能共同參與了HCC的演進(jìn)。

[關(guān)鍵詞]Smad7；核因子NF-κB；免疫組化；原位雜交

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（a）-0008-04

[Abstract]Objective To study the expression of Smad7 and NF-κBp65 in HCC and their relationship.Methods 120 cases of specimen from patients carried surgical resection in the First People′s Hospital of Shunde of Southern Medical University from December 2005 to December 2010 were selected as the research object，including 10 cases of normal hepatic tissues，30 case of cirrhosis，30 cases of hepatitis and 50 cases of HCC.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detect the changes of Smad7 mRNA and NF-κBp65 mRNA and their proteins expressions in each kinds of hepatic tissues.Results The positive expressions rate of Smad7 mRNA and NF-κBp65 mRNA and their protein in HCC tissues were significantly higher than those in the cirrhosis tissues，hepatitis tissues and normal hepatic tissues，the differences were statistically significant （P<0.01）.The expression of Smad7 mRNA and proteins in cirrhosis tissues were higher than those in normal tissues （χ2=4.043，4.848，all P<0.05）.The expression of NF-κBp65 protein in hepatocellular carcinoma was related to tumor size and the expression of Smad7 protein （χ2=5.592，4.578，all P<0.05）.Conclusion The abnormal expression of Smad7 and NF-κBp65 may be related to the evolution of HCC.

[Key words]Smad7；Nuclear factor-kappa B；Immunohistochemistry；In situ hybridization

肝細(xì)胞癌的死亡率在惡性腫瘤中位居第三，約占成年人原發(fā)性肝臟腫瘤80%，其發(fā)病率也居高不下[1-2]，且肝細(xì)胞癌患者早期癥狀不明顯，經(jīng)常延誤診斷，從而使其治療方法非常有限[3]，主要是手術(shù)切除及肝移植。雖然原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生和發(fā)展被認(rèn)為與肝炎、肝硬化有關(guān)，但還不清楚其中的分子機(jī)制。目前認(rèn)為，HCC的發(fā)生演變可能是一個多基因、多步驟的過程，Smad7是TGF-β下游非常重要的信號蛋白，被認(rèn)為與器官硬化和腫瘤發(fā)生有關(guān)。核因子-κBp65（nuclear factor-kappa Bp65，NF-κBp65）的活化已被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中存在。本研究通過檢測HCC組織中Smad7和NF-κBp65的表達(dá)，探討其輔助臨床診斷及治療的價(jià)值。

1對象與方法

1.1對象

選擇2005年12月～2010年12月順德第一人民醫(yī)院外科手術(shù)切除送檢至病理科的臘塊標(biāo)本120例為研究對象，其中正常肝組織10例、肝炎組織30例、肝硬化組織30例、HCC組織50例。HCC患者按照Edmondson標(biāo)準(zhǔn)分級，Ⅰ～Ⅱ級24例，Ⅲ～Ⅳ級26例；年齡28～71歲，平均56.5歲；男47例，女3例。肝硬化患者年齡25～69歲，平均50.6歲；男22例，女8例。慢性肝炎患者中，輕、中、重度慢性肝炎各10例；年齡6～51歲，平均34.8歲；男28例，女2例。切片厚度均為4 μm。正常對照肝組織采用經(jīng)病理科HE染色，切片被診斷并證實(shí)為未發(fā)生病變的成人肝臟臘塊標(biāo)本再重新切片獲得。

1.2方法

鼠單抗NF-κBp65購自美國Santa Crus公司，鼠單抗Smad7、Smad7 mRNA和NF-κBp65 mRNA原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。應(yīng)用免疫組化S-P法，實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行，DAB顯色5 min。陽性對照由試劑公司提供，陰性對照由PBS緩沖液代替一抗作參照。原位雜交方法：石蠟切片常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。氨丙基三乙氧基硅烷處理玻片，脫蠟至水，暴露核酸片段，后固定，預(yù)雜交，雜交（過夜），洗滌，封閉，滴加生物素化鼠抗地高辛等，EAC顯色后依次進(jìn)行常規(guī)步驟，最后封片[4]。

1.3結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

采用雙盲法對兩種染色結(jié)果進(jìn)行觀察[5]，每張切片隨機(jī)選擇5個高倍視野（×400），隨機(jī)選取200個實(shí)質(zhì)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞占比，最后計(jì)分：≤25%記1分，>25%～75%記2分，>75%記3分。將染色強(qiáng)度分為3級：陰性著色1分，弱著色2分，棕黃色3分；采用半定量積分法，根據(jù)兩者的乘積判斷結(jié)果，≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或四格表概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各肝組織中Smad7蛋白與NF-κBp65蛋白的表達(dá)情況

Smad7蛋白在HCC中的陽性表達(dá)率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.036、19.217、17.286，均P<0.01）；NF-κBp65蛋白在HCC中的陽性表達(dá)率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.889、14.854、8.440，均P<0.01）。Smad7蛋白在肝硬化組織中的陽性表達(dá)率明顯高于在正常肝組織（χ2=4.848，P<0.05）（表1）。

