馮藜櫪+曹文富

[摘要]研究莪術含藥血清抑制活化的大鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）中Hedgehog（Hh）信號通路關鍵因子Shh（sonic hedgehog），Gli1（glioma-associated oncogene homolog-1）表達的機制。清潔級SD大鼠均分2組，分別給予莪術水煎劑、生理鹽水灌胃取血制備含藥血清。體外培養(yǎng)大鼠HSCs，分為7組：空白組、模型組、Hh通路抑制劑組、莪術組、Hh通路抑制劑+莪術組、Hh通路激動劑組、Hh通路激動劑+莪術組。除空白組外，其余各組均給予100 μg·L^-1瘦素誘導后，各組再予以相應藥物干預24 h，經MTT法檢測HSCs增殖情況，RT-PCR法檢測Shh，Gli1的mRNA表達，Western blot法檢測Shh，Gli1蛋白表達及免疫熒光法檢測Gli1蛋白表達。經瘦素活化的大鼠HSCs中Shh，Gli1的mRNA和蛋白表達均顯著上調（與空白組比較P<0.01）。Hh通路抑制劑、莪術含藥血清分別干預后，Shh，Gli1的mRNA和蛋白表達顯著下調（與模型組比較P<0.01）；莪術含藥血清與Hh通路抑制劑協(xié)同干預后，Shh，Gli1 mRNA和蛋白表達顯著下調（與模型組比較P<0.01）；Hh通路激動劑干預后，Shh，Gli1 mRNA和蛋白表達顯著上調（與模型組比較P<0.01）。用莪術含藥血清干預Hh通路激動劑組后，Shh，Gli1 mRNA和蛋白表達顯著下調（與Hh通路激動劑組比較P<0.01）。莪術含藥血清可通過抑制瘦素誘導活化的HSCs中Shh，Gli1的表達，參與Hh信號通路抑制HSCs的活化，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

[關鍵詞] 莪術； 肝星狀細胞； Shh； Gli1； Hedgehog信號通路； 肝纖維化

[Abstract] To explore the mechanism of Ezhu-containing serum in inhibiting the expression of sonic hedgehog（Shh） and glioma-associated oncogene homolog-1（Gli1） in hepatic stellate cells（HSCs） induced by leptin. Twenty sprague-dawley （SD） rats were randomly divided into 2 groups （N=10）， and given Ezhu-decoction and physiological saline by gavage for 10 days to prepare drug-containing serums. The HSCs during the exponential growth phase were divided into 7 groups： blank control group， model group， hedgehog pathway inhibitor（cyclopamine） group， Ezhu group， Ezhu and cyclopamine group， hedgehog pathway agonost（pumorphamine） group， Ezhu and purmorphamine group. HSCs were cultured in vitro and induced with 100 μg·L^-1 leptin（except for the blank control group）， then treated separately with the corresponding drugs for 24 hours. After the cells were collected， HSCs proliferation was detected using MTT colorimetric assay； the expressions of Shh and Gli1 were determined by PT-PCR， Western blot and immunofluorescence， respectively. The expressions of Shh and Gli1 were significantly increased after the HSCs of rats were induced by leptin （compared with the blank control group， P<0.01）. After being interfered with Hh pathway inhibitor （cyclopamine） and Ezhu-containing serum， the expressions of Shh and Gli1 were decreased significantly（compared with the model group， P<0.01）. After Ezhu-containing serum was used to interfere the Hh pathway inhibitor group， the mRNA and protein expressions of Shh and Gli1 were decreased significantly（compared with the model group， P<0.01）. After Ezhu-containing serum was used to interfere the purmorphamine group， the mRNA and protein expressions of Shh and Gli1 decreased significantly（compared with the purmorphamine group， P<0.01）. Ezhu-containing serum plays an important role in inhibiting HSCs activation by taking part in hedgehog signaling pathway， so as to regulate the expression of Shh and Gli1 in leptin-induced HSCs and then inhibit liver fibrosis.

[Key words] Ezhu； hepatic stellate cell； sonic hedgehog； glioma-associated oncogene homolog-1； hedgehog signaling pathway； hepatic fibrosis

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝組織慢性損傷后的修復反應，可進一步發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌^[1-2]。目前已經證實HF是可逆的^[3]，但肝硬化卻不可逆。因此，阻斷和逆轉肝纖維化具有重要的意義。HF主要由細胞外基質（extracellular matrix，ECM）異常增多和降解不足引起。活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSCs）是ECM的主要來源，其過度增殖是肝纖維化形成的關鍵^[4-5]。抑制HSCs活化增殖，可促進ECM降解，從而逆轉肝纖維化^[6-7]。因此，抑制HSCs活化增殖已成為目前抗肝纖維化的主要策略^[8-9]。

