不同干燥方法對(duì)川麥冬甾體皂苷和高異黃酮的影響?yīng)お?/h1>
2017-04-07 14:12王菲尚展鵬馬志國(guó)劉思燚王子健
中國(guó)中藥雜志 2016年23期
王菲 尚展鵬++馬志國(guó)++劉思燚 王子健 張加余
[摘要]該研究以川麥冬為研究對(duì)象，考察不同干燥方法對(duì)麥冬藥材中化學(xué)成分的影響。取新鮮川麥冬塊根粗粉，分別采用50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷凍干燥3種方法進(jìn)行干燥處理，應(yīng)用HPLCDADELSDMSn多檢測(cè)器串聯(lián)技術(shù)，篩選鑒定干燥過(guò)程中變化顯著的高異黃酮類(lèi)和甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分。結(jié)果顯示：與新鮮麥冬藥材的HPLC圖相比，50 ℃烘干干燥最能保持藥材固有化學(xué)成分；80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷凍干燥方法則對(duì)化學(xué)成分影響較大；結(jié)合HPLCHRMSn數(shù)據(jù)，最終篩選了36個(gè)差異性成分，并鑒定了其中24個(gè)差異性成分（11個(gè)甾體皂苷和13個(gè)高異黃酮）的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，不同干燥方法對(duì)川麥冬中甾體皂苷和高異黃酮有明顯影響；從成本、成分含量和實(shí)用性綜合分析，50 ℃烘干干燥更有利于川麥冬藥材中固有成分的保留，可以為川麥冬藥材的產(chǎn)地干燥加工提供借鑒。
[關(guān)鍵詞]川麥冬； 甾體皂苷； 高異黃酮； 干燥方法； HPLCUVELSDMSn
Influence of different drying methods on steroidal saponins and
homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus
WANG Fei1， SHANG Zhanpeng1， MA Zhiguo2， LIU Siyi1， WANG Zijian3， ZHANG Jiayu3*， LU Jianqiu4*
（1School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；
2College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China；
3Beijing Institution of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；
4Library of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
[Abstract]To study the influence of three different drying methods （including 50 ℃drying， 80 ℃drying and -70 ℃freezedrying methods） on steroidal saponins and homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus，a HPLCDADELSDMSn method was investigated to screen and identify the differential components Through comparing the HPLC chromatograms with that of fresh O japonicus， 50 ℃drying medicine was similar with fresh medicine whereas the other two drying methods had great influence on the components of O japonicus In this study， 36 differential components were screened， among which 24 constituents（13 homoisoflavonoids and 11 steroidal saponins） were identified via HPLCLTQOrbitrap MSAs a result， it was revealed that different drying methods had significant influences on the components of steroidal saponins and homoisoflavonoids Among them， 50 ℃drying method was the most suitable drying approach when the stability of components， cost and practicability were considered
[Key words]Ophiopogon japonicus； steroidal saponins； homoisoflavonoids； drying methods； HPLCDADELSDMSn
doi：10.4268/cjcmm20162317
麥冬Ophiopogon japonicas （Lf） KerGawl為百合科植物麥冬的干燥塊根，主產(chǎn)于四川、浙江等地，故有川麥冬和杭麥冬之分[1]。麥冬為常用滋陰中藥，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心之功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，麥冬具有顯著的耐缺氧、改善心血管、抗癌、降血糖等活性[35]。
藥材產(chǎn)地干燥加工是中藥生產(chǎn)與品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，其間可能會(huì)發(fā)生成分相互轉(zhuǎn)化[6]。2015年版《中國(guó)藥典》中雖規(guī)定了麥冬的產(chǎn)地加工干燥方法，但未見(jiàn)具體干燥方法、干燥溫度等詳細(xì)參數(shù)[7]。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道不同干燥方法對(duì)麥冬品質(zhì)的影響[810]，但僅局限于對(duì)特定主要活性成分的定量研究，并未系統(tǒng)研究差異性化學(xué)成分。因此，本研究應(yīng)用HPLCDADELSDMSn多檢測(cè)器串聯(lián)技術(shù)，對(duì)不同干燥方法下川麥冬差異性甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)成分進(jìn)行篩選鑒定，探討不同干燥方法對(duì)藥材中化學(xué)成分的影響，以期為川麥冬藥材產(chǎn)地干燥加工提供科學(xué)依據(jù)。
