謝文萍 肇慧君 張琳 姜紅旭 吳斌 孫浩

（1. 大連工業(yè)大學(xué)，大連 1160341；2. 遼寧出入境檢驗檢疫局，大連 116001）

LAMP技術(shù)快速診斷布魯氏菌病的研究

謝文萍1肇慧君2張琳2姜紅旭2吳斌2孫浩1

（1. 大連工業(yè)大學(xué)，大連 1160341；2. 遼寧出入境檢驗檢疫局，大連 116001）

旨在應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）對布魯氏菌進(jìn)行研究。針對布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計LAMP引物，通過濁度法對LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，應(yīng)用建立好的LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行特異性及靈敏性試驗。結(jié)果顯示：（1）優(yōu)化后的反應(yīng)條件是62℃恒溫60 min，內(nèi)引物1.50 μmol/μL、外引物0.20 μmol/μL、環(huán)引物1.0 μmol/μL。（2）該LAMP方法與3株布魯氏菌均發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，達(dá)到陽性濁度值，而與小腸耶爾森（ATCC9510）、大腸桿菌（ATCC25922）、沙門氏菌（ATCC10708）和金黃色葡萄球菌（ACTT33591）等標(biāo)準(zhǔn)菌株沒有擴(kuò)增反應(yīng)。（3）濁度法和實時熒光法兩種方法的檢測最低限分別為4.36 fg/μL和436 fg/μL，其靈敏度均高于普通PCR的最低檢出值4.36 pg/μL。LAMP檢測技術(shù)用于布病臨床診斷具有快速、高效、便捷等特點，對于基層布病的病原學(xué)診斷具有實用價值。

布魯氏菌；16S rDNA；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡稱布病，是由布魯氏菌侵入機(jī)體所引起的一種人畜共患傳染病，人患病途徑一般為接觸已經(jīng)感染的動物或者食物，已經(jīng)成為國內(nèi)乙類法定報告?zhèn)魅静。?，2］。布魯氏菌屬于革蘭氏陰性兼性胞內(nèi)寄生菌，可以引起動物流產(chǎn)、不孕和人的勞動力喪失［3-5］。近年來，布病在世界范圍內(nèi)呈反彈趨勢，全世界每年報道的布病病例超過500萬，由于布病給動物產(chǎn)品及公共衛(wèi)生安全帶來的經(jīng)濟(jì)損失巨大，因此布病的防治十分嚴(yán)峻［6］。

Notomi等［7］在2000年研發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LA-MP），在65℃條件下，15-60 min DNA 可以擴(kuò)增1010倍左右，反應(yīng)結(jié)果可通過反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的形成進(jìn)行肉眼觀察，或者通過濁度儀檢測焦磷酸鎂白色沉淀的混濁度來判定［8-11］。該方法與普通PCR相比，具有高特異性、高靈敏度、操作簡單、耗時短、結(jié)果易于鑒定等特點，具有更大優(yōu)勢。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)已被用于對細(xì)菌、病毒、寄生蟲的檢測和動物胚胎性別鑒定等領(lǐng)域［12-19］，在疾病的快速檢測方面發(fā)展迅速，可對多種疾病進(jìn)行檢測和鑒定，是比較有發(fā)展前景的快速診斷手段方法之一。本研究針對布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計LAMP引物，對布魯氏菌進(jìn)行檢測，優(yōu)化 LAMP各反應(yīng)條件，并對該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

羊種布魯氏菌16M、豬種布魯氏菌S2、牛種布魯氏菌2308三種標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌核酸和小腸耶爾森ATCC9510、大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC10708、金黃色葡萄球菌ATCC33591、志賀氏菌ATCC29903對照菌株均來自于相關(guān)實驗室饋贈。DNA擴(kuò)增試劑盒購自廣州迪奧生物科技有限公司；蛋白酶k購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 針對布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計LAMP引物，引物序列如表1所示。