研究表明，過度或持續(xù)激活的Hedgeheg（Hh）信號通路可促進HSCs的活化增殖，從而加速肝纖維化的進程，通過干預Hh信號通路抑制HSCs的活化增殖被認為是抗肝纖維化的潛在靶點^[10-11]。目前臨床上尚無明確有效的抗纖維化西藥^[12]，因此開發(fā)具有Hh阻斷效應的中藥具有重要意義。莪術在臨床中常被用于防治肝纖維化，但目前對于莪術抗肝纖維化的基礎研究，報道尚少。本實驗通過觀察莪術含藥血清對活化的HSCs中Hh信號通路關鍵因子Shh，Gli1表達的影響，探討莪術抗肝纖維化可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠20只（雌雄各半），體重180～220 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK（渝）2012-0001。采用隨機數字表法將大鼠分為空白組、莪術組，每組10只，進行灌胃實驗。

1.2 細胞 大鼠肝星狀細胞由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院消化科提供。

1.3 藥物 莪術飲片購自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥房，莪術經重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院曹文富教授鑒定，符合2015年版《中國藥典》規(guī)定標準。生理鹽水購自重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院。

1.4 試劑與器材 兔抗鼠Shh多克隆抗體（BIOSS公司，貨號bs-1544R，規(guī)格0.1 mL）；兔抗鼠Gli1多克隆抗體（Santa Cruz公司，貨號sc-20687，規(guī)格200 mg·L^-1）；瘦素（PeproTech公司，貨號400-21-1000，規(guī)格200 μg）；Hh通路抑制劑（Cyclopamine，Selleck公司，貨號S3042，規(guī)格10 mg）；Hh通路激動劑（Purmorphamine，Selleck公司，貨號S1146，規(guī)格5 mg）；逆轉錄試劑盒（Toyobo公司）；倒置相差顯微鏡（型號CXX41，Olympus）；核酸蛋白分析儀（BECKMAN DU640）；PCR儀（Applied Biosy Stems）；SDS-PAGE凝膠試劑盒（碧云天生物公司）；CO₂細胞孵箱（Thermo）；超凈工作臺（AIRTECH）；HH-W600型恒溫水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 莪術的臨床人用劑量為0.25 g·kg^-1，按“動物與人體的千克體質量折算系數表”成人與大鼠的折算系數為6.25，換算成SD大鼠的臨床劑量作為低劑量，按照該劑量的2，4倍分別為中、高劑量，本實驗選擇高劑量6.25 g·kg^-1為大鼠灌胃劑量。

2.2 含藥血清制備 20只SPF級SD大鼠隨機分為2組（每組10只）：空白組、莪術組。各組均按10 mL·kg^-1·d^-1的濃度給藥，每天1次，連續(xù)10 d，最后1次灌胃2 h后水合氯醛麻醉，無菌條件下心臟采血。血液靜置于4 ℃冰箱過夜，離心（3 000 r·min^-1，10 min）后收集含藥血清。水浴滅活（56 ℃，30 min），0.22 μm濾器過濾收集的含藥血清。

2.3 細胞培養(yǎng) HSCs在5%CO₂，37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清的改良型1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長情況，根據生長狀態(tài)進行換液，當細胞生長至密度達到80%～90%時傳代。

2.4 細胞干預 倒置顯微鏡下觀察細胞生長至80%～90%融合率后，用0.25%胰酶消化，進行實驗。實驗分為7組：空白組、模型組、Hh通路抑制劑組、莪術組、Hh通路抑制劑+莪術組、Hh通路激動劑組、Hh通路激動劑+莪術組?？瞻捉M予以含10%正常鼠血清的1640培養(yǎng)基；模型組予以含100 μg·L^-1瘦素和10%正常鼠血清的1640培養(yǎng)基；Hh通路抑制劑組予以含20 μmol·L^-1 Hh通路抑制劑、10%正常鼠血清及100 μg·L^-1瘦素的1640培養(yǎng)基；莪術組予以含10%莪術含藥血清和100 μg·L^-1瘦素的1640培養(yǎng)基；Hh通路抑制劑+莪術組予以含20 μmol·L^-1 Hh通路抑制劑、10%莪術含藥血清及100 μg·L^-1瘦素的1640培養(yǎng)基；Hh通路激動劑組予以含1 μmol·L^-1 Hh通路激動劑、10%正常鼠血清及100 μg·L^-1瘦素的1640培養(yǎng)基；Hh通路激動劑+莪術組予以含10%莪術含藥血清、1 μmol·L^-1 Hh通路激動劑及100 μg·L^-1瘦素的1640培養(yǎng)基。各組細胞在37 ℃，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后收集細胞。

