潘姝璇PAN Shu-xuan 王嘉怡 - 陳 建 n 夏 陳 鄧俊琳 - 蒲 彪
(1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,四川 成都 610066;2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川 雅安 625014;3. 四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院,四川 成都 610041)
發(fā)芽糙米(germinated brown rice,GBR)是糙米在一定的濕度和溫度下發(fā)芽至一定芽長(一般為0.5~1.0 mm),所得到的由幼芽和帶糠層的胚乳組成的糙米制品[1]。人們在養(yǎng)身的過程中發(fā)現(xiàn)糙米能產(chǎn)生較強(qiáng)的飽腹感,且對身體健康有很多益處[2]。但糙米口感粗糙。通過發(fā)芽處理后的糙米經(jīng)歷了種子萌發(fā)階段激活了大量的內(nèi)源酶,酶解作用導(dǎo)致糙米中多糖等活性物質(zhì)的含量、結(jié)構(gòu)、種類及其生物活性都有所改變或增強(qiáng),不僅口感得到了一定程度的改善,而且富含許多生物活性物質(zhì),如γ-氨基丁酸、菲汀、谷維素、神經(jīng)酰胺、阿魏酸、多糖等。因此發(fā)芽糙米營養(yǎng)物質(zhì)豐富,具有特殊的營養(yǎng)功效[3]。
很多報道[4-7]表明植物中的多糖對自由基有一定的抗氧化活性,可以作為新的潛在抗氧化劑進(jìn)行研究。氧化是許多生物能量生產(chǎn)的基本過程,但是過量的自由基在體內(nèi)會產(chǎn)生一些氧化反應(yīng)過程不僅與脂質(zhì)過氧化作用密切相關(guān),還會引起疾病。因此,對高效的抗氧化劑的開發(fā)并用于保護(hù)機(jī)體免受自由基的破壞是十分必要的[8]。熱水浸提法為傳統(tǒng)且最為常用的水溶性多糖制備方法,但耗時長、效率低[9]。微波輔助提取法是利用微波對物質(zhì)進(jìn)行萃取的一種新興技術(shù),具有耗時短、效率高、節(jié)省溶劑、最終產(chǎn)生的物質(zhì)產(chǎn)量高而不改變其性質(zhì)等優(yōu)勢[10-12]。作為一種替代傳統(tǒng)方法的潛在方法,該方法受到越來越多的關(guān)注[13-14]。
目前,在發(fā)芽糙米中的功能成分的研究報道中對多糖的研究甚少,劉曉飛等[15]曾采用超聲波輔助雙水相法萃取對發(fā)芽糙米多糖的工藝優(yōu)化及其抗氧化活性進(jìn)行過研究。本試驗擬采用微波輔助法對發(fā)芽糙米多糖(germinated brown rice polysaccharides, GBRP)進(jìn)行提取,用響應(yīng)面試驗對其工藝進(jìn)行優(yōu)化,并研究GBRP的抗氧化活性,旨在為發(fā)芽糙米的增值利用和新型多糖的制備提供依據(jù)。
發(fā)芽糙米:由東北產(chǎn)糙米經(jīng)某谷物公司生產(chǎn)車間1 000 kg 級大生產(chǎn)制備;
石油醚(35~60 ℃)、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫:分析純,成都市科龍化工試劑廠;
葡萄糖:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;
苯酚:分析純,成都市萇征化玻有限公司;
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) :梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;
中藥粉碎機(jī):FY-250型,永康市久品工貿(mào)有限公司;
微波科學(xué)實驗爐:ORW08S-3H型,南京奧潤微波科技有限公司;
掃描型紫外可見分光光度計:UV-6100型,上海美普達(dá)儀器有限公司;
高速冷凍離心機(jī):Gentrifuge 5180R型,德國Eppendorf公司;
電子天平:FA2104型,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。
將50 kg發(fā)芽糙米用碾米機(jī)去除胚乳(即分離除去大量淀粉)得到5.5 kg發(fā)芽糙米米糠(含有約10%碎米)。取該米糠1.0 kg浸泡于5 L 石油醚中并攪拌4 h脫脂處理后,過濾,置于通風(fēng)櫥風(fēng)干,粉碎,過60目篩,密封保存,備用。
采用苯酚-硫酸法[16]。
1.4.1 提取工藝 稱取1.0 g前處理的發(fā)芽糙米米糠,在40 ℃ 下用去離子水按一定的液料比混合后,置于微波科學(xué)實驗爐,設(shè)定微波功率,采用不同的液料比、微波提取時間、微波功率、提取次數(shù)(具體數(shù)據(jù)設(shè)計見1.4.1)4個因素進(jìn)行微波輔助提取。提取完后將混合物離心(8 000 r/min,10 min),取5 mL上清液加25 mL乙醇沉淀。醇沉之后再離心(8 000 r/min,10 min),去上清液,將沉淀冷凍干燥后,復(fù)溶于5 mL去離子水中,采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。
1.4.2 單因素試驗 參考文獻(xiàn)[17~18]的條件,以去離子水為提取劑,分別就微波功率、微波時間、液料比和微波次數(shù)做單因素試驗。