1材料
川麥冬鮮品于2016年春季采于四川雅安，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)譚鵬副教授鑒定為百合科植物川麥冬O japonicus的新鮮塊根。采收后，選擇個(gè)體完整、色澤鮮艷的新鮮麥冬，除去須根，以清水洗去表面雜質(zhì)，用保鮮塑料膜密封，置于冰箱內(nèi)4 ℃低溫保存。
高異黃酮類(lèi)對(duì)照品（5，7，4′三羥基6甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、5，7，2′三羥基4′甲氧基6，8二甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮E）和甾體皂苷類(lèi)對(duì)照品（ophiopojaponin C， 14hydroxysprengerinin C， ophiopogonin D′， ophiopogonin D， pennogenin 3O[αLrha（1→2）][βDxyl（1→4）]βDglc）均為本課題組前期從川麥冬藥材中分離得到[1112]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR， 13CNMR等手段得以確定，經(jīng)HPLC歸一化法檢測(cè)，純度均≥95%。所用色譜級(jí)乙腈和甲醇均購(gòu)于Fisher Scientific （Fair Lawn，USA），甲酸購(gòu)于Sigma Aldrich （StLouis，USA），其余試劑均為分析純。
Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000（德國(guó)Thermo公司），配有DAD檢測(cè)器（德國(guó)Thermo公司）、ELSD 6000ES檢測(cè)器（美國(guó)Alltech公司）、HPLCLTQOrbitrap XL質(zhì)譜檢測(cè)器（德國(guó)Thermo公司）；Xcalibur 21工作站（美國(guó)Thermo Scientific公司）；變色龍70工作站（美國(guó)Thermo Scientific公司）；R200D型電子分析天平（1/10萬(wàn)，德國(guó)Sartorius公司）；MilliQ Synthesis超純水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京惠誠(chéng)佳儀科技有限公司）等。
2方法
21不同干燥方法下的川麥冬樣品制備
取新鮮川麥冬藥材洗凈擦干，混勻，稱(chēng)取3份，每份約20 g，分別進(jìn)行50 ℃烘干、80 ℃烘干干燥和真空冷凍干燥（-70 ℃）。干燥指標(biāo)：按照2015年版《中國(guó)藥典》一部附錄規(guī)定的水分測(cè)定，樣品連續(xù)2次干燥后的質(zhì)量差異在5 mg以下。①50 ℃烘干：將新鮮川麥冬藥材均勻放在電熱恒溫干燥箱中，50 ℃鼓風(fēng)干燥； ②80 ℃烘干：將新鮮川麥冬藥材均勻放在電熱恒溫干燥箱中，80 ℃鼓風(fēng)干燥； ③冷凍干燥：將新鮮川麥冬藥材放入超低溫冰箱中冷凍24 h，再放入冷凍干燥機(jī)中，真空度10 Pa，-70 ℃干燥。經(jīng)準(zhǔn)確稱(chēng)量計(jì)算后分別得到10021 1，9206 4，8013 2 g的干燥后藥材，備用。
22不同干燥方法下川麥冬供試液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
將干燥后的麥冬藥材粉碎，分別稱(chēng)取步驟21項(xiàng)中各干燥品2459 3 g（50 ℃）， 2278 6 g（80 ℃）， 2012 1g（凍干）以及鮮品5014 4 g（注：各藥材取樣量按照干燥得率計(jì)算，誤差均嚴(yán)格控制在1%以內(nèi)，以消除取樣誤差對(duì)峰面積差異的影響），加70%甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，50 ℃水浴蒸至近干，加水2 mL使溶解，通過(guò)預(yù)平衡過(guò)的SPE（Solid Phase Extraction）固相萃取C18Low小柱（1667 g·L-150 pk，美國(guó)Grace公司），分別以2 mL水、2 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，以022 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
分別取上述各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解至01 g·L-1作為儲(chǔ)備液，進(jìn)樣前適當(dāng)稀釋后使用。
23液相色譜條件
色譜柱ZorbaxSBAq C18色譜柱（46 mm×150 mm，35 μm）；流動(dòng)相A 為01%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈甲醇（3∶1）；梯度洗脫：0～3 min，5%～10% B；3～6 min，10%～21% B；6～18 min，21%～26% B；18～40 min，26%～51% B；40～58 min，51%～55% B；58～60 min，55%～72% B；流速10 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm；ELSD檢測(cè)器：漂移管溫度100 ℃，載氣流速27 L·min-1。
24質(zhì)譜條件
電噴霧離子源負(fù)離子檢測(cè)模式，毛細(xì)管電壓30 V，噴霧電壓30 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb，CID碰撞能量35%。一級(jí)掃描分辨率為FWMH 3萬(wàn)；掃描范圍為m/z 100～1 500。流動(dòng)相采用柱后分流方式，進(jìn)入DAD檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器的流動(dòng)相流速為030 mL·min-1，剩余的流動(dòng)相進(jìn)入ELSD檢測(cè)器。
