鄧雨青 李平 周彥 熊克才 李中安

（1. 西南大學(xué)柑桔研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2. 重慶市昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重點實驗室 西南大學(xué)植物保護學(xué)院，重慶 400716）

植物細胞程序性死亡檢測技術(shù)研究進展

鄧雨青1李平1周彥1熊克才2李中安1

（1. 西南大學(xué)柑桔研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2. 重慶市昆蟲學(xué)及害蟲控制工程重點實驗室 西南大學(xué)植物保護學(xué)院，重慶 400716）

細胞程序性死亡（PCD） 是一種細胞生物學(xué)反應(yīng)，廣泛存在于植物的生長發(fā)育與抗逆過程，是當(dāng)今生命科學(xué)的研究熱點之一。從形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方面綜合分析了植物細胞 PCD 檢測方法的研究進展，并對現(xiàn)有植物 PCD 檢測技術(shù)的不足和解決途徑進行了討論與展望，以期為后續(xù) PCD 研究和應(yīng)用提供借鑒。

細胞程序性死亡 ；細胞凋亡 ；檢測技術(shù)

細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）也稱細胞凋亡（apoptosis），是細胞在特定生理或病理條件下，由基因調(diào)控的一種生物學(xué)現(xiàn)象［1］。PCD是植物生長發(fā)育過程的重要組成部分，貫穿胚發(fā)育，細胞分化及器官形成等過程［2］。同時，PCD 也是植物抵御生物或非生物脅迫的基本機制，在植物抗病或抗逆過程中發(fā)揮著重要的作用［3，4］。

細胞死亡主要分為 PCD 和細胞壞死。前者主要表現(xiàn)為細胞體積縮小、細胞核濃縮、線粒體產(chǎn)生空泡或解體、液泡破裂等，通常無炎癥反應(yīng)。壞死細胞的主要特征為細胞腫脹、細胞膜破裂、胞漿內(nèi)容物外流，并伴有炎癥發(fā)生［5］。兩者易被混淆，因此正確辨別 PCD 細胞和壞死細胞是研究植物 PCD 的前提。早期常采用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡進行形態(tài)學(xué)觀察，或通過瓊脂糖電泳法檢測 DNA 片段化。近年來，分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)技術(shù)被逐漸運用于植物 PCD 的檢測，手段已日趨成熟，極大地提高了檢測的準(zhǔn)確性和效率。本文對 PCD 檢測技術(shù)的研究進展進行綜述，并分析了現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足及展望今后發(fā)展方向，旨在為相關(guān)研究提供參考。

1 形態(tài)學(xué)檢測方法

植物細胞發(fā)生 PCD 時會出現(xiàn)細胞質(zhì)、細胞核皺縮，染色質(zhì)高度凝聚并且邊緣化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴增，線粒體腫脹，液泡破裂等典型的形態(tài)變化［5，6］。利用光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和電子顯微鏡可觀察到發(fā)生 PCD 的植物細胞。

1.1 光學(xué)顯微鏡檢測

植物組織樣品經(jīng)伊文思藍、臺盼藍、甲基綠-派諾寧等染料染色處理后，通過光學(xué)顯微鏡觀察細胞體積縮小、凝聚、邊緣化及凋亡小體形成等形態(tài)變化可快速判斷 PCD 的產(chǎn)生。該方法雖然簡便，但靈敏度低，無法檢測 PCD 發(fā)生初期的細胞，且難以區(qū)分 PCD 細胞與凝固性壞死細胞［7］。因此光學(xué)顯微鏡法只能用于植物細胞 PCD 的初步判別，不能單獨使用，需與其他檢測手段相結(jié)合。

