喻銘佳YU Ming-jia 索化夷 - 李 鍵 謝 婕 趙 欣 騫 宇 丁陽平 - 張 玉

(1. 西南大學食品科學學院，重慶 400715；2. 西南大學重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715；3. 重慶第二師范學院功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 400067；4. 西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041)

牦牛乳富含蛋白質、必需氨基酸、多不飽和脂肪酸、維生素和多種微量元素[1]。牦牛乳發(fā)酵制得的牦牛酸乳具有調節(jié)人體腸道菌群、促進腸道蠕動，調節(jié)血壓、降膽固醇等保健功效[2-3]。目前，牦牛酸乳的生產以自然發(fā)酵為主，產品品質不穩(wěn)定，篩選牦牛酸乳發(fā)酵菌種、開發(fā)穩(wěn)定的牦牛酸乳發(fā)酵劑以實現(xiàn)產品質量標準化是當前需要解決的問題。

乳酸菌和酵母菌是傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳的優(yōu)勢菌種[4-5]。已有學者就酸乳中乳酸菌和酵母菌共生特性展開了一些研究。余蘭等[6]在駝乳發(fā)酵中添加東方伊莎酵母菌，發(fā)現(xiàn)東方伊莎酵母菌能促進乳酸菌的生長，提高酸乳的活菌數(shù)；Cheirsilp等[7]在牛乳中共同培養(yǎng)乳酸菌與酵母菌，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖，為酵母菌提供碳源；Mendes等[8]采用釀酒酵母和保加利亞乳桿菌共生發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母通過酒精發(fā)酵增加了CO2濃度并產生丙氨酸，從而促進保加利亞乳桿菌生長；呂雪峰等[9]研究發(fā)現(xiàn)，有釀酒酵母存在時，乳酸菌能產生更多乳酸，促進酸乳凝乳；田裕春等[10]研究發(fā)現(xiàn)，加入酵母菌組合發(fā)酵的酸乳硬度和黏聚性上升，酸乳風味物質的含量提高；閆彬等[11]發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)明串珠菌和克勒克酵母菌有利于甲酸、乙酸等風味物質的產生。綜上，酸乳中的乳酸菌和酵母菌具有一定的共生特性，但乳酸菌和酵母菌在牦牛酸乳發(fā)酵過程中發(fā)揮的作用，目前還未見報道。

本研究擬以牦牛乳粉為原料，以采集到的牦牛酸乳為發(fā)酵劑，在牦牛乳傳統(tǒng)發(fā)酵過程中用放線菌酮和青鏈霉素分別抑制酵母菌和乳酸菌活性，通過對牦牛酸乳滴定酸度、乙醇含量、質構、有機酸等理化指標的測定，比較牦牛酸乳在正常發(fā)酵、抑制酵母菌發(fā)酵、抑制乳酸菌發(fā)酵3種發(fā)酵方式下的品質差異，總結出乳酸菌、酵母菌分別對傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳品質形成的影響，為牦牛酸乳發(fā)酵劑的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

發(fā)酵劑：采自云南香格里拉的傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳；

牦牛乳粉：紅原三千三乳業(yè)有限公司；

青鏈霉素混合液(100×)：北京索萊寶生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，河北四友卓越科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

酸度計：PHS-3C型，成都世紀方舟科技有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

高效液相色譜柱：Agilent XDB-C18型，安捷倫科技有限公司；

質構儀：TA-XT2i型，英國SMS公司；

氣相色譜質譜聯(lián)用儀：Trace DSQ型，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳制作工藝 以牦牛乳粉為原料，牦牛酸乳為發(fā)酵劑發(fā)酵牦牛酸乳。牦牛乳粉按120 g/L與水充分混勻，得牦牛復原乳，殺菌條件95 ℃，5 min[12]，牦牛酸乳接種量5%，前發(fā)酵條件37 ℃，10 h，后發(fā)酵條件4 ℃，24 h。

1.2.2 乳酸菌、酵母菌抑制試驗 在牦牛酸乳發(fā)酵過程中，分別加入放線菌酮和青鏈霉素抑制酵母菌和乳酸菌的生長。分別取0.001，0.002，0.004，0.006 g放線菌酮和稀釋100倍的青鏈霉素混合液0.1，0.3，0.5，0.7 mL溶解于100 mL原料乳中，按1.2.1發(fā)酵10 h，分別對酸乳中的酵母菌和乳酸菌計數(shù)[13-14]，分別按式(1)、(2)計算酵母菌和乳酸菌的抑制率。

(1)

(2)