表1 布魯氏菌引物序列

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 提取細(xì)菌基因組具體步驟：吸取細(xì)菌培養(yǎng)液200 μL，10 000 r/min離心1 min，棄上清。將沉淀用540 μL TE緩沖液重懸。在重懸液中加入30 μL 10%（W/V）SDS、3 μL 2%（W/V）蛋白酶K?；旌虾?7℃溫育1 h。用等體積的酚氯仿對裂解細(xì)胞抽提兩次，12 000 r/min離心2 min，取上清。加入兩倍體積的預(yù)冷無水乙醇，12 000 r/min離心1 min。沉淀溶解在100 μL的TE緩沖液中，-20℃冰箱保存。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的配制 根據(jù)LAMP反應(yīng)試劑盒推薦的25 μL體系進(jìn)行配制，在超凈臺上進(jìn)行。

1.2.3.1 染色法反應(yīng)體系為 12.5 μL的反應(yīng)液RM（2×），內(nèi)引物（FIP/BIP）各1.5 μL，外引物（F3/B3）各0.25 μL，環(huán)引物（LF/LB）各1 μL，Bst 聚合酶1 μL，DNA模板1 μL，加超純水至25 μL。上述試劑混勻后，加20 μL密封液，混勻離心，將1 μL的顯色液滴在PCR管蓋中央。將上述反應(yīng)管放入63℃的恒溫金屬水浴鍋內(nèi)，反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，顛倒PCR管數(shù)次，使反應(yīng)混合液和顯色液充分混勻，觀察反應(yīng)液顏色。根據(jù)顏色變化觀察結(jié)果。

1.2.3.2 實時熒光法反應(yīng)體系 12.5 μL的反應(yīng)液RM（2×），內(nèi)引物（FIP/BIP）各1.5 μL，外引物（F3/ B3）各0.25 μL，環(huán)引物（LF/LB）各1 mL，Bst 聚合酶1 μL，熒光染料Ⅰ0.5 μL，DNA模板1 μL，加超純水至25 μL。上述試劑混勻后，加20 μL密封液，混勻離心。使用LC480，選擇FAM通道，反應(yīng)程序為：63℃15 s；63℃15 s、63℃45 s，共45個循環(huán)。

1.2.3.3 實時濁度法反應(yīng)體系 12.5 μL的反應(yīng)液RM（2×），內(nèi)引物（FIP/BIP）各1.5 μL，外引物（F3/ B3）各0.25 μL，環(huán)引物（LF/LB）各1 μL，Bst 聚合酶1 μL，DNA模板1 μL，加超純水至25 μL。上述試劑混勻后，加20 μL密封液，混勻離心。將反應(yīng)管放入LC-320C濁度儀中，63℃ 60 min。根據(jù)濁度圖判斷結(jié)果。

1.2.4 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化 （1）反應(yīng)時間：保持DNA擴(kuò)增試劑盒（迪奧生物科技有限公司）的推薦溫度63℃，以5 min為梯度，改變反應(yīng)時間分別為：65、60、55和50 min、反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增情況，確定最佳反應(yīng)時間。（2）反應(yīng)溫度：選擇60、61、62和63℃為不同溫度條件，以最佳反應(yīng)時間進(jìn)行實驗，確定布魯氏菌的最佳反應(yīng)溫度。再以得到的反應(yīng)溫度驗證其反應(yīng)時間也具有以上實驗的相似的趨勢。（3）引物濃度：布魯氏菌的引物分為內(nèi)、外引物和環(huán)引物（表2），兩組均進(jìn)行優(yōu)化試驗。環(huán)引物保持不變，內(nèi)、外引物同時進(jìn)行梯度變化，同理，環(huán)引物進(jìn)行梯度變化，從而得到最適宜的引物濃度。

表2 內(nèi)、外引物濃度

1.2.5 特異性實驗 分別以羊種布魯氏菌16M、豬種布魯氏菌S2和牛種布魯氏菌2308、小腸耶爾森ATCC9510、大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC10708、金黃色葡萄球菌ATCC33591、志賀氏菌ATCC29903的基因組作為模板，進(jìn)行特異性實驗。

1.2.6 靈敏度試驗 測定牛種布魯氏菌2308核酸的濃度為43.6 ng/μL，進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到的濃度梯度分別為：43.6 ng/μL、4.36 ng/μL、436 pg/μL、43.6 pg/μL、4.36 pg/μL、436 fg/μL、43.6 fg/μL和4.36 fg/μL。分別取1.0 μL作為反應(yīng)模板，使用濁度儀法、實時熒光法進(jìn)行LAMP反應(yīng)，同時與普通PCR方法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 LAMP實驗結(jié)果