1.2 熒光顯微鏡檢測

與壞死細胞不同，PCD細胞和正常細胞的細胞膜完整，沒有損傷。此外，PCD細胞與正常細胞相比，常常會出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚且邊緣化的現(xiàn)象。因此，根據(jù)細胞膜完整性和核內(nèi)染色質(zhì)發(fā)生凝聚的特點，借助 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、Hoechst、吖啶橙 (acridine orange，AO)、碘化丙啶 （propidium iodide，PI） 和溴乙錠 （ethidium bromide，EB） 等 DNA 特異性染料，在熒光顯微鏡下可有效區(qū)分正常細胞、壞死細胞及PCD 細胞。Pang 等［8］通過 DAPI 染色觀察到經(jīng)低氧水處理的小麥根尖細胞出現(xiàn)了原生質(zhì)濃縮、染色質(zhì)凝集、細胞核皺縮等典型的 PCD 特征。PI 與 EB 進入細胞膜顯色后只能區(qū)分活細胞與死細胞，因此通常采用雙重染色法區(qū)分 PCD 細胞、正常細胞和壞死細胞。李榮峰等［9］以大豆根邊緣細胞為材料，利用Hoechst-PI 雙重?zé)晒鈾z測鋁誘導(dǎo)的細胞程序性死亡發(fā)現(xiàn)，活細胞中有淡藍色熒光，而 PCD 細胞的細胞質(zhì)呈黃綠色、細胞核呈黃色，壞死細胞則顯示金黃色熒光。Kunikowska 等［10］在利用EB/AO雙重?zé)晒鈾z測激動素誘導(dǎo)的蠶豆根尖細胞 PCD 時，發(fā)現(xiàn)活細胞的細胞核出現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光，細胞質(zhì)顯示橘紅色熒光。PCD 早期細胞核染色質(zhì)呈黃綠色并且凝聚在核膜內(nèi)側(cè)，晚期 PCD 細胞被染成橙色。該方法簡便易行，應(yīng)用較廣，是常用的植物細胞 PCD檢測方法，但定量和定性均較差。

1.3 激光共聚焦顯微鏡檢測

激光共聚焦顯微鏡法是目前應(yīng)用最廣泛和光學(xué)圖像分辨率最高的分子細胞生物學(xué)分析方法，因其具有較高的分辨率、靈敏度、放大率等特點，廣泛應(yīng)用于植物 PCD 研究。通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞的結(jié)構(gòu)變化，對 PCD 細胞的染色質(zhì)和核碎片進行定位，同時利用熒光標(biāo)記還可以觀察 PCD 細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而對細胞內(nèi)環(huán)境的動態(tài)變化進行實時監(jiān)測。方策等［11］利用該技術(shù)研究伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）誘導(dǎo)擬南芥 PCD 時發(fā)現(xiàn)早期 PCD 細胞線粒體中過氧化氫含量急劇增加，同時線粒體發(fā)生腫脹，引發(fā)線粒體膜電位下降。Wang［12］利用該方法檢測家榆老化的種子發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DAPI 染色后種子細胞中呈染色質(zhì)皺縮、凝聚、解體等特征，表明榆樹種子在老化過程中發(fā)生了 PCD。該方法可用于組織切片、固定后的細胞，以及體外培養(yǎng)的懸液細胞觀察，靈敏度高，特異性強。

1.4 電子顯微鏡檢測

利用電子顯微鏡技術(shù)觀察植物 PCD 細胞形態(tài)學(xué)特征，是診斷 PCD 最可靠的方法之一。掃描電鏡可以觀察到 PCD 細胞表面發(fā)生的細胞體積縮小，細胞表面微絨毛減少等形態(tài)變化［13］。而透射電鏡則用于觀察 PCD 細胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化，如細胞質(zhì)濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴增和線粒體腫大、細胞核染色質(zhì)凝聚、邊緣化、形成凋亡小體等［5，14］。Rybaczek 等［15］利用透射電鏡觀察咖啡堿誘導(dǎo)蠶豆根尖分生組織 PCD 時發(fā)現(xiàn)，細胞出現(xiàn)大范圍液泡化、染色質(zhì)凝聚且邊緣化、囊泡增加、原生質(zhì)體收縮等典型 PCD 特征。但是電子顯微鏡不能對 PCD 細胞進行定量，同時樣品制備過程較復(fù)雜，檢測成本較高、耗時長，不適宜大批樣品觀察。

