胡竣航，李臣軍，常桂英 (吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

烏腺金絲桃醇溶物對(duì)二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件及抑菌效果

胡竣航，李臣軍，常桂英
(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

為了進(jìn)一步研究烏腺金絲桃(Hypericumattenuatum)的藥理活性機(jī)理，為開(kāi)發(fā)利用長(zhǎng)白山特色資源提供依據(jù)，探討了烏腺金絲桃醇溶物對(duì)二氫葉酸還原酶(DHFR)抑制的最佳條件。通過(guò)建立DHFR酶反應(yīng)體系，采用分光光度法測(cè)定酶活力，分別研究了烏腺金絲桃的根、莖、葉、花的醇溶物對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制作用。結(jié)果表明：4種醇溶物對(duì)二氫葉酸還原酶有不同程度的抑制作用，其中花的醇溶物抑制作用最為明顯，抑制率為30%，最佳作用溫度為40℃，最佳作用pH為7.5，添加的最適二氫葉酸底物濃度為20μL 1×10-4mol/L，最佳NADPH濃度為20μL 1×10-3mol/L，最佳巰基乙醇濃度為50μL 0.01mol/L，最佳酶用量為10μL。

烏腺金絲桃(Hypericumattenuatum)；二氫葉酸還原酶；反應(yīng)體系；酶抑制的最佳條件

全世界共有400余種金絲桃屬(HypericumLinn)植物,我國(guó)有55種。金絲桃屬植物在我國(guó)東北地區(qū)分布較少,作為藥用植物的僅有2種，即長(zhǎng)柱金絲桃[HypericumlongistylumOliv]和烏腺金絲桃[Hypericumattenuatum][1]。金絲桃屬植物的化學(xué)成分研究結(jié)果表明，該屬植物主要含有二蒽酮類(lèi)、黃酮類(lèi)、間苯三酚類(lèi)和芳香酸類(lèi)化合物等化學(xué)成分，具有抗菌消炎、收斂止血，以及治療黃疸、肝炎及瘡癤腫毒的作用,對(duì)心律失常、心肌缺血、心衰和增強(qiáng)免疫力具有較好的功效，同時(shí)還具有抗抑郁、抗腫瘤及抗病毒等活性[2]。

二氫葉酸還原酶(DHFR)可以將體內(nèi)的二氫葉酸(FH2)還原為四氫葉酸(FH4),從而調(diào)節(jié)四氫葉酸的再生[3]。四氫葉酸是體內(nèi)一碳單位轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的輔酶，是由葉酸在維生素C和 NADH+存在下，經(jīng)葉酸還原酶作用下生成二氫葉酸，然后由二氫葉酸還原酶催化生成四氫葉酸。四氫葉酸可傳遞一碳單位，參與嘌呤和嘧啶的合成，是 DNA合成所必須的，對(duì)正常血細(xì)胞的生成具有促進(jìn)作用[4]。所以當(dāng)葉酸缺乏或某些藥物抑制葉酸還原酶，使葉酸不能轉(zhuǎn)變?yōu)樗臍淙~酸，都可能影響血細(xì)胞的發(fā)育和成熟。同時(shí)，DHFR 的異常表達(dá)也是一些腫瘤發(fā)生、發(fā)展的原因。控制四氫葉酸的生成，成為治療癌癥藥物的主要研究方向，二氫葉酸還原酶便成為抗癌藥物的主要靶酶[5]。

