于亞男YU Ya-nan 吳正鈞 - 韓 瑨

(1. 乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436；2. 上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，上海 200436；3. 光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436；4. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

目前，齲齒是普遍存在于兒童和成人中的一種慢性口腔傳染病[1]，其成因與變形鏈球菌(Streptococcusmutans)在牙齒表面的定殖有密切的聯(lián)系。牙菌斑生物膜的形成是致齲的關(guān)鍵，因此，減少或抑制生物膜的形成是防治齲齒的重要途徑?？股厥悄壳爸委熀皖A(yù)防齲齒的主要方法，但長期使用抗生素容易導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生，導(dǎo)致療效降低及其潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)。

益生菌可以治療和減緩多種腸道炎癥、尿道感染和呼吸道疾病，并且具有較高的安全性。Stensson M等[2]將113位6歲兒童分成2組，其中60位攝入羅伊氏乳桿菌(Lb.ruteri)ATCC 55730，53位給予安慰劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)服用益生菌兒童組齲齒發(fā)生的比例較低。郭夏蕾等[3]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌(Lb.plantarum)K25不僅對變形鏈球菌菌膜有較高的抑制率，還顯著降低變形鏈球菌的黏附率。因此，通過篩選特定的益生菌，可以達(dá)到防治齲齒的目的。

唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)是嬰兒出生后最先定殖在口腔中的乳酸菌之一[4]，是健康成人口腔中典型的共生菌群。本試驗(yàn)所用供試菌株S.salivariusBD3900(CGMCC13308)來自健康志愿者口腔，通過體外試驗(yàn)，分析了BD3900作為預(yù)防口腔疾病益生菌的潛質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

變形鏈球菌(S.mutansCGMCC1.2499)：中國普通微生物保藏中心；

唾液鏈球菌BD3900(S.salivariusCGMCC13308)：乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

BHI培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基：英國OXOID公司；

TPY合成培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；

胰酪蛋白胨、酵母提取物：上海拜力生物科技有限公司；

L-胱氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、C12H22O11、CH3COONa、Na2SO4、99%乙醇、結(jié)晶紫試劑、二甲苯、乙酸乙酯、氯仿：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高壓蒸氣滅菌鍋：HVE-50型，日本Hirayama公司；

超凈工作臺(tái)：TH-CB-402型，英國Labconco公司；

厭氧培養(yǎng)箱：Bug Box DUAL型，英國Jouan S.A公司；

電子天平：XW-80A型，上海青浦滬西儀器廠；

酶標(biāo)儀：Spectra M5型，美國Molecular Devices公司；

小型冷凍離心機(jī)：5417R型，德國Eppendorf公司；

pH計(jì)：PHS-25型，美國奧立龍公司；

全自動(dòng)生長曲線分析儀：Bioscreen C型，上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌落形態(tài)與細(xì)胞觀察 將BD3900劃線接種于M17固體培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察單菌落形態(tài)。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.2 菌體的制備 將新活化的BD3900和S.mutans分別接種于M17和BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h，4 ℃、10 000×g離心20 min，取菌體。用pH 6.8的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后將菌體懸浮于少量pH 6.8的PBS中，備用。

1.2.3 唾液鏈球菌BD3900最適培養(yǎng)基篩選 調(diào)節(jié)BD3900活菌數(shù)約為106CFU/mL，取50 μL該菌液于96孔板，分別加入200 μL M17、TYC、BHI或TPY培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。用微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀每隔1 h測一次OD600 nm值，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.4 唾液鏈球菌BD3900最適培養(yǎng)溫度 挑取新鮮培養(yǎng)的BD3900菌體于M17液體培養(yǎng)基中，調(diào)整其初始的OD600 nm=0.10±0.01，分別置于37，42，45 ℃水浴中培養(yǎng)，每隔2 h測OD600 nm吸光值，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.5 唾液鏈球菌BD3900疏水作用力 用pH 6.8 PBS調(diào)節(jié)BD3900菌懸液至OD600 nm=0.6，向上述菌懸液(3 mL)加入疏水溶劑二甲苯(1 mL)，靜置5 min，充分振蕩120 s，再靜置10 min，取水相測其OD600 nm值。疏水率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