(1) 微波功率:固定微波溫度40 ℃,微波時間4 min,液料比20∶1 (mL/g),提取次數(shù)2次,采用以上選出的結(jié)果,考察不同微波功率200,300,400,500,600,700 W對GBRP提取率的影響。
(2) 微波時間:固定微波溫度40 ℃,液料比20∶1(mL/g),提取次數(shù)2次,采用以上選出的結(jié)果,考察不同微波時間2,3,4,5,6,7 min對GBRP提取率的影響。
(3) 液料比:固定微波溫度40 ℃,提取次數(shù)2次,采用以上選出的結(jié)果,考察不同液料比10∶1,15∶1,20∶1,25∶1,30∶1,35∶1 (mL/g)對GBRP提取率的影響。
(4) 提取次數(shù):其他條件采用以上選出的結(jié)果,考察不同提取次數(shù)1,2,3,4,5次對GBRP提取率的影響。
1.5.1 GBRP溶液的配制 稱取50 g發(fā)芽糙米米糠,按照試驗得到的最優(yōu)提取條件提取GBRP,醇沉后冷凍干燥得GBRP固體,將其配制為不同濃度的多糖溶液,測定其抗氧化活性。
1.5.2 還原力測定 根據(jù)文獻(xiàn)[19]的方法,取不同濃度的樣品溶液5.0 mL,依次加入pH值6.6的1.0 mL 0.2 mo1/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液,充分混合,于50 ℃水浴20 min,冷卻后加入10%三氯乙酸1.0 mL,并以5 000 r/min離心15 min,取上清液1 mL,再加1 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1%三氯化鐵,靜置10 min后在波長700 nm 處測吸光值。以超純水作為陰性對照,以VC溶液為陽性對照,重復(fù)測3次,還原力Y1以吸光值為指標(biāo)。
1.5.3 清除·OH能力的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法修改如下,取不同濃度的樣液5.0 mL,加入9 mmol/L 硫酸鐵溶液1.0 mL后,加8.8 mmol/L 雙氧水溶液0.1 mL,搖勻,靜置10 min,加入9 mmol/L的水楊酸溶液300 μL,37 ℃水浴30 min后,于波長510 nm處測吸光度;以超純水代替雙氧水為樣品本底組;以超純水代替樣品溶液為空白對照組;以VC作為陽性對照,重復(fù)測3次?!H清除率按式(1)計算:
(1)
式中:
Y2——·OH清除率,%;
AX——樣品組吸光值;
AXo——樣品本底組吸光值;
A——空白對照組吸光值。
(2)
式中:
AX——樣品組吸光值;
A——空白對照組吸光值。
1.5.5 清除DPPH·能力的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法,取不同濃度的樣液5.0 mL,加入1.0 mL(0.2 mmol/L)DPPH· 乙醇溶液,避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長處測定吸光度Ax。超純水為空白組;將相同量無水乙醇置換DPPH·溶液為本底組,以同濃度的VC溶液作為陽性對照,重復(fù)測3次。DPPH·清除率按式(3)計算:
(3)
式中:
Y4——DPPH·清除率,%;
AX——樣品組吸光值;
AXo——樣品本底組吸光值;
A——空白對照組吸光值。
1.5.6 抑制脂質(zhì)過氧化能力的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[23]的方法,分別加入脂質(zhì)體磷酸鹽緩沖分散系(LLS)1.0 mL、400 μmol/L三氯化鐵溶液1.0 mL、不同濃度的樣品5.0 mL,避光于37 ℃ 水浴1 h,加入三氯乙酸-硫代巴比妥酸-鹽酸 2.0 mL,沸水浴15 min,以6 000 r/min離心15 min,取上清液于波長535 nm處測吸光度??瞻坠芤哉麴s水代替樣品測得吸光度,重復(fù)測3次。脂質(zhì)過氧化抑制率按式(4)計算:
(4)
式中:
Y5——脂質(zhì)過氧化抑制率,%;
AX——樣品組吸光值;
A——空白對照組吸光值。
標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.015 4x+0.002 8,R2=0.999 5,表明標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與不同濃度之間有很好的線性關(guān)系。
2.2.1 微波功率對GBRP提取率的影響 由圖1可知, GBRP提取率在微波功率600 W以下時逐漸增加;微波功率在600 W時,提取率達(dá)到最大值(2.30%);而功率繼續(xù)增加時,GBRP提取率隨著功率的增加而緩慢降低,可能是在微波功率較小時,促進(jìn)發(fā)芽糙米米糠中多糖的溶出;當(dāng)微波功率達(dá)到一定值后,過高的功率對溶出的多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響,多糖的提取率降低。因此微波功率在600 W時為最佳條件。
圖1 微波功率對GBRP提取率的影響
Figure 1 Effect of microwave power on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice
2.2.2 微波時間對GBRP提取率的影響 由圖2可知,GBRP提取率在 4 min內(nèi)隨著時間的延長而增加;在4 min時達(dá)到最大提取率(2.01%);提取時間繼續(xù)延長后多糖的提取率卻明顯降低,可能是長時間的微波輻照會破壞多糖的結(jié)構(gòu),也可能是長時間的微波處理使提取環(huán)境中局部溫度升高而導(dǎo)致多糖的損失,進(jìn)而影響了多糖的提取率。因此微波時間在4 min時為最佳條件。
圖2 微波時間對GBRP提取率的影響
Figure 2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice
2.2.3 液料比對GBRP提取率的影響 由圖3可知,多糖的提取率隨液料比的增加先增加后減少,當(dāng)液料比為25∶1(mL/g)時提取率最大(2.68%)。這可能是,液料比較少時隨著溶劑量的增加,物料與溶劑間的濃度差增加,有利于多糖的傳遞速度且增加了多糖的溶出量;液料比較大時微波對物料輻照能力減弱,或使非多糖物質(zhì)的溶出量增加,從而導(dǎo)致了多糖含量的降低。因此液料比在25∶1 (mL/g)時為最佳條件。
圖3 液料比對GBRP提取率的影響
Figure 3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice
2.2.4 提取次數(shù)對GBRP提取率的影響 由圖4可知,提取1次的效果不佳,提取2次的多糖提取率(2.56%)相較于提取1次的(1.46%)增加了約1倍;提取次數(shù)超過2次后,提取率卻不再顯著增大。從效率和成本等多方面考慮,提取2次為宜。
圖4 提取次數(shù)對GBRP提取率的影響
Figure 4 Effect of number of extractions on the extraction efficiency of polysaccharides from germinated brown rice
2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 根據(jù)各單因素試驗結(jié)果,采用響應(yīng)面Box-Behnken模型,選擇自變量為微波功率、液料比、微波時間,以GBRP提取率(Y)為響應(yīng)值,設(shè)計三因素三水平試驗。試驗因素及水平見表1。
2.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)表2試驗結(jié)果,運(yùn)用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到GBRP提取率對自變量微波功率、微波時間和液料比的二次多項回歸方程:
Y=2.8+0.076A-0.26B-0.28C-0.085AB-0.072AC-0.37BC-1.1A2-0.59B2-0.48C2。
(5)
表1 GBRP響應(yīng)面分析因素及水平表
表2 GBRP響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果
Table 2 Experimental design and result of response surface of germinated brown rice prolysaccharides
試驗號ABCY/%110-11.6821010.983-1010.924-1-101.2251-101.4961100.8370002.788-1100.9090110.80100002.79110002.87120-1-11.93130002.82140002.75150-112.101601-12.1017-10-11.33
表3 GBRP響應(yīng)面回歸方程的方差分析表?
Table 3 Variance analysis table of response surface regression equation of germinated brown rice prolysaccharides
來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型10.0791.12 470.19<0.0001??A0.0510.0519.550.0031??B0.5610.56233.900.0031??C0.6310.63263.61<0.0001??AB0.0310.0312.150.0102?AC0.0210.028.840.0207?BC0.0110.012.68<0.0001??A25.0815.082135.45<0.0001??B21.4811.48623.35<0.0001??C20.9510.95400.96<0.0001??失擬檢驗0.0132.79×10-3 1.35 0.3775不顯著 純差0.0142.07×10-3總差10.0916
由表3可知,模型顯著(P模型<0.000 1),失擬檢驗不顯著(P失擬>0.05),可用于提取GBRP試驗的預(yù)測;各因素對GBRP提取率的影響程度大小為微波時間>液料比>微波功率;A、B、C、BC、A2、B2、C2影響極顯著,AB、AC影響顯著,說明各因素對GBRP提取率的影響均為非線性關(guān)系。