2 染色質(zhì) DNA 斷裂檢測方法

2.1 DNA 梯狀條帶檢測

植物細胞發(fā)生 PCD 時，核酸內(nèi)切酶活性增加，細胞核 DNA 在核酸內(nèi)切酶的作用下，在核小體間斷裂形成具有 180-200 bp 及其倍數(shù)的 DNA 片段，從而在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)特殊的 DNA 梯狀條帶［16-18］。壞死細胞DNA由于被無規(guī)則破壞而產(chǎn)生散漫的片狀圖譜［15］。在水分脅迫的玉米葉片［16］、鋁誘導(dǎo)的玉米根尖細胞［3］、冷害脅迫的黃瓜果實［17］和激動素誘導(dǎo)的蠶豆根尖細胞［11］發(fā)生 PCD 時都可以檢測出明顯的 DNA 梯狀條帶。但并非所有發(fā)生PCD 的細胞都能觀察到 DNA 梯狀條帶。金鋼［19］和范濤等［20］分別研究線蟲侵染的黑松及褐斑病菌侵染的蘋果葉片的 PCD 時，雖檢測到 DNA 片段化存在，卻沒有觀察到 DNA 梯狀條帶，這可能是樣品中發(fā)生 PCD 的細胞少，斷裂的DNA含量較低，不易被檢測到。該方法操作簡便，定性準(zhǔn)確，可定量檢測晚期PCD 細胞。但靈敏度低，不能檢測 DNA 斷裂較少的早期 PCD 細胞，也不能顯現(xiàn)組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，需與其他檢測方法結(jié)合使用。

2.2 彗星電泳檢測

彗星電泳（comet assay）也稱單細胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis，SCGE），是一種定量測定 DNA 損傷的可靠方法，主要用于檢測單細胞中 DNA 損傷因子引發(fā)的細胞 DNA 斷裂片段。該方法由 Ostling和Jahanson［21］于1984年建立，后經(jīng)Singh等進行了改進［22］。其原理是 DNA 雙鏈在堿性電泳中解螺旋，斷裂的 DNA 碎片釋放并向陽極移動，經(jīng)熒光染色觀察呈現(xiàn)“彗星”狀。DNA 損傷越重，斷裂的 DNA 碎片就越多，導(dǎo)致尾部 DNA 聚集，熒光增強。因此可通過 DNA 遷移距離或者熒光強度測定細胞 DNA 的損傷程度。早期彗星電泳多用于動物細胞PCD的檢測，直到 1996年Koppen等［23］首次利用 SCGE 檢測蠶豆根尖細胞 DNA 損傷，隨后該方法在多種植物中得到應(yīng)用。蔣磊等［24］在此基礎(chǔ)上完善了植物材料的 SCGE 技術(shù)，研究了紫外輻射誘導(dǎo)后不同發(fā)育時期的九里香葉片 DNA 損傷的敏感性差異。Rybaczek 等［15］也利用該方法檢測到咖啡堿處理的蠶豆根尖分生組織中存在 DNA 損傷。彗星電泳法快速、簡便、準(zhǔn)確，不僅可以檢出單、雙鏈斷裂，同時對堿基易變位點，DNA 交聯(lián)、切除修復(fù)位點也有良好的檢測效果。但是不能直接檢測具有細胞壁的植物細胞，多用于植物原生質(zhì)體的檢測。

2.3 TUNEL 原位末端標(biāo)記檢測

TUNEL 原位末端標(biāo)記法是一種檢測 DNA 片段3'末端羥基的方法，可通過對完整的PCD 細胞核或凋亡小體進行染色觀察，從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)方面反映植物 PCD 的過程。植物細胞發(fā)生 PCD 時，核酸內(nèi)切酶被激活，染色質(zhì)DNA被切割而形成單鏈或雙鏈缺口，其末端暴露出大量的 3'-OH，在末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）作用下，DNA 末端的羥基與熒光素-12dUTP 結(jié)合，從而檢測出 PCD 細胞。在熒光顯微鏡下，經(jīng)熒光素標(biāo)記后的 PCD 細胞細胞核呈現(xiàn)較強的綠色熒光，正常細胞與壞死細胞因 DNA斷裂很少，幾乎沒有熒光［16，26］。應(yīng)用該方法發(fā)現(xiàn)鋁、咖啡堿、胡桃醌、SQ-1 分別誘導(dǎo)花生細胞、小麥葉片、萵苣幼苗根尖細胞及蠶豆根尖細胞發(fā)生PCD［3，14，26，27］。與其他檢測方法相比，TUNEL 法特異性強，靈敏度高，可對 PCD 細胞進行定性與定量分析，甚至能檢出早期未發(fā)生典型變化的 PCD 細胞，主要用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞以及組織中分離細胞的 PCD 檢測，是目前檢測植物 PCD 的首選方法。