2.2 Smad7 mRNA和NF-κBp65 mRNA在各肝組織中的表達(dá)情況

Smad7蛋白在HCC中的陽性表達(dá)率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.524、16.254、16.000，均P<0.01）；NF-κBp65蛋白在HCC中的陽性表達(dá)率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.233、15.761、10.413，均P<0.01）。Smad7 mRNA在肝硬化中的表達(dá)明顯高于在正常肝組織中的表達(dá)（χ2=4.043，P<0.05）（表2、圖1）。

A.Smad7蛋白在HCC組織中的表達(dá)（SP，×400）；B.Smad7 mRNA在HCC組織中的表達(dá)（SP，×400）；C.NF-κBp65 蛋白在HCC組織中的表達(dá)（SP，×200）；D.NF-κBp65 mRNA在HCC組織中的表達(dá)（SP，×200）；箭頭所示為陽性表達(dá)細(xì)胞

2.3 Smad7和NF-κBp65在HCC組織的表達(dá)與相關(guān)臨床病理因素的關(guān)系

Smad7蛋白在HCC中的陽性表達(dá)與各因素均無關(guān)（P>0.05）；NF-κBp65蛋白在HCC中的陽性表達(dá)與腫瘤直徑有關(guān)（P<0.05），而與年齡、Edmondson分級、HBsAg、轉(zhuǎn)移情況無關(guān)（P>0.05）（表3）。

2.4 HCC中Smad7蛋白和NF-κBp65蛋白表達(dá)的關(guān)系

HCC組織中Smad7蛋白與NF-κBp65蛋白的表達(dá)密切相關(guān)（χ2=4.578，P=0.02）（表4）。

3討論

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族是一種具有重要生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，有三種亞型（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3），在細(xì)胞的生長、分化、遷移、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。其中含量最高的是TGF-β1，它可以活化和促進(jìn)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤中血管系統(tǒng)形成，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[6]。有研究報(bào)道在多種惡性腫瘤中TGF-β1高表達(dá)[7-8]。Smads蛋白家按功能分為3類：受體活化型Smad（R-Smads）、共同通路型Smad（Co-Smad）和抑制性Smad（I-Smads）。Smad 7屬于抑制型I-Smads，抑制TGF-β家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，在4種肝組織中，Smad7蛋白及其mRNA的表達(dá)率有明顯差異性，在HCC中的表達(dá)明顯高于其他3種組織。主要是由于Smad7作為TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制元件，通過干擾Smad2、Smad3的磷酸化和Smad-2，3，4異源復(fù)合物的形成而發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)胞的無限制生長[9]。即Smad7的高表達(dá)通過反饋調(diào)控使TGF-β1對細(xì)胞生長、增殖的抑制能力降低，加速細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[10]。有研究顯示Smad7基因與結(jié)腸癌患預(yù)后有著密切的關(guān)系，Smad7高表達(dá)被認(rèn)為是惡性細(xì)胞抑制TGF-β的生長作用的機(jī)制之一[11-12]。有研究還提示，不依賴TGF-β，Smad7可發(fā)揮獨(dú)立分子生物學(xué)作用，并在腫瘤細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用[13-15]。由于在肝硬化中的表達(dá)明顯高于正常肝組織中，研究表明TGF-β1還可使細(xì)胞外基質(zhì)膠原含量增加，促使膠原纖維和纖維蛋白的形成[16-17]，而抑制因子Smad7主要通過阻斷TGF-β的激活及其信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮反饋調(diào)節(jié)功能，抑制器官纖維化與硬化。

核因子NF-κB 是炎癥與癌的重要中介分子，許多細(xì)胞、病毒的基因組中存在κB位點(diǎn)，因而眾多基因轉(zhuǎn)錄可以被NF-κB 調(diào)控[18-20]，如肝臟炎性反應(yīng)相關(guān)基因、肝炎病毒相關(guān)基因、原癌基因、抑癌基因等多種基因都可以被其通過多種方式參與表達(dá)[21]。而NF-κBp65是哺乳動物細(xì)胞5種NF-κB（p65、RelB、C-Rel、p50和p52）中含量最豐富的一種，本研究結(jié)果顯示NF-κBp65在HCC組織中的表達(dá)明顯高于在其他幾種肝組織中，并與腫瘤直徑有關(guān)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

分析Smad7和NF-κBp65的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)兩者具有一定的相關(guān)性（χ2=4.578，P<0.05），在Smad7蛋白高表達(dá)的組織NF-κBp65蛋白也高表達(dá)。提示Smad7、NF-κBp65可能共同促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，推測其機(jī)制可能是由于能結(jié)合NF-κB的位點(diǎn)位于多種基因中，包括促使TGF-β1活化的啟動子基因，當(dāng)TGF-β1表達(dá)時(shí)，Smad7也上調(diào)，而且Smad7可能通過阻礙NF-κB的表達(dá)誘發(fā)凋亡，或者通過其他通路在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮功能。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討原發(fā)性肝細(xì)胞性HCC的制病機(jī)制及防治提供了相關(guān)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并為其診斷和治療提供分子生物學(xué)水平的參考。

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（收稿日期：2016-11-23 本文編輯：任 念）