蔣棟磊JIANG Dong-lei 劉 延 葛攀瑋 - 吳滿剛 - 葛慶豐 - 方維明 -

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

中國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，淡水魚主要依靠微凍保鮮技術(shù)保存[1]，但部分耐冷菌株增殖導(dǎo)致魚類腐敗變質(zhì)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2]。其中嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是主要腐敗菌之一[3]。大量研究表明嗜水氣單胞菌腐敗能力與其毒力因子密切相關(guān)[4-5]，其中脂多糖(LPS)由多糖鏈與類脂組成，具有高毒性和免疫學(xué)活性[6]。

細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本組成和功能單元[7]。細(xì)胞模型利用細(xì)胞的高敏感性，迅速識(shí)別外界環(huán)境變化，具有主動(dòng)、真實(shí)、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)[8]。根據(jù)細(xì)胞生理變化和細(xì)胞力學(xué)的特殊性質(zhì)，可將細(xì)胞用于對(duì)危害物的檢測(cè)和評(píng)價(jià)[9-10]。本試驗(yàn)選用的巨噬細(xì)胞Ana-1對(duì)外源物應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng)，具有充足的研究基礎(chǔ)， Wang Hui等[11]和WANG Xue-mei等[12]分別利用巨噬細(xì)胞Ana-1細(xì)胞模型研究了弓形蟲誘導(dǎo)HMGB1釋放作用，以及LPS對(duì)細(xì)胞的毒性及損傷作用。

本試驗(yàn)提取了嗜水氣單胞菌菌體表面的脂多糖(LPS)，并創(chuàng)新地利用巨噬細(xì)胞Ana-1模型對(duì)其毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。菌體表面LPS進(jìn)行提取純化采用改良的熱酚水法[13-14]、酶解法[15]與醇沉法[16]，并測(cè)算LPS產(chǎn)率，檢測(cè)所得純化LPS樣品中蛋白質(zhì)與核酸含量，利用SDS-PAGE電泳分析純度。建立巨噬細(xì)胞Ana-1模型，通過細(xì)胞活力、胞內(nèi)Ca2+水平變化以及電鏡觀察，比較純化LPS樣品與LPS標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)巨噬細(xì)胞Ana-1的損傷情況，判定純化LPS樣品的毒性和生物活性，為后續(xù)提取與檢測(cè)方法的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

嗜水氣單胞菌菌株(Aeromonashydrophilasubsp.hydrophilaATCC 7966 chromosome)： 由揚(yáng)州某市場(chǎng)的草魚樣品分離得到；

巨噬細(xì)胞Ana-1：中科院上海細(xì)胞庫；

LPS標(biāo)準(zhǔn)品、DNase I、RNase A、蛋白酶K：美國(guó)Sigma公司；

胰酶消化液、Fluo-4 AM (5 mmol/L)鈣離子熒光探針、CCK-8試劑盒：碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

單人雙面凈化工作臺(tái)：SW-CJ-1F型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

高壓蒸氣滅菌鍋：SX-500型，日本TOMMY公司；

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Sorvall ST 16R型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

冷凍干燥機(jī)：Alpha 1-2LD PoLus型，德國(guó)Martin Christ公司；

CO2恒溫培養(yǎng)箱：3111型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

熒光顯微鏡：IX51型，日本Olympus公司；

酶標(biāo)儀：Infinite 200 PRO型，瑞士Tecan公司；

核酸蛋白測(cè)定儀：BioPhotometer plus型，德國(guó)Eppendorf公司；

場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡：S-4800型，日本日立公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌體培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[17]。將凍存的嗜水氣單胞菌菌株置室溫下解凍，劃線于AHM瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接入LB培養(yǎng)基，28 ℃搖床培養(yǎng)12 h后，8 000 r/min 離心10 min，收集菌體，沉淀依次用生理鹽水與無菌蒸餾水洗滌1次后，收集沉淀稱重，用3倍質(zhì)量無菌蒸餾水重懸(即1 g菌體加入3 mL蒸餾水)，得到菌懸液。

1.2.2 LPS粗提取 參照文獻(xiàn)[13]。菌懸液反復(fù)凍融5次后，與等體積90%苯酚混合，68 ℃恒溫水浴振蕩1 h，冰浴至4 ℃，4 000 r/min冷凍離心20 min。收集上清，下層酚相加等體積無菌蒸餾水重復(fù)洗滌1次，合并2次上清于透析袋中，蒸餾水透析至FeCl3檢測(cè)無酚試劑反應(yīng)出現(xiàn)。透析所得溶液經(jīng)真空冷凍干燥處理24 h，即制得 LPS粗樣。