式中：

I1——酵母菌抑制率，%；

I2——乳酸菌抑制率，%；

A0——正常發(fā)酵酸乳的酵母菌數(shù)，CFU/mL；

A1——添加放線菌酮酸乳的酵母菌數(shù)，CFU/mL；

A2——正常發(fā)酵酸乳的乳酸菌數(shù)，CFU/mL；

A3——添加青鏈霉素酸乳的乳酸菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.3 取樣方法 將3種發(fā)酵方式(正常發(fā)酵、抑制酵母菌發(fā)酵、抑制乳酸菌發(fā)酵)的牦牛酸乳按不同時間點取樣進行各項指標的測定。

1.2.4 滴定酸度的測定 稱取10 g酸乳于150 mL錐形瓶中，與20 mL新煮沸冷卻至室溫的水混勻，根據(jù)文獻[15]測定滴定酸度。

1.2.5 乙醇含量測定 稱取25 g酸乳至1 000 mL蒸餾燒瓶中，根據(jù)文獻[16]測定乙醇含量。

1.2.6 質構特性 選用A/BE探頭對酸乳進行硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)測定[17]。探頭直徑為35 mm壓力盤，下降速度為10 mm/s，測試和提升速度為1 mm/s，測試深度為發(fā)酵酸乳總高度的70%，質構儀數(shù)據(jù)采集速率為200脈沖數(shù)/秒。

1.2.7 氨基酸態(tài)氮的測定 稱取2 g酸乳于燒杯中，加入18 mL 蒸餾水，超聲5 min。根據(jù)文獻[18]測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.2.8 有機酸的測定 根據(jù)文獻[19]，修改如下：取5 g酸乳于50 mL容量瓶中，超純水定容，超聲5 min，搖勻，過濾，吸取濾液過0.45 μm濾膜，待測。

色譜條件：Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5-micron)；流動相為甲醇和磷酸二氫銨溶液；流速為甲醇0.03 mL/min，磷酸二氫銨溶液0.57 mL/min；檢測波長220 nm；柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

1.2.9 維生素B1含量的測定 參照文獻[20]。

1.2.10 維生素B2含量的測定 參照文獻[21]。

1.2.11 揮發(fā)性風味物質的測定 取5 g酸乳樣品于頂空進樣瓶中，加入2 g氯化鈉混勻，密封，70 ℃恒溫水浴10 min，鹽析45 min，參照文獻[22]進行固相微萃取處理。

(1) 色譜條件：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱初溫40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持6 min[23]。

(2) 質譜條件：檢測器電壓830 eV，溶劑延遲時間1 min；質量掃描范圍m/z33～440[24]。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理 對樣品揮發(fā)性化合物的氣相色譜-質譜聯(lián)用圖譜進行計算機和人工識譜，同時將每個峰與NIST library和Wiley library檢索譜庫進行匹配和比較，以相似度>800(最大值1 000)的原則作為鑒定結果。采用校正面積歸一法得出各成分的峰面積。主成分分析采用SPSS 17.0軟件，作圖采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 酵母菌和乳酸菌的抑制率

正常發(fā)酵酸乳的酵母菌菌落數(shù)為3.2×106CFU/mL，添加0.004 g/100 mL放線菌酮酸乳的酵母菌菌落數(shù)為2.0×105CFU/mL(表1)，酵母菌抑制率為93.8%，該濃度下放線菌酮對乳酸菌無明顯抑制作用；正常發(fā)酵酸乳的乳酸菌菌落數(shù)為3.0×107CFU/mL，添加0.5 mL/100 mL青鏈霉素酸乳的乳酸菌菌落數(shù)為2.4×106CFU/mL(表2)，乳酸菌抑制率為92%，該濃度下青鏈霉素對酵母菌無明顯抑制作用。因此選擇0.004 g/100 mL的放線菌酮抑制酵母菌，0.5 mL/100 mL的青鏈霉素抑制乳酸菌。

2.2 不同方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳滴定酸度的變化

由圖1可知，牦牛酸乳的滴定酸度在發(fā)酵0～10 h上升迅速，10 h后上升緩慢。這是因為前發(fā)酵期微生物生長迅速，分解乳糖產生乳酸等酸性物質，因此酸乳酸度急劇上升；過高的酸度和低溫使微生物生長受到抑制，乳糖的分解隨之減緩，所以發(fā)酵后期酸乳酸度趨于穩(wěn)定。對比3種發(fā)酵方式酸乳酸度的變化，正常發(fā)酵和抑制酵母菌發(fā)酵的牦牛酸乳滴定酸度由23 °T增加至140 °T，而抑制乳酸菌發(fā)酵后，酸乳僅由23 °T增加至48 °T，酸度明顯降低。可見乳酸菌是提高牦牛酸乳酸度的主要微生物。酸度較高是牦牛酸乳區(qū)別于普通酸乳的一個特征[25]，可能與傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中含有的一些耐酸性菌(如嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌)在較低pH下仍能繼續(xù)代謝產生有機酸[26]有關。

Figure 1 Titratable acidity changeof different ways of fermentation yak yogurtduring the process of fermentation