H——疏水率，%；

A0——BD3900菌懸液初始吸光值；

A1——靜置后的水相吸光值。

1.2.6 唾液鏈球菌BD3900表面電荷 以乙酸乙酯作為路易斯堿，氯仿作為路易斯酸[5]，按照 1.2.5 的方法測定。

1.2.7 唾液鏈球菌BD3900對溶菌酶的耐受性 調(diào)節(jié)BD3900活菌數(shù)約為108CFU/mL，取50 μL該菌液、200 μL M17液體培養(yǎng)基分別加入不同濃度的溶菌酶(20 000 U/mg)溶液，使溶菌酶的終濃度分別為0，50，75，100，125，150 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。用微生物全自動(dòng)生長曲線分析儀每隔1 h測一次OD600 nm值，每組設(shè)置3個(gè)平行孔，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.8 BD3900的溶血性 向融化后冷卻至45 ℃的M17固體培養(yǎng)基中加入5 mL/100 mL馬血，倒平板，待其凝固后，將新鮮培養(yǎng)的BD3900菌體劃線于血瓊脂平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察是否產(chǎn)生溶血圈。

1.2.9 唾液鏈球菌BD3900的自聚能力 調(diào)節(jié)BD3900菌懸液菌濃使其OD600 nm=0.6，37 ℃分別靜置2，4 h，檢測其上層液體的OD600 nm值。自凝集率按式(2)計(jì)算：

(2)

式中：

S——自凝集率，%；

A0——BD3900菌懸液初始吸光值；

At——靜置th后BD3900菌懸液上層液體的吸光值。

1.2.10 唾液鏈球菌BD3900和變形鏈球菌的共聚能力 調(diào)節(jié)BD3900和S.mutans菌懸液菌濃，使其OD600 nm=0.6，等比例混合，用渦旋振蕩器混合均勻后立即測混合后的OD600 nm值，37 ℃分別靜置2，4 h，檢測其上層液體的OD600 nm吸光值[6]。共凝集率按式(3)計(jì)算：

(3)

式中：

C——共凝集率，%；

A0mix——0 h混合菌懸液吸光值；

Amix——th 后混合菌懸液上層液體的吸光值。

1.2.11 唾液鏈球菌BD3900對S.mutans生物膜形成的影響 將Barira Islam等[7]的方法進(jìn)行部分改良，具體操作步驟：將S.mutans和BD3900菌懸液的菌濃調(diào)整為105CFU/mL，各取50 μL于96微孔板中，再加100 μL BHI液體培養(yǎng)基(含有0.25%蔗糖)共培養(yǎng)，對照組將BD3900菌懸液以無菌生理鹽水替代。將微孔板置于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，用去離子水將每個(gè)參與反應(yīng)的微孔洗滌3次以上，盡可能去除游離細(xì)菌，倒扣微孔板，待其自然干燥后，向每孔加入100 μL 0.5 g/L 的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15 min，使結(jié)合在板底部的生物膜著色；除去染色液后，用去離子水洗滌至不顯染料顏色為止；自然干燥后每孔加入200 μL無水乙醇使染料充分釋放，測其OD600 nm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察

BD3900在M17固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)白色、圓形的菌落形態(tài)，表面光滑濕潤，邊緣規(guī)則，無色素產(chǎn)生[見圖1(a)]。革蘭氏染色后在油鏡下觀察，菌體形態(tài)為橢圓形，直徑1～2 mm，無芽孢，成單、成對或者成鏈存在，BD3900的菌體形態(tài)[見圖1(b)]，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的結(jié)果基本一致。

2.2 BD3900最適生長條件

將BD3900分別接種于不同的培養(yǎng)基，每隔1 h測定一次OD600 nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600 nm值為縱坐標(biāo)繪制不同營養(yǎng)條件下的生長曲線，篩選最適生長培養(yǎng)基。由圖2 可知，BHI和M17培養(yǎng)基最快進(jìn)入生長指數(shù)期和穩(wěn)定期，比其他培養(yǎng)基(TYC和TPY)提前了3 h以上，可能是BHI和M17培養(yǎng)基中含有某些可被菌體快速利用的物質(zhì)，從而促進(jìn)菌體先于其他培養(yǎng)基進(jìn)入增殖階段。但BHI培養(yǎng)基在菌株增殖效果方面不及M17培養(yǎng)基(最高OD600 nm為0.8)，BD3900在M17培養(yǎng)基中生長狀態(tài)顯著優(yōu)于其他培養(yǎng)基，其OD600nm值最高可達(dá)1.4，說明M17培養(yǎng)基營養(yǎng)全面而充足，有利于BD3900菌體的大量繁殖。因此，選擇M17作為BD3900培養(yǎng)基。BD3900接種于M17液體培養(yǎng)基后于37，42，45 ℃水浴培養(yǎng)，每隔2 h測定發(fā)酵液的OD600 nm，最先達(dá)到0.6的溫度即為最適生長溫度。由圖3可知，在培養(yǎng)前期BD3900在各測試溫度下均有不同程度的增加，培養(yǎng)至8 h時(shí)，37，42 ℃樣品組的OD600 nm均達(dá)到0.6，但42 ℃樣品組的OD600 nm值在各取樣點(diǎn)始終高于37 ℃樣品組的，因此，BD3900的最適生長溫度為42 ℃。