分別以羊種布魯氏菌16M和牛種布魯氏菌2308作為1號和2號DNA模板，3號以水作為陰性對照。兩種模板使用染色法進(jìn)行鑒定，發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)則PCR管發(fā)綠色熒光，沒有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)則為橙紅色（圖1）。采用濁度儀方法，結(jié)果（圖2）顯示濁度達(dá)到0.1以上并且最下方為紅色則為陽性，如為綠色則為陰性，即沒有核酸擴(kuò)增。圖3為實時熒光法，出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線則判斷陽性，若無“S”型曲線為陰性。以下3個結(jié)果圖中，1號樣品和2號樣品均具有陽性判定特征，即有核酸擴(kuò)增，而3號樣品則為陰性結(jié)果。與理論分析相符，3種方法均可以檢測到布魯氏菌。

圖1 布魯氏菌LAMP可視化檢測

圖2 布魯氏菌LAMP濁度儀檢測

圖3 布魯氏菌LAMP實時熒光檢測

2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)時間的優(yōu)化 以布魯氏菌陽性核酸為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，在濁度儀中設(shè)定的4個反應(yīng)時間的LAMP試驗結(jié)果如圖4所示。圖4-A與圖4-B樣品的濁度值最高并且?guī)缀跸嗤虼丝蛇x擇60 min為最佳反應(yīng)時間。

圖4 時間梯度圖

2.2.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 以布魯氏菌陽性核酸為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，以6 min為最佳反應(yīng)時間進(jìn)行反應(yīng)溫度的優(yōu)化，反應(yīng)結(jié)果如圖5。實驗結(jié)果（圖5-C）表明，反應(yīng)溫度在62℃時，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增效率達(dá)到最高，濁度值最大。以62℃進(jìn)行時間梯度實驗（圖6），與2.2.1的結(jié)果具有相似的趨勢，因此62℃可確定為為LAMP反應(yīng)最適溫度。

圖5 溫度梯度圖

2.2.3 引物濃度的優(yōu)化 以布魯氏菌陽性核酸為模板進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖7所示，只有3號樣品得到了陽性結(jié)果，也就是說當(dāng)體系中內(nèi)引物為1.5 μmol/μL、外引物0.20 μmol/μL時，才能夠檢測出布魯氏菌。而作為不影響陰、陽性結(jié)果，僅僅增加反應(yīng)效率的環(huán)引物則與樣品濁度表現(xiàn)出線性關(guān)系，如圖8所示，會隨著環(huán)引物的濃度增加樣品的濁度也隨之增加。因此，環(huán)引物的合適濃度則為1 μmol/μL。

圖6 時間梯度圖

圖7 內(nèi)、外引物濃度優(yōu)化結(jié)果圖

圖8 環(huán)引物濃度

2.3 特異性實驗

對3株陽性布魯氏菌和5株對照菌的核酸進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果如圖9所示，3株布魯氏菌反應(yīng)結(jié)果均有擴(kuò)增，為陽性結(jié)果，5株陰性對照菌均為陰性結(jié)果。結(jié)果表明，本研究建立的LAMP檢測方法具有較好的特異性。

圖9 布魯氏菌LAMP特異性濁度法檢測

2.4 靈敏度試驗

將10倍梯度稀釋的牛種布魯氏菌2308的核酸進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，圖10為濁度儀中62℃恒溫60min的反應(yīng)結(jié)果，濁度儀的檢測低限為4.36 fg/μL，并且最后一個樣品的濁度遠(yuǎn)大于0.1。實時熒光法進(jìn)行的靈敏度實驗結(jié)果（圖11）顯示，最低檢測的樣品濃度約為436 fg/μL。普通PCR靈敏度的檢測到的最小值為4.36 pg/μL（圖12）。結(jié)果表明濁度儀和熒光定量的靈敏度均高于普通PCR。與普通PCR相比，靈敏度大幅提高，具有明顯的優(yōu)勢。