1.2.3 LPS的純化 參照文獻(xiàn)[14～16]的方法，并加以改良。10 mL Tris-HCl (100 mmol/L，pH 8.0)溶解LPS粗樣，加終濃度20 mg/mL DNase I與10 mg/mL RNase A，37 ℃酶解2 h后，加終濃度20 mg/mL蛋白酶K，57 ℃處理1 h，趁熱加入5 mL水飽和苯酚，混勻，4 000 r/min離心30 min，吸取上清于透析袋中，蒸餾水透析48 h后，溶液真空冷凍干燥24 h。凍干產(chǎn)物置于氯仿/甲醇(體積比2∶1)混合液中充分混勻，12 000 r/min離心20 min，棄上清并晾干沉淀。10 mL 蒸餾水溶解沉淀后真空冷凍干燥24 h，即得到純化LPS樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 LPS中物質(zhì)的測(cè)定

(1) 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：5 mL蒸餾水溶解純化LPS樣品，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)含量，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，讀數(shù)穩(wěn)定后讀取結(jié)果，重復(fù)3次。

(2) 核酸含量測(cè)定：5 mL蒸餾水溶解純化LPS樣品，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)樣品中核酸含量，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，讀數(shù)穩(wěn)定后讀取結(jié)果，重復(fù)3次。

1.2.5 LPS純度分析 采用 SDS-PAGE 法，濃縮膠 3%，分離膠 10%，上樣電泳后銀染色，進(jìn)行純度分析。

1.2.6 LPS樣品對(duì)Ana-1細(xì)胞影響檢測(cè)

(1) CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力：于1 000 r/min離心4 min，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移至96孔板中(約5 000個(gè)/孔)于37 ℃培養(yǎng)12 h。分別加入終濃度為5 μmol/L的LPS標(biāo)準(zhǔn)品與純化LPS樣品，并設(shè)置不含LPS的空白對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。37 ℃處理3 h后每孔加入培養(yǎng)液總體積10%(10 μL)的CCK-8，37 ℃孵育1 h，測(cè)定其在450 nm處吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算細(xì)胞活力。

(1)

式中：

C—— 細(xì)胞活力，%；

A1——加藥組450 nm處吸光度；

A2——空白對(duì)照組450 nm處吸光度。

(2) 細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的檢測(cè)：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移至24孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，用0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入終濃度3 μmol/L的Fluo-4 AM探針，37 ℃培養(yǎng)1 h后，用0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞3次，再孵育30 min以確保細(xì)胞內(nèi)Fluo-4 AM轉(zhuǎn)變?yōu)镕luo-4。隨后分別加入終濃度為5 μg/mL的LPS標(biāo)準(zhǔn)品與純化LPS樣品，37 ℃處理3 h，每組3個(gè)平行，空白對(duì)照組不添加LPS。使用IX51熒光顯微鏡觀察拍照，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為455 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm[18]。

(3) Ana-1細(xì)胞損傷的電鏡觀察：將Ana-1細(xì)胞經(jīng)終濃度為5 μg/mL的LPS處理3 h后，收集細(xì)胞，瓊脂包裹切片加入2.5%的戊二醛中固定4 h，保存于4 ℃冰箱中。然后用0.1 mol/L的PBS清洗3次，每次15 min。按照50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇梯度脫水，每次15 min，然后用含無水硫酸鈉的100%乙醇再脫水15 min。將樣品放入CO2臨界點(diǎn)干燥45 min，取出黏貼在樣板上準(zhǔn)備鍍膜，利用S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS提取與純化結(jié)果

1.2 L的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集菌體濕重為6.22 g，提取純化后得到LPS共76.1 mg， LPS平均產(chǎn)率為1.22%。測(cè)得的蛋白濃度為232.87 mg/L，核酸濃度為120.51 mg/L，計(jì)算得出純化后LPS中蛋白質(zhì)占1.53%，核酸占0.79%，提取純度較高，為下一步LPS毒性及生物活性檢測(cè)減少干擾。

2.2 LPS純度

1. LPS標(biāo)準(zhǔn)品 2. 純化LPS樣品

由圖1可知，純化LPS樣品的主要條帶清晰，大部分條帶位置與標(biāo)準(zhǔn)品條帶位置相同，均可以判定是LPS條帶，說明純化LPS結(jié)構(gòu)完整，純度較高。然而，泳道2頂端存在雜帶，說明純化LPS樣品中仍有大分子雜質(zhì)殘留，結(jié)合2.1結(jié)果分析，雜帶可能是殘留蛋白質(zhì)。