2.3 BD3900的溶血特性

微生物的安全性是FAO/WHO評價(jià)其應(yīng)用潛質(zhì)的考量因素之一，作為益生菌對宿主無害是首要前提。溶血性是衡量鏈球菌安全性的關(guān)鍵性指標(biāo)，不同鏈球菌在血平板上的溶血現(xiàn)象主要有α型、β型、γ型三類。α型溶血：菌落周圍呈現(xiàn)較窄的草綠色溶血環(huán)，此類菌稱為α型溶血性鏈球菌，又叫草綠色鏈球菌；β型溶血：菌落周圍出現(xiàn)較寬的透明溶血環(huán)，這類菌能產(chǎn)生溶血素等毒素，致病性強(qiáng)，被稱為β型溶血性鏈球菌；γ型溶血：菌落周圍無溶血環(huán)，故這類鏈球菌安全性最高，被稱為不溶血鏈球菌。BD3900在血平板上無溶血圈出現(xiàn)(見圖4)，表明攝入菌株BD3900后，侵染宿主的風(fēng)險(xiǎn)較低，具有較高的安全性，符合食品應(yīng)用的基本要求[5]。

2.4 疏水作用和靜電作用分析

在口腔中，益生菌通過特異性和非特異性方式黏附于口腔黏膜上，益生菌非特異黏附能力主要與靜電、疏水和范德華力相關(guān)。由表1可知，BD3900對非極性溶劑二甲苯黏附率高達(dá)95.8%，說明其具有極強(qiáng)的表面疏水性。Handley等[9]將由人體唾液分離出的12株唾液鏈球菌進(jìn)行疏水性質(zhì)測試，發(fā)現(xiàn)它們都具有很強(qiáng)的疏水性(93.5%～95.2%)。此外，BD3900還具有一定的靜電作用力，對氯仿和乙酸乙酯表現(xiàn)高度的黏附性，分別為88.6%和99.6%，表明菌體表面攜帶大量可產(chǎn)生靜電作用力的電荷。BD3900所具備的較強(qiáng)的疏水作用力和靜電作用力，有助于其黏附于口腔黏膜表面，從而與病原菌競爭結(jié)合位點(diǎn)以發(fā)揮其益生特性。

2.5 對抗生素和溶菌酶的耐受性分析

溶菌酶是一類廣泛存在于唾液、淚液、血清、淋巴等中能夠選擇性分解微生物細(xì)胞壁導(dǎo)致微生物死亡的非特異性免疫因子[10]。測試BD3900對不同濃度溶菌酶的耐受性，由圖5 可知，當(dāng)溶菌酶的終濃度為50～100 μg/mL時(shí)，與不加溶菌酶的對照組相比生長趨勢無顯著差異；當(dāng)培養(yǎng)體系中溶菌酶的濃度達(dá)到125 μg/mL時(shí)，BD3900進(jìn)入對數(shù)期和穩(wěn)定期的時(shí)間延長，該濃度的溶菌酶對BD3900開始發(fā)揮作用；而溶菌酶的濃度達(dá)到150 μg/mL時(shí)，BD3900無明顯生長跡象。Angmo等[11]在發(fā)酵食品中分離出84株乳酸菌，大部分的菌株都可以耐受50 μg/mL的溶菌酶，其中菌株標(biāo)號(hào)55和72對100 μg/mL的溶菌酶具有較好的耐受性。BD3900能夠耐受100 μg/mL的溶菌酶，遠(yuǎn)高于人體口腔環(huán)境中常見的溶菌酶濃度(1～57 μg/mL)[12]，表明 BD3900不僅能非特異性黏附于口腔黏膜表面，而且在口腔中具有良好的存活能力。