圖10 布魯氏菌LAMP靈敏度濁度法檢測

圖11 布魯氏菌LAMP靈敏度實時熒光檢測

圖12 布魯氏菌LAMP靈敏度電泳檢測

3 討論

近年來，檢測LAMP反應(yīng)的方法有目視檢查渾濁、染色法、實時濁度法和實時熒光法［20-23］。目視檢查渾濁是通過LAMP反應(yīng)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀進(jìn)行判斷，但是沉淀量較低時很難直接觀察結(jié)果。染色法則能顯著提高肉眼的識別率，可直接進(jìn)行陰、陽性結(jié)果的判斷。實時濁度法和實時熒光法則能夠更加直觀、精確地判定結(jié)果，但是兩種方法都需要特定的儀器設(shè)備，成本較高。

本研究中對濁度法進(jìn)行了反應(yīng)條件優(yōu)化，在50-60 min的反應(yīng)時間內(nèi)，時間對反應(yīng)的結(jié)果影響并不是很大。在進(jìn)行的特異性實驗時，3株布魯氏菌都顯示有核酸擴(kuò)增，而其他5株陰性對照菌無核酸擴(kuò)增，判定為陰性，結(jié)果表明引物具有較高的特異性。LAMP是一種高靈敏度檢測方法，其靈敏度通常比普通PCR約高100倍。通過濁度法、實時熒光和普通PCR 3種方法進(jìn)行靈敏度分析，分別得到的檢測極限為4.36 fg/μL、436 fg/μL和4.36 pg/μL，結(jié)果比較后可以得出LAMP檢測技術(shù)的靈敏度要高于普通PCR，優(yōu)勢明顯。圖9中最高濃度的樣品在濁度儀實驗中反而出現(xiàn)了陰性結(jié)果，是否因為樣品濃度過高而影響了濁度儀對陰陽性的判斷，還需要大量實驗進(jìn)行驗證。

4 結(jié)論

針對布魯氏菌保守基因16S rDNA設(shè)計引物并建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）。通過3種方法對布魯氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表現(xiàn)出特異性強(qiáng)、速度快且設(shè)備要求簡單等特點，但對于靈敏度而言，濁度儀法相對具有優(yōu)勢。

［1］許鄒亮, 南文龍, 周潔, 等. 布魯氏菌環(huán)節(jié)導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）可視化檢測方法的建立［J］. 中國動物檢, 2011, 28（8）：37-40.

［2］Guo Z, Fu Y Z, Ji Z, et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the omp25 gene for rapid detection of Brucella spp［J］. Molecular and Cellular Probes, 2011, 25：126-129.

［3］Huynh TH, Lauren TA, Hannah LS, et al. An evaluation of ELISA using recombinant Brucella abortus bacterioferritin（Bfr）for bovine brucellosis［J］. Microbiology and Infectious Diseases, 2016, 45：16-19.

［4］高彥輝, 趙麗軍, 孫殿軍, 等. 布魯氏菌病防治基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀與展望［J］. 中國科學(xué), 2014, 44（6）：628-635.

［5］Li J, Li Y R, Wang Y, et al. Renal abscess caused by Brucella［J］. International Journal of Infectious Diseases, 2014, 28：26-28.

［6］毛景東, 王景龍, 楊艷玲. 布魯氏菌病的研究進(jìn)展［J］. 中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38（1）：222-226.

［7］Notomi T, Okayma H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplificationof DNA［J］. Nuuceic Acids Res, 2000, 28（12）, 63-69.

［8］馬國瑞, 李志強(qiáng), 張輝, 等. 基于布魯氏菌omp25基因的環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)建立及初步應(yīng)用［J］. 石河子學(xué)報, 2014, 32（6）：683-686.

［9］Pérez-Sancho M, García-Seco T, Arrogante L. Development and evaluation of an IS711-based loop mediated isothermal amplification method（LAMP）for detection of Brucella spp. on clinical samples［J］. Research in Veterinary Science, 2013, 95：489-494.

［10］Song L Y, Li JT, Hou SP, et al. Establishment of loop-mediated isothermal amplification（LAMP）for rapid detection of Brucella spp. and application to milk and blood samples［J］. Journal of Microbiological Methods, 2012, 90：292-297.

［11］馬艷萍, 劉振興, 郝樂, 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的研究進(jìn)展［J］. 河北科技師范學(xué)院學(xué)報, 2011, 25（1）：76-80.

