謝越　周成　涂從　張祖亮　汪建飛

摘要應(yīng)用近紅外光譜（NIRS）技術(shù)定量分析連作滁菊土壤樣品中阿魏酸的含量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)杠桿值、學(xué)生殘差和馬氏距離判斷異常光譜， 經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)和Norris平滑濾噪預(yù)處理后， 在6000～4000 cm

Symbolm@@ 1范圍， 最佳因子數(shù)為7， 采用偏最小二乘法（PLS）構(gòu)建數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明， 模型校正集和驗(yàn)證集與高效液相色譜儀（HPLC）測(cè)定的參考值之間均呈現(xiàn)良好相關(guān)關(guān)系， 校正相關(guān)系數(shù)Rc為0.9914， 交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Rcv為0.9935， 校正集誤差均方根（RMSEC）為0.484， 預(yù)測(cè)誤差均方根（RMSEP）為0.539， 交叉驗(yàn)證誤差均方根（RMSECV）為0.615。研究結(jié)果表明， NIRS分析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)連作土壤中阿魏酸的快速檢測(cè)， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞近紅外光譜； 連作土壤； 滁菊； 酚酸； 阿魏酸

1引 言

滁菊（Chrysanthemum morifolium cv. ‘Chuju）是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品，也是安徽省的特色植物資源。因其含有黃酮類(lèi)、多糖、多酚類(lèi)等物質(zhì)，具有良好的藥物和食補(bǔ)功能，被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為藥食兩用食物[1]。滁菊的種植已有兩千多年的栽培歷史，但是近年來(lái)滁菊種植出現(xiàn)了連作障礙現(xiàn)象，已經(jīng)成為滁菊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約瓶頸[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，由滁菊根系分泌和殘?bào)w腐解產(chǎn)生的酚酸類(lèi)物質(zhì)大量分布在連作土壤中，其產(chǎn)生的自毒作用是滁菊連作障礙問(wèn)題的重要原因之一[3]。產(chǎn)生自毒作用的酚酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)很多，其中阿魏酸是一種廣泛分布的酚酸，同樣也常見(jiàn)于其它中草藥連作種植土壤中[4～6]。阿魏酸在連作滁菊土壤中的含量相對(duì)較高，達(dá)到18.24 μg/g[3]，是所有檢測(cè)到的酚酸物質(zhì)中含量較高的一類(lèi)，這使得阿魏酸成為滁菊酚酸類(lèi)自毒物質(zhì)的標(biāo)志性物質(zhì)。因此，對(duì)于阿魏酸的快速檢測(cè)，成為以滁菊為代表的中草藥種植過(guò)程中提前預(yù)防連作障礙問(wèn)題發(fā)生的關(guān)鍵技術(shù)。

目前，阿魏酸的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[3]、反相高效液相色譜法[7]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法[8]等。這些方法通常存在前處理復(fù)雜、分析時(shí)間較長(zhǎng)、樣品容易污染等缺點(diǎn)。阿魏酸穩(wěn)定性差， 容易分解， 使得上述檢測(cè)手段無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程的定量分析要求。