目前已知抗腫瘤藥物如氨甲蝶呤等均為DHFR抑制劑，但這些化學(xué)藥物毒副作用極強(qiáng)。因而尋找和開(kāi)發(fā)天然植物DHFR抑制劑成為抗腫瘤藥物研究的重要方向[6]。烏腺金絲桃醇溶物具用明顯的抗病毒、抗腫瘤活性，但從目前的研究現(xiàn)狀來(lái)看，烏腺金絲桃主要化學(xué)成分作用機(jī)理的研究涉及的比較少，對(duì)代謝關(guān)鍵酶的研究還沒(méi)見(jiàn)報(bào)道,探討其對(duì)DHFR酶活力的影響將會(huì)對(duì)開(kāi)發(fā)利用烏腺金絲桃植物資源起到積極的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烏腺金絲桃全草采自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院烏腺金絲桃基地。巰基乙醇、磷酸鉀緩沖液等生化試劑由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。二氫葉酸和二氫葉酸還原酶為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品，分析純級(jí)。

1.2 試驗(yàn)儀器

搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)DFY-500：江蘇省江陰市萬(wàn)達(dá)藥化機(jī)械有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA和冷凍干燥機(jī)、真空冷凍抽濾機(jī)：日本東京理化公司產(chǎn)品；μ2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 醇溶物的提取

采摘烏腺金絲桃全草，洗凈，將其根、莖、葉、花分開(kāi)，干燥后用藥材量的20倍的80%乙醇浸提12h，收集醇溶液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提取浸膏，冷凍干燥機(jī)干燥，再用真空冷凍抽濾機(jī)得到干燥的結(jié)晶物，置于-40℃下儲(chǔ)存，備用。

1.3.2 DHFR反應(yīng)體系的建立

用分光光度法測(cè)定DHFR酶活力,酶活力以測(cè)定NADPH特征性的340nm波長(zhǎng)下光密度值下降速度來(lái)表示。

DHFR反應(yīng)體系：于4mL比色皿中依次加入50μL二次蒸餾水，100L 50mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH7.5)，50μL 0.01mol/L巰基乙醇，10μL 1×10-3mol/LNADPH溶液，20μL 1×10-4mol/L二氫葉酸，最后加10μL DHFR?？焖倩靹蚝蠓謩e在0、3、6、9、12、15、18min時(shí)測(cè)定340nm波長(zhǎng)下的光密度值，建立底物與酶活力關(guān)系曲線。

酶活力定義為：每3min減少0.010個(gè)光密度為1個(gè)活力單位。

1.3.3 醇提物對(duì)DHFR酶活力的最小抑制濃度及最佳抑制條件試驗(yàn)

1)最小抑制濃度 準(zhǔn)確稱(chēng)量烏腺金絲桃干燥結(jié)晶醇提物，配置成10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-4、10-5、10-7mg/mL的溶液，分別加入反應(yīng)體系，測(cè)定DHFR酶活力，確定醇提物對(duì)DHFR酶活力的最小抑制濃度。

2)最適溫度 在DHFR反應(yīng)體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，在25、30、35、37、40、45、50℃下測(cè)DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的溫度為最適溫度。

3)最適pH 在DHFR反應(yīng)體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇酶最適溫度，在4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 pH下測(cè)DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的pH為最適pH。

4)最適二氫葉酸濃度 在DHFR反應(yīng)體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為5、10、15、20、25μL 1×10-4mol/L二氫葉酸，測(cè)DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的底物濃度為最適底物濃度。

5)最適NADPH濃度 在DHFR反應(yīng)體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為5、10、15、20μL 1×10-3mol/L NADPH，測(cè)DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的NADPH濃度為最適底物濃度。

6)最適巰基乙醇濃度 在DHFR反應(yīng)體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為20、30、50、70μL 0.01mol/L巰基乙醇，測(cè)DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的巰基乙醇濃度為最適添加濃度。

7)最適酶用量 在DHFR反應(yīng)體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為5、10、15、20μL DHFR，測(cè)DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的NADPH濃度為最適酶濃度。

8)正交試驗(yàn) 在上述7個(gè)試驗(yàn)結(jié)果后，設(shè)計(jì)7因素2水平正交試驗(yàn)(表1)，篩選最小抑制濃度、溫度、pH、二氫葉酸濃度、NADPH濃度、巰基乙醇濃度、酶濃度等的最優(yōu)組合。