2.3.3 響應(yīng)面的優(yōu)化與驗證 在回歸方程優(yōu)化所得最佳條件下,即微波功率604.89 W,液料比23.81∶1 (mL/g),微波時間3.85 min,GBRP提取率的預(yù)測值為2.85%;在改進(jìn)后所得條件下,即在微波功率604 W,液料比24∶1(mL/g),微波時間3.83 min,驗證實驗所得提取率平均值為2.82%,誤差值為1.05%,說明回歸方程能有效地反映各因素對GBRP提取率的影響,證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助法提取GBRP的回歸模型可靠。
2.4.1 GBRP還原力的測定 由圖5可知,微波輔助法提取的GBRP還原力逐漸增加,當(dāng)濃度達(dá)到0.4 mg/mL時,吸光度達(dá)到0.196,之后趨于平穩(wěn);而VC在該濃度時吸光度達(dá)1.073,GBRP的還原力約為VC的1/5。
圖5 GBRP的還原力
2.4.2 GBRP對·OH的清除作用 由圖6可知,微波輔助法提取的GBRP對·OH清除能力也是隨著濃度的增大而增加,達(dá)到一定濃度值后趨于相對平穩(wěn)。當(dāng)GBRP濃度達(dá)到0.5 mg/mL時,對·OH的清除率達(dá)到最大值(88.41%)。但VC在此濃度對·OH清除率僅為64.46%。由擬合曲線Y=183.57X+112.04 (R2=0.909)計算得到GBRP的半最大效應(yīng)濃度(EC50)值為0.211 mg/mL。說明GBRP溶液對·OH 有很強(qiáng)的清除能力,不僅高于文獻(xiàn)[24]報道的普通糙米米糠多糖對·OH的最高清除率(63.8%),也明顯高于VC的清除能力。提示糙米在發(fā)芽時啟動并激活了各種酶,經(jīng)酶促作用改變了多糖的活性,提高了多糖的抗氧化能力。
圖6 GBRP對·OH的清除作用
Figure 6 Scavenging effect on hydroxyl radical of prolysaccharides from germinated brown rice
圖7 GBRP對的清除作用
Figure 7 Scavenging effect on Super oxide anion radical of polysaccharide from germinated brown rice
2.4.4 GBRP對DPPH·的清除作用 由圖8可知,超聲波輔助提取的GBRP溶液對DPPH·清除能力隨著濃度的增大而增加,清除率達(dá)到最大值后趨于平穩(wěn)。當(dāng)GBRP濃度達(dá)到0.4 mg/mL時,對DPPH·清除率達(dá)到最大值(52.71%),但VC在此濃度對DPPH·清除率達(dá)90.49%。由擬合曲線Y=24.728X+41.712 (R2=0.875)計算得GBRP的EC50值為0.34 mg/mL。結(jié)果表明,GBRP溶液對DPPH· 的清除能力低于VC的,而與文獻(xiàn)[24]和[25]報道的同濃度的普通糙米米糠多糖溶液對DPPH·的清除能力(51.8%)相近。
圖8 GBRP對DPPH·的清除作用
Figure 8 Scavenging effect on DPPH radical of polysaccharide from germinated brown rice bran
2.4.5 GBRP對脂質(zhì)過氧化的抗氧化作用 脂質(zhì)過氧化過程將產(chǎn)生多種小分子產(chǎn)物,如丙二醛,會引起多種細(xì)胞功能的衰退,并且會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[26]。由圖9可知,微波輔助法提取的GBRP溶液對抑制脂質(zhì)過氧化能力隨GBRP濃度的增大而逐漸增加,當(dāng)GBRP濃度為0.5 mg/mL時,對抑制脂質(zhì)過氧化能力趨于平穩(wěn)(60.86%),而VC濃度在0.5 mg/mL 時僅為39.97%。由擬合曲線Y=568.12X+6.473 4 (R2=0.865 2)計算得到GBRP的EC50值為0.077 mg/mL。GBRP溶液的抑制脂質(zhì)過氧化能力不僅高于文獻(xiàn)[27]報道的普通糙米米糠多糖的(49.30%),還高于VC的。提示糙米經(jīng)發(fā)芽過程改變了多糖的活性,提高了多糖的抗氧化能力,特別是對脂質(zhì)過氧化的抗氧化能力明顯增強(qiáng)。
圖9 GBRP抑制脂質(zhì)過氧化能力
本試驗對微波輔助提取GBRP的工藝條件及其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明,其最佳提取工藝條件為提取溫度40 ℃、微波功率604 W、液料比24∶1 (mL/g)、微波時間3.83 min、提取次數(shù)2次,該條件下GBRP提取率為2.82%;同未發(fā)芽的糙米多糖的抗氧化活性進(jìn)行對比后證明微波輔助有利于GBRP的提取,并且通過多指標(biāo)結(jié)果表明糙米經(jīng)發(fā)芽活化,改變了其多糖活性,GBRP的抗氧化性高于普通糙米多糖的。
GBRP對·OH的清除率和抑制脂質(zhì)過氧化能力不僅高于普通糙米多糖,甚至高于同濃度VC的,表明發(fā)芽糙米可作為高抗氧化性多糖進(jìn)行研究開發(fā),并可作為功能食品、化妝品等增值產(chǎn)品的一個新的原料。但該試驗僅對發(fā)芽糙米的粗提多糖進(jìn)行了研究,后期將從成分和結(jié)構(gòu)角度對GBRP進(jìn)一步深入分析。
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