近紅外光譜（NIRS）技術(shù)是近年來(lái)快速發(fā)展的綠色、無(wú)損分析技術(shù)，具有無(wú)需樣品預(yù)處理、無(wú)二次化學(xué)污染、操作簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)[4，9]，已廣泛用于農(nóng)業(yè)[10～12]、煙草[13]、食品[1]、藥物[5]等行業(yè)的成分定量測(cè)定。目前，采用NIRS定量分析中草藥土壤中阿魏酸的文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用近紅外光譜分析技術(shù)，應(yīng)用偏最小二乘法構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)連作滁菊土壤樣品中阿魏酸的含量， 為以滁菊為代表的中草藥連作障礙問(wèn)題的早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)防提供新技術(shù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（美國(guó)Thermo公司），配液體透射檢測(cè)器，采樣系統(tǒng)以及TQ Analyst處理軟件； Waters 6002487高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）； MS204電子天平、FE30 pH計(jì)（梅特勒托利公司）； AB5150B超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）； D101大孔樹(shù)脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 阿魏酸（分析純，Sigma公司）； 乙腈（色譜純，德國(guó)Fisher公司）； 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ cm2）。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品的制備取連作5年滁菊土壤樣品，加入20倍量95%乙醇，加熱回流提取2 h，提取3次，冷卻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾3次， 合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇味，收集濃縮液，再加入3倍量45℃溫水，室溫靜置24 h，以4500 r/min離心20 min，上清液儲(chǔ)存于棕色瓶中，4℃冷藏備用。D101大孔樹(shù)脂先用95%乙醇浸泡過(guò)夜，用超純水反復(fù)沖洗直至無(wú)乙醇味； 再用4% NaOH浸泡6 h，用超純水沖洗至中性； 然后用4% HCl溶液浸泡過(guò)夜，用超純水沖洗至中性，裝柱（200 mm×50 mm）備用。 提取液用50%乙醇以20 mL/h的速度洗脫，洗脫過(guò)程中每隔一段時(shí)間收集大孔樹(shù)脂富集純化后的樣品，5根樹(shù)脂柱子平行操作，每根收集30個(gè)樣品， 共得到150個(gè)樣品。

2.2.2阿魏酸的測(cè)定阿魏酸的測(cè)定方法參考本課題組關(guān)于酚酸的分析方法[3]，略做調(diào)整。具體HPLC測(cè)定條件如下： Symmetry C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm； 流動(dòng)相為0.01% H3PO4溶液（A）和乙腈（B），以冰醋酸調(diào)節(jié)至pH 2.8，梯度洗脫： 0～10 min，95% A； 10～25 min， 85% A； 25～35 min，60% A； 35～40 min，65% A； 40～45 min，95% A。流速1.0 mL/min； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2.4光譜數(shù)據(jù)處理與數(shù)學(xué)模型的建立和驗(yàn)證在剔除奇異樣本后，隨機(jī)取100份樣品組成校正集，剩余樣品作為驗(yàn)證集，驗(yàn)證集不參與模型構(gòu)建。在光譜預(yù)處理基礎(chǔ)上，運(yùn)用偏最小二乘法，利用TQ Analyst （Thermo Nicolet Com， USA）軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析，建立近紅外光譜多元校正模型。通過(guò)TQ Analyst軟件的分析功能剔除異常光譜，由預(yù)測(cè)殘差平方和（Predicted residual error sum of squares， PRESS）結(jié)果確定所需因子數(shù)。表征近紅外光譜定量模型建模效果的指標(biāo)，主要有校正相關(guān)系數(shù)Rc、交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Rcv， 交叉驗(yàn)證誤差均方根（Root mean square error of crossvalidation， RMSECV）、校正集誤差均方根（Root mean square error of calibration， RMSEC）和預(yù)測(cè)誤差均方根（Root mean square error of validation， RMSEP），各參數(shù)計(jì)算公式如下：

3.2異常光譜的診斷

樣品譜圖采集過(guò)程中，由于設(shè)備本身的誤差、操作的失誤、波長(zhǎng)的漂移及環(huán)境因素的變化，近紅外光譜譜圖可能出現(xiàn)異常，從而引起模型精度的降低[14]。對(duì)于異常樣品的診斷，一般采用馬氏距離、標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差判斷。圖2為150個(gè)樣品的馬氏距離分布圖。

從圖2可見(jiàn)，樣品馬氏距離平均值為1.18，閾值為1.31，有3個(gè)樣品超過(guò)閾值，其標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差均較高，視為異常樣品。

圖3為樣品標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差關(guān)系圖，除了超過(guò)馬氏距離閾值的3個(gè)樣品外，還有2個(gè)樣品點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差較為離群，這5個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)杠桿值和學(xué)生殘差都較高，所以建模前將這5個(gè)奇異樣品剔除。