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表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.4 抑菌試驗(yàn)

1)供試菌液的制備 LB培養(yǎng)基的配置與滅菌→細(xì)菌的活化(37℃下24h)→ 配置菌懸液備用。

2)濾紙片法抑菌效果測(cè)定 制備4種濃度分別為2、4、6、8mg/mL烏腺金絲桃醇溶物。采用濾紙片法，將直徑為10mm的濾紙片滅菌后，分別浸泡于各濃度胞外粗提物溶液中2h,分別吸取0.4mL各供試菌懸液涂布于培養(yǎng)皿上，并且以無(wú)菌生理鹽水組作對(duì)照。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置于37℃培養(yǎng)24h，測(cè)量各供試菌在不同濃度下的抑菌圈大小。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物與酶活力關(guān)系曲線

利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得反應(yīng)進(jìn)程中NADPH在340nm處光密度的變化值，得到酶活力變化曲線(圖1)。

圖1 酶活力變化曲線

2.2 醇提物對(duì)DHFR酶活力的最小抑制濃度

醇提物對(duì)DHFR酶活力的最小抑制濃度試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，烏腺金絲桃4個(gè)不同器官的醇提物均表現(xiàn)抑制作用，其中花的抑制作用最好，花、葉、莖和根的抑制率分別為30%、26%、16%和15%，這與其主要有效成分在全草中的分布狀況有關(guān)[7]。在受試濃度下，濃度越大，抑制效果越明顯，選擇10mg/mL為最佳抑制濃度，。

圖2 醇提物對(duì)DHFR酶活力的最小抑制濃度

2.3 溫度對(duì)DHFR酶活力的影響

不同溫度下的DHFR酶活力測(cè)定結(jié)果如圖3所示。溫度變化主要是對(duì)酶的活性影響，過(guò)高過(guò)低的反應(yīng)溫度都會(huì)使酶活力下降，由圖3可知，反應(yīng)體系中酶的最佳活性溫度為40℃左右。

圖3 不同溫度下的DHFR酶活力

2.4 pH對(duì)DHFR酶活力的影響

不同pH下的酶活力測(cè)定結(jié)果如圖4所示。pH對(duì)酶反應(yīng)體系的影響也是對(duì)酶活性的影響，過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)使酶活力下降，由圖4可知，反應(yīng)體系中酶的最佳pH為7.5。

圖4 不同pH下的DHFR酶活力

2.5 二氫葉酸濃度、NADPH濃度、巰基乙醇濃度以及二氫葉酸還原酶濃度對(duì)DHFR酶活力的影響

在不同二氫葉酸濃度、不同NADPH濃度、不同巰基乙醇濃度以及不同二氫葉酸還原酶濃度條件下的酶活力測(cè)定結(jié)果分別如圖5～8所示。由圖5～8可知，其最佳條件分別為：1×10-4mol/L的二氫葉酸加入量為20μL，1×10-3mol/L 的NADPH加入量為20μL，0.01mol/L的巰基乙醇加入量為50μL，酶的加入量為10μL。這與安會(huì)梅的研究結(jié)果相吻合[8]。

圖5 不同濃度二氫葉酸下的DHFR酶活力

圖6 不同濃度NADPH下的DHFR酶活力

圖7 不同濃度巰基乙醇下的DHFR酶活力

圖8 不同酶濃度下的DHFR酶活力

2.6 醇提物對(duì)二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知：影響DHFR酶活力大小的因素由大到小依次為溫度、最小抑制濃度、DHFR的加入量、巰基乙醇的加入量、二氫葉酸的加入量、pH、NADPH的加入量。由極差分析可知，B因素(溫度)對(duì)DHFR的活性影響最大，E因素(NADPH的加入量)的影響最小。由此可知：10mg/mL為醇提物的最佳抑制濃度，其中花的抑制作用最為明顯，抑制率為30%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌作用