2.3 不同方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳乙醇含量的變化

牦牛酸乳特有的醇香可能來自于酸乳發(fā)酵過程中產生的乙醇[27]。由圖2可知，3種發(fā)酵方式的牦牛酸乳乙醇含量均有所上升，發(fā)酵至終點時，正常發(fā)酵、抑制乳酸菌、抑制酵母菌發(fā)酵的牦牛酸乳乙醇含量分別為3.8，2.8，1.2 g/kg，可見抑制酵母菌發(fā)酵后乙醇含量明顯降低，說明牦牛酸乳中的乙醇主要來源于酵母菌發(fā)酵。抑制乳酸菌發(fā)酵后乙醇含量略低于正常發(fā)酵，可能是乳酸菌為酵母菌乙醇發(fā)酵提供碳源，從而促進酵母菌產生更多乙醇。

Figure 2 The alcohol content of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

2.4 不同方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳質構特性的變化

抑制乳酸菌發(fā)酵的酸乳在整個發(fā)酵過程中均未凝乳，因此未對其進行質構測定。由圖3可知，抑制酵母菌發(fā)酵和正常發(fā)酵的酸乳在硬度、稠度、黏聚性和黏性指數(shù)上均呈相同的變化趨勢，說明乳酸菌對牦牛酸乳的質構形成起主要作用。抑制乳酸菌發(fā)酵后，牦牛酸乳的pH達不到酪蛋白的等電點，凝膠結構無法形成。同時，乳酸菌分泌的胞外多糖可增加酸乳的黏稠度，強化酸乳咀嚼性和黏彈性[28-29]。從圖3可以看出，抑制酵母菌后酸乳在各項質構指標上均有所下降，說明酵母菌對牦牛酸乳質構的形成也有一定的促進作用。研究[30]表明，酵母菌有氧呼吸會消耗牦牛乳中溶解的氧氣，加快乳酸菌的產酸速度，增加酸乳的硬度。因此抑制酵母菌發(fā)酵后，牦牛酸乳硬度降低。

2.5 不同方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮含量反映了酸乳中氨基酸和小分子肽的總體水平，用于評價酸乳的發(fā)酵程度。由圖4可知，牦牛酸乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量增加，抑制酵母菌發(fā)酵酸乳的氨基酸態(tài)氮含量變化與正常發(fā)酵基本一致，而抑制乳酸菌發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量僅為正常發(fā)酵的30%。由此可見，乳酸菌是影響牦牛酸乳氨基酸態(tài)氮生成的主要因素。這可能與乳酸菌能產生更多蛋白酶，促進酸乳氨基酸和肽的生成有關。發(fā)酵前期，隨著乳酸菌的生長氨基酸態(tài)氮含量快速增加；發(fā)酵后期，氨基酸態(tài)氮含量增長緩慢，可能是菌體的生長會消耗部分氨基酸[31]，使氨基酸態(tài)氮的生成速率降低。

Figure 4 The nitrogen amino acid changes of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

2.6 不同方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳有機酸的變化

有機酸是酸乳風味的重要來源。由圖5可知，乳酸與滴定酸度的變化基本一致，檸檬酸含量呈先增后減的趨勢，整個發(fā)酵過程中乙酸含量呈下降趨勢。這是因為乳酸是酸乳的主體酸，檸檬酸和乙酸是許多風味物質的前體，在發(fā)酵后期檸檬酸和乙酸被不斷轉化為雙乙酰、乙酸乙酯等風味物質[32]。抑制乳酸菌發(fā)酵的酸乳在整個發(fā)酵過程中幾乎不產乳酸、檸檬酸，表明牦牛酸乳中乳酸和檸檬酸主要由乳酸菌合成。3種方式發(fā)酵過程中乙酸的含量都有所減少，但無明顯差異。抑制酵母菌發(fā)酵的牦牛酸乳與正常發(fā)酵相比，乳酸含量略有降低，可能是酵母菌對乳酸菌產乳酸具有一定促進作用[33]。

2.7 不同方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳維生素VB1、VB2的變化

由圖6可知，正常發(fā)酵牦牛酸乳中的VB1、VB2含量都在增加，說明發(fā)酵酸乳能豐富牦牛乳中VB1和VB2的含量。抑制酵母菌后酸乳的VB1含量變化不大，而抑制乳酸菌后VB1急劇下降，說明牦牛酸乳中VB1的合成主要與乳酸菌有關。抑制乳酸菌后，酸乳VB1合成速率不僅降低，同時見光分解和菌體代謝消耗會加速VB1的損失。由圖6(b)可知，3種發(fā)酵方式的酸乳VB2含量均在上升，但抑制乳酸菌、酵母菌后酸乳VB2含量均低于正常發(fā)酵酸乳，其中抑制酵母菌后酸乳的VB2含量最低，說明乳酸菌、酵母菌的代謝活動均能產生VB2，但由于酵母菌自身含有豐富的VB2[34]，抑制酵母菌后酸乳VB2含量損失更大。