2.4 ELISA 法檢測

植物發(fā)生 PCD 時，染色質(zhì) DNA 斷裂在細胞質(zhì)中出現(xiàn)核小體或寡聚核小體片段，通過 ELISA 檢測PCD 細胞釋放到細胞質(zhì)中的核小體片段確定細胞發(fā)生 PCD 的程度。早期ELISA主要用于動物細胞的檢測，直到 2000 年 Ning 等［28］首次將其運用于植物PCD研究。隨后 Tulliicristiance 等［29］運用該方法檢測到茜草科作物黏液毛細胞中存在 PCD。該方法簡便易行，靈敏性高，最低可檢測500個/mL PCD 細胞，適合大批量樣本的檢測，但不能進行定位。

2.5 流式細胞儀檢測

流式細胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行快速定量分析和分選的檢測方法，主要用于細胞定量分析和細胞分類研究。植物 PCD 細胞會出現(xiàn) DNA 斷裂現(xiàn)象，利用 FCM 觀察熒光素染色后的細胞發(fā)現(xiàn)，在DNA 分布直方圖上可看到正常細胞G1期的峰前增加了一個特異性二倍體亞峰，同時根據(jù)峰的高低測出 PCD 細胞的百分率［30，31］。此外，由于 PCD 細胞具有低于正常細胞的前散射光譜和高于正常細胞的側(cè)散射光譜，而壞死細胞則具有明顯高于正常細胞的前、側(cè)散射光譜，因此利用 FCM 觀察光散射特征可辨別、定量 PCD 細胞。流式細胞儀檢測法操作快捷、簡便，靈敏度高，特異性強，結(jié)果準(zhǔn)確，且所需樣品量少，可同時測定細胞增殖率和死亡率，但該方法只能檢測單個細胞或生物粒子，且對生物樣品的質(zhì)量要求也較高。

3 其他檢測方法

3.1 Caspase 活性檢測

Caspase 是一類半胱氨酸蛋白酶，是調(diào)控動物PCD 的關(guān)鍵因子。近年研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生 PCD 的植物細胞中檢測到類似 Caspase 酶的活性［32，33］。Ma［34］在研究水分脅迫下湖北海棠根系 PCD 時，檢測到了Caspase-3 與 Caspase-7 的活性。譚冬梅［35］利用免疫印跡法檢測干旱脅迫誘導(dǎo)平邑甜茶及新疆野蘋果的 PCD 時發(fā)現(xiàn)，兩種砧木葉中都含有類 Caspase-3蛋白酶，其分子量約 40 kD，比動物 Caspase-3 酶高8 kD。徐其現(xiàn)［36］等通過構(gòu)建類 Caspase-3 蛋白酶的表達載體，并運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)檢測到植物PCD過程中 Caspase-3 的活性。目前可通過熒光底物以及 Caspase 酶抑制劑檢測植物 PCD 中類 Caspase蛋白酶活性和功能，也可以通過蛋白印跡法（western blot）檢測 PCD 細胞內(nèi) Caspase 裂解產(chǎn)物。Caspase活性檢測法操作簡單，可操作性強，可用于大批樣品的檢測。

3.2 線粒體膜電位檢測

線粒體在植物 PCD 中起重要作用，其跨膜電位變化是早期 PCD 的標(biāo)志之一。早期發(fā)生 PCD 的細胞中線粒體膜的通透性增加，引發(fā)促凋亡蛋白的釋放，從而導(dǎo)致線粒體膜電位下降，最終出現(xiàn)線粒體腫脹、破裂，細胞核濃縮、染色質(zhì)凝聚等現(xiàn)象［37，38］。目前主要采用 JC-1、羅丹明123、四甲基羅丹明乙酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）等熒光探針檢測線粒體膜電位的變化。Díaz-Tielas 等［39］利用 JC-1 檢測查耳酮誘導(dǎo)的擬南芥根尖細胞 PCD 時發(fā)現(xiàn)，早期 PCD 細胞線粒體出現(xiàn)綠色熒光，正常細胞線粒體呈紅色熒光。通過觀察線粒體染色變化可檢測到線粒體膜電位的下降，為早期 PCD 的研究提供依據(jù)。該方法簡便、快捷，但不能辨別是否由于PCD 導(dǎo)致的線粒體膜電位變化，因此只能作為植物PCD 檢測的補充方法。