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，烏腺金絲桃醇溶物的濃度越高，抑菌圈直徑越大，胞外粗提物的濃度與抑菌效果呈正相關(guān)關(guān)系；同時(shí)，沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑比較長(zhǎng)，而四聯(lián)球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈直徑相對(duì)較短(表3)。其原因可能是：革蘭氏陽(yáng)性菌能產(chǎn)生外毒素，在菌體開(kāi)始生長(zhǎng)的階段，代謝旺盛，細(xì)胞增殖快，外毒素含量高，對(duì)烏腺金絲桃醇提物的活性破壞作用強(qiáng)，產(chǎn)生的抑菌效果不明顯；革蘭氏陰性菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素，在菌體生長(zhǎng)階段，代謝旺盛，細(xì)胞增殖快，也有少量衰亡、死亡的細(xì)胞會(huì)釋放的內(nèi)毒素，但其含量低，對(duì)烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用弱，產(chǎn)生的抑菌效果明顯。

表3 烏腺金絲桃醇溶物對(duì)各供試菌的抑菌效果

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，烏腺金絲桃4個(gè)不同器官的醇提物對(duì)DHFR均表現(xiàn)抑制作用，其中花的抑制作用最強(qiáng)，花、葉、莖和根的抑制率分別為30%、26%、16%和15%。通過(guò)建立DHFR反應(yīng)體系測(cè)定酶活力，結(jié)果表明：DHFR的最佳活性溫度為40℃左右；最適pH為7.5；1×10-4mol/L的二氫葉酸最適加入量為20μL；1×10-3mol/L 的NADPH最適加入量為20μL； 1×10-2mol/L的巰基乙醇最適加入量為50μL；酶的最適加入量為10μL。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：烏腺金絲桃醇溶物對(duì)細(xì)菌有抑制作用，并與醇溶物濃度成正相關(guān)，尤其對(duì)革蘭氏陰性菌作用明顯。

本研究結(jié)果表明烏腺金絲桃的醇溶物對(duì)二氫葉酸還原酶有一定的抑制作用，其結(jié)果可為以后提取工藝的優(yōu)化、反應(yīng)體系的優(yōu)化、主要有效成分的提純、抗腫瘤新藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

[1]張喜.烏腺金絲桃中金絲桃素的含量測(cè)定及提取純化金絲桃素的工藝研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2011.

[2]王玲，索朗斯珠，馬俊英，等.金絲桃素的提取分離及其藥理活性研究現(xiàn)狀[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(5):32～35.

[3]楊靜.二氫葉酸還原酶(DHFR)與SμFμ相互作用調(diào)節(jié)Hedgehog信號(hào)通路[D].南昌：南昌大學(xué)，2013.

[4]吳嘉煒.酶的調(diào)控機(jī)制及動(dòng)力學(xué)[D].北京：中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所，1999.

[5]朱靜.葉酸、核黃素缺乏及亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性對(duì)人類(lèi)遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性的影響[D].昆明：云南師范大學(xué)，2006.

[6]李榮華，張?jiān)鋈~，崔海靖，等.抗腫瘤藥物的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2004，(1):16～19.

[7]邢桂珍.金絲桃素的提取與化學(xué)合成工藝的研究[D].蘭州：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，2007.

[8]安會(huì)梅.熒光光度法二氫葉酸還原酶抑制劑篩選模型的建立和應(yīng)用[D].北京：首都師范大學(xué)，2006.

[編輯] 余文斌

2016-05-29

吉林省大學(xué)生創(chuàng)新資助項(xiàng)目(2015[040]);長(zhǎng)白山重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2014[s003])。

胡竣航(1994-)，男，現(xiàn)從事生物化學(xué)與生物工程研究。通信作者：常桂英，cgy650607@126.com。

Q949.758.5

A

1673-1409(2017)02-0036-06

[引著格式]胡竣航，李臣軍，常桂英.烏腺金絲桃醇溶物對(duì)二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件及抑菌效果[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(2)：36～41,45.