2.6 聚和共聚能力分析

Lang等[13]認(rèn)為變形鏈球菌選擇性的與益生菌共聚，有利于將浮游的變形鏈球菌從口腔中去除。從624株乳酸菌中篩選出6株與S.mutans具有共聚能力的菌株，并將其中一株共聚性能最好的副干酪乳桿菌DSMZ16671進(jìn)行小鼠試驗(yàn)。研究[14]發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組小鼠齲齒的發(fā)生率明顯低于對照組，表明其能夠有效預(yù)防齲齒。也有人[15]指出共聚能力強(qiáng)弱可以作為篩選預(yù)防齲病益生菌的一個(gè)補(bǔ)充指標(biāo)，但是否具有應(yīng)用潛力，還需要結(jié)合其他方面的性質(zhì)來判斷。除了共聚能力外，作為口腔益生菌還應(yīng)具備一定的自聚能力，高自聚作用有利于益生菌在黏膜表面的定殖，不易于被唾液等流體沖刷，同時(shí)，高自聚作用有利于提高口腔中益生菌的濃度，使其更好地發(fā)揮功能[16]。由圖6可知，BD3900的自聚和共聚能力與孵育時(shí)間均呈正相關(guān)，即孵育時(shí)間越長，BD3900的聚集能力(自聚和共聚能力)越強(qiáng)，在測試時(shí)間(4 h)內(nèi)其自聚和共聚率最高可達(dá)20.0%和64.3%，由此可見，BD3900菌體自身具有較高的自聚與共聚能力。由于蔗糖是公認(rèn)的關(guān)鍵性致齲因素[17]，因此，本試驗(yàn)還考察了蔗糖濃度對BD3900的自聚能力以及與S.mutans共聚能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：① 蔗糖濃度對BD3900自聚作用無顯著影響，各蔗糖水平下的自聚效果基本處于相同水平，可推測蔗糖不是介導(dǎo)其自聚的主要因素；② BD3900與S.mutans的共聚作用隨著蔗糖濃度的遞增而加強(qiáng)，以4 h的共孵育樣品為例，在不添加蔗糖的情況下BD3900與S.mutans共聚率僅為13.1%，依次加入0.25%，1.00%，2.00%，5.00%蔗糖后，2株菌的共同聚集率也相應(yīng)地攀升，分別達(dá)到21.2%，42.0%，49.0%，64.3%。表明蔗糖是調(diào)控BD3900共聚效果的一個(gè)至關(guān)重要的環(huán)境因素。

2.7 抑制生物膜形成量

S.mutans被公認(rèn)為是口腔病原菌，其主要通過代謝口腔環(huán)境中的碳水化合物(主要為蔗糖)，產(chǎn)生具有黏性的水溶性多糖和不溶性胞外多糖，這些多糖黏附在牙釉表面，成為S.mutans及其它細(xì)菌附著的介質(zhì)，導(dǎo)致牙菌斑形成，牙菌斑中其他的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸后引發(fā)齲齒。因此，減少S.mutans生物膜的生成量有利于減少這類致齲菌在口腔中的定殖，從而有助于預(yù)防齲齒的形成或緩解齲齒的癥狀。由圖7可知，和對照組(S.mutans單菌培養(yǎng))相比，與BD3900共孵育的S.mutans的生物膜形成量顯著降低(67.1%)。由此可見，BD3900可以有效地遏制S.mutans的成膜量，具有潛在的抗致齲益生功效。

Figure 7 Antagonstic activity ofS.salivariusBD3900 on the formation ofS.mutansbiolm

3 結(jié)論

BD3900是一株新近分離自健康人體口腔的唾液鏈球菌，其最適的培養(yǎng)介質(zhì)與培養(yǎng)溫度分別為：M17培養(yǎng)基、42 ℃。該菌株在血平板上呈γ-型溶血，即無溶血圈出現(xiàn)，表明BD3900侵染宿主的風(fēng)險(xiǎn)較低。同時(shí)，該菌具有較強(qiáng)的疏水作用和靜電作用，具有較好的口腔黏膜黏附能力。該菌對溶菌酶有一定耐受性，保證其在口腔環(huán)境中具有一定的存活性能。

BD3900具有較強(qiáng)的自聚能力，可以避免在攝食后被唾液或者食物沖刷，提高其在口腔的定殖能力；與S.mutans共培養(yǎng)時(shí)，BD3900表現(xiàn)出與S.mutans強(qiáng)烈的共聚作用，通過共聚體的形成，增加S.mutans隨食物、唾液從口腔移除的幾率；同時(shí)，BD3900 可以有效降低S.mutans生物膜的生成量，從而減少S.mutans的定殖作用與牙菌斑的形成，進(jìn)而達(dá)到防齲、治齲的目的。因此，BD3900具有作為口腔益生菌應(yīng)用的潛力。

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