2.5 MTT法檢測HSCs增殖活性 HSCs按1×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，分為7組，每組6個復孔。在37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱內用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基孵育，24 h后棄上清，按分組條件加入干預因素作用24 h后，于各孔分別加入MTT溶液20 μL，4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀在490 nm 波長處測定各孔吸光度（A）。

2.6 RT-PCR檢測HSCs內Shh，Gli1的mRNA表達 HSCs按每孔5.0×105個/mL接種于6孔板，每孔2 mL，待細胞生長至80%～90%融合時，吸棄培養(yǎng)基，各組加入相應血清及試劑，24 h后收集細胞。提取細胞總RNA；PCR反條件為：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取PCR產物15 μL于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。實驗過程中以GAPDH作內參對照。Shh，Gli1基因上下游引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成，見表1。

2.7 Western blot法檢測HSCs內Shh，Gli1蛋白表達情況 HSCs接種、培養(yǎng)以及藥物處理同2.6項。用蛋白裂解液裂解收集的細胞。分別取蛋白質樣品50 μg上樣，行10%SDS-PAGE電泳分離條帶，轉膜，封閉，TBS-T洗膜，加一抗，4 ℃過夜；TBST洗膜15 min×3次；二抗室溫下孵育1 h，TBST洗膜15 min×3次，曝光顯影，光密度掃描儀記錄結果進行統(tǒng)計分析。以GAPDH表達水平為內參，目標蛋白的表達量以目標蛋白與內參照蛋白灰度值的相對比值表示。

2.8 免疫熒光法檢測HSCs內Gli1蛋白表達情況 取對數生長期HSCs接種于裝有小載玻片的6孔板中，培養(yǎng)及相應組別處理同2.6項，制備細胞爬片。棄上清液，PBS洗3 min×3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3 min×3次，4 ℃，0.1%Triton-X打孔30 min，0.5%BSA封閉，一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜，空白對照以PBS孵育過夜。PBS洗3 min×3次，熒光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI（1∶100）室溫染核10 min，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.9 統(tǒng)計學方法 所有數據采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有數據以±s表示，各組樣本間的比較采用單因素方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計學意義，P<0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 莪術含藥血清對HSCs增殖的影響 與空白組相比，模型組A顯著增高（P<0.01）。與模型組相比，Hh通路抑制劑組、莪術組、Hh通路抑制劑+莪術組A均顯著降低（P<0.01），Hh通路激動劑組A顯著增高（P<0.01）。與Hh通路激動劑組相比，Hh通路激動劑+莪術組的A明顯降低（P<0.01），見表2。

3.2 莪術含藥血清對大鼠肝星狀細胞Shh，Gli1 mRNA表達的影響 與空白組比較，模型組Shh，Gli1 mRNA顯著上調（均P<0.01）。與模型組比較，Hh通路抑制劑組、莪術組、Hh通路抑制劑+莪術組Shh，Gli1 mRNA顯著下調（均P<0.01）。與模型組比較，Hh通路激動劑組Shh，Gli1 mRNA顯著上調（均P<0.01）。與Hh通路激動劑組比較，Hh通路激動劑+莪術組Shh，Gli1 mRNA顯著下調 （均P<0.01），見表3。

3.3 Western blot 法檢測莪術含藥血清對大鼠肝星狀細胞Shh，Gli1蛋白表達的影響 與空白組比較，模型組Shh，Gli1蛋白表達顯著上調（均P<0.01）。

與模型組比較，Hh通路抑制劑組、莪術組、Hh通路抑制劑+莪術組Shh，Gli1蛋白表達顯著下調（均P<0.01）。與模型組比較，Hh通路激動劑組Shh，Gli1蛋白表達顯著上調（均P<0.01）。與Hh通路激動劑組比較，Hh通路激動劑+莪術組Shh，Gli1蛋白表達顯著下調（均P<0.01），見圖1，表4。

3.4 免疫熒光法檢測莪術含藥血清對大鼠肝星狀細胞Gli1蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組和Hh通路激動劑組中Gli1呈高表達，熒光顯微鏡下可見明顯紅色熒光。與模型組比較，Hh通路抑制劑組、莪術組、Hh通路抑制劑+莪術組Gli1表達明顯減弱。與Hh通路激動劑組比較，Hh通路激動劑+莪術組Gli1表達明顯減弱，見圖2。

4 討論

肝纖維化是由活化的HSCs轉化成肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB），大量合成和分泌ECM，并過度沉積所致。HSCs被激活是纖維化發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，有效抑制HSCs的活化和增殖是抗纖維化的關鍵^[13]。