2.8 不同發(fā)酵方式發(fā)酵過程中牦牛酸乳揮發(fā)性風味物質的變化

運用主成分分析法對牦牛酸乳中風味物質進行分析，可將多種風味物質轉化為幾個綜合性指標(即主成分)。通過比較3種發(fā)酵方式下牦牛酸乳主成分含量的變化差異，可以更直觀地總結出乳酸菌、酵母菌對牦牛酸乳風味的影響。根據(jù)廉桂芳等[35]的研究結果，牦牛酸乳主體風味物質可提取5個主成分，其中第一主成分為乙醛、乙醇、乙酸乙酯、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、丁酸乙酯；第二主成分為3-羥基2-丁酮、3-甲基丁酸、己酸、2-壬酮；第三主成分為乙醛、丙酮、2-庚酮；第四主成分為乙酸；第五主成分為2,3-丁二酮。

Figure 5 The organic acids changes of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

3種發(fā)酵方式牦牛酸乳發(fā)酵過程中主成分含量的變化見表3。抑制乳酸菌發(fā)酵的酸乳第一主成分含量變化與正常發(fā)酵基本一致，而抑制酵母菌發(fā)酵的酸乳第一主成分含量逐漸降低。在第二、三、四、五主成分含量上，抑制酵母菌的酸乳與正常發(fā)酵酸乳有相同變化趨勢，而抑制乳酸菌發(fā)酵的酸乳含量逐漸降低。因此，牦牛酸乳中3-羥基2-丁酮、2，3-丁二酮、2-庚酮、2-壬酮、丙酮、3-甲基丁酸、己酸、乙酸、乙醛的合成與乳酸菌有關，其中酮類物質賦予酸乳奶香，酸類物質賦予酸乳清爽的口感。乙醛是酸乳的主要風味物質，其含量與乳酸菌和酵母菌的代謝有關，乳酸菌能利用蘇氨酸產生乙醛，而酵母菌的代謝產物可能促進酸乳中乙醛含量的升高，與Gadaga等[36]的研究結果相一致。此外，牦牛酸乳中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙醇、3-甲基丁醇、2-甲基丁醇的合成與酵母菌有關，其中乙醇及其它醇類物質可能來源于酵母菌對乳糖、氨基酸和脂肪的發(fā)酵作用[37]。酸乳中乙醇與脂肪酸反應可生成乙酸乙酯等酯類[22]，使酸乳具有一定的果香。雷華威等[38]發(fā)現(xiàn)市售酸乳主要風味物質為酮類和酸類，不含醇類和酯類物質。因此，酵母菌發(fā)酵產生的醇、酯增加了酸乳的醇香和果香，與酸味搭配實現(xiàn)了牦牛酸乳獨特的風味。

Figure 6 The Vitamin B changes of different ways of fermentation yak yogurt during the process of fermentation

? 樣品編號1～5表示正常發(fā)酵2，6，10，22，34 h；編號6～10表示抑制酵母菌發(fā)酵2，6，10，22，34 h；編號11～15表示抑制乳酸菌發(fā)酵2，6，10，22，34 h。

3 結論

通過比較3種發(fā)酵方式牦牛酸乳品質相關指標的差異，得出乳酸菌和酵母菌發(fā)酵對牦牛酸乳的品質形成均起到關鍵作用。

(1) 乳酸菌在牦牛酸乳發(fā)酵過程中起主導作用。乳酸菌發(fā)酵產酸使酸乳凝乳，同時代謝產生氨基酸態(tài)氮和VB1，提高了酸乳的營養(yǎng)價值。乳酸菌發(fā)酵產生的有機酸和酮類物質，使酸乳呈現(xiàn)出典型的酸味和奶香。

(2) 酵母菌有助于牦牛酸乳獨特風味的形成。酵母菌發(fā)酵主要產生醇和酯類物質，醇類賦予牦牛酸乳典型的醇香，乙酸乙酯和丁酸乙酯使牦牛酸乳呈現(xiàn)甜潤的水果香氣。此外，酵母菌的存在提高了牦牛酸乳的VB2含量。

(3) 乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵可提高牦牛酸乳的品質，發(fā)酵過程中，乳酸菌促進酵母菌產乙醇，酵母菌促進乳酸菌產乳酸，促進質構的形成。二者混合發(fā)酵使酸乳的風味成分更加復雜，酸乳呈現(xiàn)特有的感官風味。該研究的結果可為開發(fā)乳酸菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵劑、生產高品質的牦牛酸乳提供理論依據(jù)，但牦牛酸乳發(fā)酵劑的研發(fā)及其在生產中的應用尚需進一步研究。

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