3.3 細胞色素C 蛋白釋放的檢測

細胞色素C 蛋白（cytochrome C，Cyt C）作為線粒體呼吸鏈的基本成分之一，是線粒體啟動 PCD程序的關(guān)鍵物質(zhì)。由于Cyt C 不能透過線粒體，因此不能在細胞質(zhì)中被檢測到。植物細胞在物理、化學(xué)、生物等 PCD 誘導(dǎo)因子的作用下，線粒體膜通透性增加，引發(fā) Cyt C 釋放到胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致 PCD。在鹽脅迫誘導(dǎo)的煙草細胞［40］以及鋁誘導(dǎo)的花生根尖細胞 PCD［41］中都能檢測到 Cyt C，此外利用 Cyt C處理胡蘿卜原生質(zhì)體可誘發(fā)PCD的產(chǎn)生［42］。

3.4 特異性基因檢測

PCD 是一種受基因調(diào)控、主動的細胞死亡方式。目前，已從植物中篩選出了 CsCysP、 AtMYB30、mlo 等 PCD 相關(guān)基因。馬巖巖等［43］發(fā)現(xiàn) CsCysP基因在柑橘老葉、成熟的花瓣和脫落果萼離層等 PCD細胞中表達量較高，而在幼苗的根、莖、葉表達量低。Vailleau 等［44］發(fā)現(xiàn) AtMYB30基因在擬南芥中的過量表達可加速和增強植物對病原菌的抗性，并誘導(dǎo) PCD 以抵抗病原菌的入侵。此外，植物細胞中存在與動物細胞類似的一些 PCD 抑制基因，如 DAD、BI-1和CED 基因等，可根據(jù)這些基因的表達強弱來判斷植物PCD被抑制的程度。Wang 等［45］發(fā)現(xiàn)TaDAD2 基因在條銹病菌（P. striiformis）誘導(dǎo)后的小麥中表達量下降，從而誘導(dǎo) PCD 的產(chǎn)生和增強植株抗性。相反， TADAD2 基因的過量表達會抑制 PCD的產(chǎn)生，使植株易感病。

4 展望

植物細胞程序性死亡在生物體進化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用，已成為生命科學(xué)的研究熱點之一。目前已建立了多種植物 PCD 的檢測技術(shù)，但各自均有優(yōu)缺點，應(yīng)充分了解各種檢測方法的原理及應(yīng)用范圍，根據(jù)實際情況選用適宜的檢測技術(shù)。植物 PCD 主要通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、電子顯微鏡進行形態(tài)學(xué)檢測，或通過 TUNEL 法、瓊脂糖電泳法等檢測染色質(zhì) DNA 斷裂。但形態(tài)學(xué)檢測法耗時較長，費用昂貴，靈敏度低，且不易于 PCD的產(chǎn)生、機理等方面研究。TUNEL 法靈敏性高，能夠檢測各個時期的 PCD 細胞，但容易出現(xiàn)假陽性且背景值較高。瓊脂糖電泳法只能檢測晚期 PCD 細胞，且不能區(qū)分早期 PCD 細胞與壞死細胞。目前隨著 PCD 在細胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的深入，磷脂酰絲氨酸外翻檢測法［46］、凋亡相關(guān) mRNA 及 miRNA 的分析與檢測［47］、分子探針法、 GFP 共表達重組型基因的檢測與表達［48］及體內(nèi)核磁共振檢測法［49］等新興檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用于動物以及人類 PCD 領(lǐng)域的研究，并已獲得成功。今后這些技術(shù)將有望在植物 PCD 研究中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Progress on Detection Technology of Programmed Cell Death in Plant

DENG Yu-qing1LI Ping1ZHOU Yan1XIONG Ke-cai2LI Zhong-an1
（1. Citrus Research Institute, SouthWest University，Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712；2. Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection / SouthWest University，Chongqing 400716）

Programmed cell death (PCD) is an active response in cell biology, which widely exists in plant growth and development. It has become a hot research for life science in recent years. In this paper, progress in the detection of PCD by morphology, biochemistry and molecular biology were reviewed. Furthermore, the disadvantages for the existing detection methods of PCD were also discussed in order to lay a sound foundation for better study and use.

programmed cell death；apoptosis；tection technology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.008

2016-06-17

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃重點項目（ CSTC2015JCYJBX0043），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（XDJK2015A009，XDJK2016E047）

鄧雨青，女，碩士研究生，研究方向：植物病理學(xué)；E-mail：dengyuqing828@163.com

李中安，男，研究員，研究方向：分子植物病理學(xué)、細胞生物學(xué)；E-mail：zhongan@cric.cn