［12］Watthanapanituck K, Kiatpathomchai W, Chu E, et al. Identification of human DNA in forensic evidence byloop-mediated isothermal amplification combined with a colorimetric gold nanoparticle hybridization probe［J］. Int J Legal Med, 2014, 128：923-931.

［13］Kokkinos PA, Zios PG, Bellou M, et al. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）for the detection of Salmonella in food［J］. Food Anal Methods, 2014, 7：512-526.

［14］劉威, 李環(huán), 鄒大陽. 用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測糞便樣本中的沙門菌［J］. 生物技術(shù)通訊, 2014, 24（2）：237-241.

［15］關(guān)麗, 聶凱, 張丹. 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測中東呼吸綜合癥冠狀病毒基因［J］. 病毒學(xué)報, 2014, 31：269-275.

［16］戴婷婷, 陸辰晨, 沈浩, 等. 基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測橡樹疫霉菌［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 36（3）, 23-28.

［17］陳伯祥, 楊明, 常亮. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在動物傳染病診斷中的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33（4）：90-96.

［18］李結(jié), 王培園, 張萍. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)及其在動物疫病檢測中的應(yīng)用［J］. 中國畜牧獸醫(yī), 2012, 39（3）：71-74.

［19］Karthik K, Rathore R, Thomas P, et al. Rapid and visual loop mediated isothermal amplifi cation（LAMP）test for the detection of Brucella spp. and its applicability inepidemiology of bovine brucellosis［J］. Veterinarski Arhiv, 2016, 86（1）：35-47.

［20］Ren H, Yang MJ, Zhang JX . Development of a rapid recombinase polymerase amplification assay for detection of Brucella in blood samples［J］. Molecular and Cellular Probes, 2016, 30：122-124.

［21］高正琴, 邢進(jìn), 馮育芳. TaqMan MGB探針實時熒光定量PCR快速檢測布魯氏菌［J］. 中國人獸共患病學(xué)報, 2011, 27（11）：995-1000.

［22］Bounaadja L, Albert D, et al. Real-time PCR for identification of Brucella spp. A comparative study of IS711, bcsp31 and per target genes［J］. Veterinary Microbiology, 2009, 137：156-164.

［23］Biright H, Holgerc S, Nidia L. Development of PCR assay for typingand subtyping of Brucella species［J］. International Journal of Medical Microbiology, 2009, 299：563-573.

（責(zé)任編輯 李楠）

Rapid Diagnosis of Brucella by Loop-mediated Isothermal Amplification

XIE Wen-ping1ZHAO Hui-jun2ZHANG Lin2JIANG Hong-xu2WU Bin2SUN Hao1
（1. Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116001）

This study aims to apply the loop-mediated isothermal amplification（LAMP）in detecting Brucella. A set of six specific primers specific to regions of 16S rDNA gene were designed，and the turbidity technique was employed to optimize the reaction conditions，by which the specificity and sensitivity of the method were evaluated. Results are：（1）the optimized temperature was 62℃ at constant 60 min，and the concentration of inner primer was 1.50 μmol/μL，0.20 μmol/μL outer primers，and 1.0 μmol/μL loop primers；（2）furthermore，3 strains of Brucella occurred LAMP amplification reaction and achieved the positive turbidity value，but there was no amplification with other control group including Yersinia enterocolitica ATCC9510，Escherichia coil ATCC25922，Salmonella typhimurium ATCC10708，and Staphylococcus aureus ACTT33591；（3）the minimum thresholds for turbidity technique and real-time fluorescence were 4.36 fg/μL and 436 fg/μL respectively，their sensitivities were both higher than the value by conventional PCR，4.36 pg/μL. Obviously，it is fast，efficient，and convenient while LAMP is applied in the clinic diagnosis of Brucella，therefore，it is practically applicable for the pathogenic diagnosis of Brucella in grassroots communities.

Brucella；16S rDNA；loop-mediated isothermal amplification（LAMP）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.027

2016-09-02

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科研項目（2014IK248）

謝文萍，女，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：xwponly@163.com

吳斌，女，博士研究生，研究員，研究方向：食品安全，E-mail：wubin69@163.com；孫浩，男，副教授，研究方向：食品資源開發(fā)與利用，E-mail：cjohns@163.com