3.3建模光譜波段的選擇

PLS法雖然可以全波段建立數(shù)學(xué)模型，但是如果建模波段選擇過(guò)寬，必然包含有過(guò)多冗余信息，不利于模型預(yù)測(cè)的精確度[17]。依據(jù)TQ Analyst軟件推薦的模型構(gòu)建波段范圍，以及樣品阿魏酸特征波段的相關(guān)關(guān)系，建立了不同波段范圍內(nèi)阿魏酸的PLS定量數(shù)學(xué)模型，結(jié)果見(jiàn)表1。

Rc值越接近1，模型越精確。RMSEC和RMSECV值越小，越可有效消除測(cè)試樣品之間差別造成的光譜基線漂移和偏移。 RMSEC和RMSEP值越小，且兩者數(shù)值接近，意味著模型更穩(wěn)定，預(yù)測(cè)性能更好[18]。從表1可知，在不同近紅外波段范圍內(nèi)，對(duì)模型參數(shù)的影響程度不同。通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)在6000～4000 cm范圍，主因子數(shù)為7，采用PLS法構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，校正集和HPLC測(cè)定的參考值之間的相關(guān)關(guān)系見(jiàn)圖 5，驗(yàn)證集與參考值之間的相關(guān)關(guān)系見(jiàn)圖6。校正集和驗(yàn)證集與HPLC的參考值之間均呈現(xiàn)良好相關(guān)關(guān)系，校正相關(guān)系數(shù)Rc為0.9914，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)Rcv為0.9935，校正集誤差均方根RMSEC為0.484，預(yù)測(cè)誤差均方根RMSEP為0.539，交叉驗(yàn)證誤差均方根RMSECV為0.615。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以PLS法建立的近紅外數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)連作滁菊土壤中的阿魏酸含量，所得結(jié)果與HPLC的測(cè)定結(jié)果吻合程度好，準(zhǔn)確可靠。因此，NIRS分析技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)連作土壤中阿魏酸的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。

References

1SHU JunSheng， HUANG GuiDong， MAO Jian. Chinese J. Inst. Food Sci. Tech.， 2013， 13（4）： 207-213

舒俊生， 黃桂東， 毛 健. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2013， 13（4）： 207-213

2XIE Yue， XIAO Xin， ZHOU Yi， CHEN ShiYong， LI XiaoLiang， XING SuZhi， WANG JianFei. J. Nanjing Agri. Univ.， 2012， 06： 19-24

謝 越， 肖 新， 周 毅， 陳世勇， 李孝良， 邢素芝， 汪建飛. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 06： 19-24

3XIE Yue， YU Hao， WANG JianFei， ZHANG ZuLiang， CHEN SiYong， XIAO Xin， LI XiaoLiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（3） ： 383-388

謝 越， 俞 浩， 汪建飛， 張祖亮， 陳世勇， 肖 新， 李孝良. 分析化學(xué)， 2013， 41（3）： 383-388

4WANG Xiaomei， JIAO Long， LIU Xiaoli， LI Hua. Chin. J. Pharm. Anal.， 2011， 31（6）： 1016-1019

王小梅， 焦 龍， 劉小麗， 李 華. 藥物分析雜志， 2011， 31（6）： 1016-1019

5GU ZhiRong， ZHANG YaYa， DING JunXia， SUN YuJing. Nat. Prod. Res. Dev.， 2015， 27： 849-853， 889

顧志榮， 張亞亞， 丁軍霞， 王亞麗， 孫宇靖. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2015， 27： 849-853， 889

6CHEN JiaLe， JIN Ye， CHEN HongYing， LIU XueSong， LIU ZhiGang， LI YaQiong， LUAN LianJun. Chinese Herbal Med.， 2016， 47（6）： 1004-1009

陳佳樂(lè)， 金 葉， 陳紅英， 劉雪松， 劉志剛， 李瓊婭， 欒連軍. 中草藥， 2016， 47（6）： 1004-1009

7Xie Y F， Bi W W， Wang X J， Zhang X L， Zhang X N， Zhao G X， Liu Q Q. J. Food Process. Preserva.， 2016， DOI： 10.1111/jfpp.13119