2.3 LPS對(duì)Ana-1細(xì)胞活力的影響

由圖2可知，當(dāng)終濃度為5 μg/mL時(shí)，LPS標(biāo)準(zhǔn)品與純化LPS樣品均能夠顯著抑制Ana-1細(xì)胞的活力。與空白組相比，LPS標(biāo)準(zhǔn)品組細(xì)胞活力降低了24.83%，純化LPS樣品組細(xì)胞活力降低了21.20%。與純化LPS樣品比較，LPS標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)Ana-1細(xì)胞的活力抑制效果更強(qiáng)，但兩組間無顯著性差異(P>0.05)。

不同字母表示組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)

2.4 LPS對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響

試驗(yàn)所使用的Fluo-4 AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，F(xiàn)luo-4 AM進(jìn)入細(xì)胞后被酶剪切形成Fluo-4，與胞內(nèi)Ca2+結(jié)合，產(chǎn)生熒光[19]。

圖3顯示裝載了Fluo-4熒光探針后，Ana-1在熒光顯微鏡下的圖像。圖3(a)為只裝載探針的空白對(duì)照組，熒光強(qiáng)度弱；圖3(b)與3(c)分別為加入LPS標(biāo)準(zhǔn)品和純化LPS樣品處理的Ana-1細(xì)胞，從圖中可以看到較明顯的熒光。結(jié)合數(shù)據(jù)分析，與空白對(duì)照組比較，LPS標(biāo)準(zhǔn)品組相對(duì)熒光強(qiáng)度為1.92±0.12，純化LPS樣品組為1.67±0.19。結(jié)果表明，經(jīng)LPS處理后，Ana-1細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+水平升高，且LPS標(biāo)準(zhǔn)品的作用強(qiáng)于純化LPS樣品的，但不存在顯著性差異(P>0.05)。

2.5 LPS對(duì)Ana-1細(xì)胞損傷的電鏡觀察

圖3 LPS(5 μg/mL)對(duì)巨噬細(xì)胞Ana-1胞內(nèi)Ca2+水平的影響

圖4 LPS對(duì)Ana-1細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖4(a)可知，放大6 000倍觀察正常Ana-1細(xì)胞形態(tài)飽滿，表面光滑有細(xì)微絨毛狀結(jié)構(gòu)。圖4(b)經(jīng)5 μg/mL LPS標(biāo)準(zhǔn)品處理3 h后8 000倍觀察，Ana-1細(xì)胞膜變得粗糙并脫落，細(xì)胞表面出現(xiàn)空洞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)露出，形態(tài)已不完整，證明了細(xì)胞發(fā)生了較嚴(yán)重的破損。圖4(c)為掃描電鏡放大8 000 倍觀察到的經(jīng)5 μg/mL純化LPS樣品處理3 h后的Ana-1細(xì)胞，細(xì)胞同樣表現(xiàn)為破損，表面有明顯的空洞，細(xì)胞膜變得粗糙。說明LPS可以導(dǎo)致小鼠巨噬細(xì)胞Ana-1的損傷；純化LPS樣品與LPS標(biāo)準(zhǔn)品造成的損傷類似，但純化LPS樣品的毒性與生物活性相對(duì)較高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)成功制得了純化LPS樣品，雜質(zhì)含量少，與LPS標(biāo)準(zhǔn)品相比，對(duì)Ana-1細(xì)胞造成損傷無顯著性差異(P>0.05)。說明改良后的熱酚水法及酶解法、氯仿/甲醇沉淀法能夠較完好地提取、純化菌體表面LPS，同時(shí)表明巨噬細(xì)胞Ana-1模型用于評(píng)價(jià)LPS的毒性與生物活性具有可行性，為L(zhǎng)PS提取、檢測(cè)方法的后續(xù)開發(fā)提供思路與技術(shù)支持。

與宋宏新等[15]、劉紅亮等[16]的結(jié)果相比，本試驗(yàn)LPS產(chǎn)率更高，蛋白質(zhì)含量更低，但純化LPS樣品中仍有0.79%的核酸殘留，與宋宏新等[15]的研究結(jié)果相似。LPS能夠顯著抑制Ana-1細(xì)胞活力并提高胞內(nèi)Ca2+濃度，同時(shí)經(jīng)掃描電鏡觀察LPS對(duì)Ana-1細(xì)胞形態(tài)造成了一定程度的損傷，證實(shí)了Wang Xue-mei等[14]的相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果。

為了進(jìn)一步優(yōu)化LPS提取、純化方法，能否通過增加DNase I與RNase A酶濃度，延長(zhǎng)消化時(shí)間來減少核酸殘留有待深入研究。而巨噬細(xì)胞Ana-1模型的細(xì)胞活力，胞內(nèi)Ca2+濃度以及細(xì)胞形態(tài)變化只能說明LPS對(duì)細(xì)胞造成損傷，具體損傷機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究LPS對(duì)細(xì)胞脫顆粒、白介素的分泌等影響，探明損傷機(jī)制。

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