臨床上通過辨證論治，運用莪術治療肝纖維化，療效是肯定的，但其抗肝纖維化的作用機制尚未闡明。中醫(yī)認為肝纖維化屬于脅痛、積聚等范疇，多因寒、熱、濕、毒等病邪反復刺激肝臟，日久則肝虛絡瘀，功能受損。研究表明，瘀血阻滯存在于肝纖維化發(fā)生發(fā)展的始終^[14]。瘀血阻滯肝脈，不通則痛，即出現胸脅脹痛。瘀血阻于內而形于外則可見舌質紫暗有瘀點瘀斑、脈澀等。其進一步發(fā)展可出現脾臟腫大、肝掌、蜘蛛痣等癥狀，符合中醫(yī)學氣滯血瘀之病變及莪術用藥指征。因此，通過活血化瘀改善肝微循環(huán)是治療肝纖維化的重要途徑。莪術性味辛、苦、溫，歸肝、脾經，具有行氣破血、消積止痛之功，中醫(yī)臨床常用于治療肝纖維化。研究表明，莪術可保護肝細胞，改善血液循環(huán)，增加肝內循環(huán)血量，減少纖維組織增生，促進膠原纖維降解吸收^[15]。

近年來，促進肝再生已成為防治肝纖維化的新途徑。經典的Hh信號途徑是一條高度保守的信號通路，在組織損傷后的修復、再生方面起著重要的作用^[16]。該通路主要由Hh配體、膜蛋白受體、核轉錄因子Gli組成。經典的Hh活化機制是^[17]，當不存在Hh配體時，該通路處于抑制狀態(tài)；Hh配體存在時，配體與膜蛋白受體結合，將Hh信號向細胞內傳遞，激活核轉錄因子Gli基因家族，Hh信號通路被激活。經典的Hh信號通路活化依賴于Hh配體存在，并與受體結合，從而活化信號通路。相關研究證實，Hh信號通路與各類慢性肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關^[18-19]。研究表明，Hh信號通路可通過調控HSCs的活化增殖，促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，而阻斷Hh信號通路可減輕肝纖維化的病變程度^[20]。在正常肝臟中HSCs是靜止的，肝組織受損時死亡的肝細胞釋放Hh配體Shh激活Hh信號通路^[21]，促進靜止的HSCs向MFB轉化，且MFB自分泌或旁分泌的Shh使Hh信號通路持續(xù)激活，使HSCs進一步增殖，抑制凋亡^[22-23]。Gli1作為Hh通路末端的核轉錄因子，是Hh通路激活的標志，在HSCs活化過程中必不可少^[24-25]。Shh，Gli1是Hh信號通路首末兩端的關鍵因子，其高表達是Hh信號通路激活的標志，因此本實驗選擇Shh，Gli1作為檢測指標。

研究發(fā)現，瘦素可激活Hh信號通路，促進靜止型HSCs向肌成纖維細胞轉化^[26]。本實驗以瘦素為刺激因子，結果顯示，瘦素誘導HSCs后，HSCs中Shh，Gli1分子的基因和蛋白表達水平均顯著上調，提示Hh信號通路被廣泛激活。研究顯示Hh信號抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine）能有效地抑制Hh信號通路活性，抑制HSCs的活化和增殖，從而減輕肝纖維化程度^[27]。本研究也顯示，予以環(huán)靶胺、莪術含藥血清分別干預，均能夠明顯抑制活化的HSCs中Shh，Gli1的表達水平。在環(huán)靶胺和莪術協(xié)同干預下，Shh，Gli1的表達水平進一步下調，說明莪術與環(huán)靶胺在抑制HSCs方面具有協(xié)同作用。予以Hh通路激動劑干預瘦素激活的HSCs，使HSCs被高度活化，再應用莪術干預高度活化的HSCs顯示Shh，Gli1表達明顯下調，說明莪術對不同活化狀態(tài)的HSCs均能起到抑制作用。本研究顯示，用莪術含藥血清干預Shh，Gli1產生抑制作用，這提示抑制活化的HSCs中異常激活的Hh信號通路是莪術抗纖維化的作用機制之一。

本實驗用環(huán)巴胺作為陽性對照。環(huán)巴胺是Hh信號通路特異性抑制劑^[28]，可通過抑制Hh信號通路而抑制HSCs活化和增殖，加速ECM降解，促進HSCs凋亡，逆轉肝纖維化。但其具有嚴重致畸性，可導致在胚胎發(fā)育過程中產生前唇裂、腭裂、單眼畸形等，限制了其在臨床應用。莪術是中醫(yī)常用行氣活血化瘀藥物，功效顯著，毒副作用小，價格低廉，中醫(yī)臨床廣泛應用于治療肝纖維化。本研究結果顯示莪術具有環(huán)靶胺類似的功效。莪術含藥血清可通過抑制活化的HSCs中Shh，Gli1的表達，參與Hh信號通路抑制HSCs的活化和增殖，發(fā)揮其抗纖維化作用，為臨床應用莪術治療肝纖維化提供了新的理論依據。

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[責任編輯 張寧寧]