8Wang J P， Li N B， Luo H Q. Spectrochim. Acta A， 2008， 71（1）： 204

9CHU Xiao-Li， LU Wan-Zhen. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 346（10）： 2595-2605

褚小立， 陸婉珍. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（10）： 2595-2605

10LUAN LianJun， CHEN Na， LIU XueSong， WU YongJiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（4）： 626-629

欒連軍， 陳 娜， 劉雪松， 吳永江. 分析化學(xué)， 2012， 40（4）： 626-629

11FANG Xiao-Rong， ZHANG Hai-Liang， HUANG Ling-Xia， HE Yong. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 35（5）： 1248-1252

方孝榮， 章海亮， 黃凌霞， 何 勇. 光譜學(xué)與光譜分析， 2015， 35（5）： 1248-1252

12ZHU Xiang-Rong， LI Gao-Yang， HUANG Lv-Hong， SU Dong-Lin， LIU Wei， SHAN Yang. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（4）： 599-603

朱向榮， 李高陽(yáng)， 黃綠紅， 蘇東林， 劉 偉， 單 楊. 分析化學(xué)， 2015， 43（4）： 599-603

13Bin J， Ai F F， Fan W， Zhou J H， Yun Y H， Liang Y Z. RSC Adv.， 2016， 6， 30353-30361

14LU YongJun， CHEN HuaCai， LV Jin， CHEN XingDan. Chinese J. Anal. Chem.， 2005， 33（6）： 835-837

蘆永軍， 陳華才， 呂 進(jìn)， 陳星旦. 分析化學(xué)， 2005， 33（6）： 835-837

15ZHU XiangRong， LI GaoYang， HUANG LYUHong， SU DongLin， LIU Wei， SHAN Yang. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（4）： 599-603

朱向榮， 李高陽(yáng)， 黃綠紅， 蘇東林， 劉 偉， 單 楊. 分析化學(xué)， 2015， 43（4）： 599-603

16LU YongHun， QU YanLing， ZHANG Jun， PIAO RenGuan. Spectrosc. Spect. Anal.， 2004， 24（6）： 744-747

蘆永軍， 曲艷玲， 張 軍， 樸仁官. 光譜學(xué)與光譜分析， 2004， 24（6）： 744-747

17Pande R， Mishra H N. Food Chem.， 2015， 172： 880-884

18GENG Shu， CHEN Yong， JIN Ye， LUAN LianJun， LIU XueSong， WU YongJiang. Chin. J. Mod. Appl. Pharm.， 2016， 33（2）： 144-150

耿 姝， 陳 勇， 金 葉， 欒連軍， 劉雪松， 吳永江. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2016， 33（2）： 144-150

19Raquel C M， Maria P C， Yash D， Denisio T， Laura A J， Patrick C， Carl S. J. Near Infrared Spec.， 2015， 23（4）： 245-253

AbstractA near infrared spectroscopy （NIRS） method was used for rapid quality evaluation of ferulic acid content in chrysanthemum morifolium cv. （Chuju） continuous cropping soil. Standard leverage， studentized residual and Mahalanobis distance were calculated to eliminate abnormal samples. After the initial near infrared spectrum was treated by two second derivative and Norris smoothing filter noise， 6000-4000 cm 1 wave number range and 7 factors were chosen for partial least squares （PLS） calibration model. The results showed that good correlation was presented between the calibration set/validation set and the values determined by high performance liquid chromatography， and the calibration correlation coefficient （Rc） and validation correlation coefficient （Rcv） were 0.9914 and 0.9935， respectively. Root mean square error of calibration （RMSEC）， root mean square error of validation （RMSEP） and root mean square error of crossvalidation （RMSECV） were 0.484， 0.539 and 0.615， respectively. This method was accurate， reliable， simple， rapid and nondestructive， and could be applied to the fast analysis for ferulic acid in continuous cropping soil.

KeywordsNear infrared transmittance spectroscopy； Continuous cropping soil； Chrysanthemum morifolium cv. （Chuju）； Phenolic acids； Ferulic acid