3結(jié)果與分析
31麥冬藥材供試樣品的提取方法優(yōu)選
實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑、溶劑倍量以及提取時(shí)間對(duì)川麥冬中主要成分高異黃酮和甾體皂苷提取率的影響，最終確定以25 mL 70%甲醇超聲提取30 min的供試樣品溶液制備方法。
由于麥冬藥材中含有大量的糖類(lèi)成分，借助于SPE固相萃取不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)選擇性高的提取、分離、濃縮三位一體的過(guò)程，而且可以從供試樣品中除去對(duì)麥冬固有成分分析有干擾的糖類(lèi)物質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用SPE固相萃取法進(jìn)行供試樣品的制備，基于對(duì)糖的去除和目標(biāo)成分的保留效果，最終優(yōu)選了SPE固相萃取處理方法。
32不同干燥方法下川麥冬HPLCMS分析條件的優(yōu)選
實(shí)驗(yàn)中分別考察了流動(dòng)相種類(lèi)、流速、柱溫、洗脫梯度等對(duì)川麥冬中高異黃酮和甾體皂苷類(lèi)成分的分離效果，得到不同干燥方法及鮮品川麥冬藥材的HPLCDAD，HPLCELSD特征圖譜，見(jiàn)圖1，2。同時(shí)，優(yōu)選了LTQOrbitrap高分辨質(zhì)譜的分析條件，從而為后續(xù)的差異性成分結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。
33不同干燥方法下川麥冬藥材差異色譜峰的篩選
川麥冬鮮品與各干燥品均平行測(cè)定3次，采用自動(dòng)積分的方法分別對(duì)4種不同樣品色譜圖中的各色譜峰進(jìn)行積分，并利用變色龍數(shù)據(jù)處理平臺(tái)進(jìn)行色譜峰面積歸一化處理，根據(jù)各成分在檢測(cè)器中的響應(yīng)值，建立tRS（tR：保留時(shí)間；S：峰面積）數(shù)據(jù)集。每個(gè)保留時(shí)間tR下的色譜峰面積S取3次測(cè)定結(jié)果的平均值，以新鮮川麥冬藥材中的色譜信息作為參照，計(jì)算峰面積差異率ω（%）。
ω=|Sx-Sy|/Sx×100%
Sx為tR下新品峰面積平均值；Sy為tR下干燥品峰面積平均值。
由此，篩選出ω≥10%的色譜峰，標(biāo)注為差異色譜峰。結(jié)果，共篩選出36個(gè)差異色譜峰，其中HPLCDAD檢測(cè)結(jié)果中有20個(gè)，見(jiàn)圖1；HPLCELSD檢測(cè)結(jié)果中有16個(gè)，見(jiàn)圖2。
從上述特征圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，不同干燥方法對(duì)川麥冬固有成分有顯著影響。無(wú)論是DAD還是ELSD檢測(cè)結(jié)果，各干燥品在色譜峰數(shù)量和峰面積上有較大差異：與川麥冬鮮品相比，50 ℃烘干樣品的色譜吸收峰數(shù)目與鮮品相當(dāng)，且各吸收峰的峰面積也最為相近；80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥色譜吸收峰偏少，且峰面積與鮮品相比差異較大。這表明，在50 ℃烘干條件下川麥冬藥材不僅能夠較快地得以干燥，且不易發(fā)生固有化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化。
34相關(guān)差異性成分的HPLCLTQOrbitrap結(jié)構(gòu)鑒定
甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)化合物是川麥冬的特征性成分，其基本裂解規(guī)律的相關(guān)研究已較為深入[1317]，可以為甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)差異性成分的結(jié)構(gòu)鑒定提供借鑒。
341高異黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合對(duì)照品裂解方式發(fā)現(xiàn)，高異黃酮與普通黃酮類(lèi)化合物裂解途徑有顯著的差別。高異黃酮類(lèi)化合物一般有2條裂解途徑： ①一般脫去B環(huán)+甲基，產(chǎn)生A環(huán)+C環(huán)的碎片信息。如化合物27，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰m/z 327086 5 [M-H]-（C18H15O6，誤差04），在其二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中會(huì)脫去m/z 121，產(chǎn)生m/z 206 [M-H-C7H6O-CH3]-的碎片離子； ②只脫去B環(huán)，產(chǎn)生A環(huán)+C環(huán)+甲基的碎片信息。例如，化合物14，其準(zhǔn)分子離子峰m/z 299092 5 [M-H]- （C17H15O5，誤差26），在其進(jìn)一步的二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中，能夠產(chǎn)生m/z 203 [M-H-C6H7O]-的特征碎片離子。應(yīng)用HPLCDADMSn技術(shù)，本研究從用不同干燥方法得到的麥冬藥材中共鑒定了13個(gè)差異性高異黃酮類(lèi)成分。其中，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)準(zhǔn)確鑒定了6個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜裂解規(guī)律以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其余7個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測(cè)，見(jiàn)表1。
342甾體皂苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分是川麥冬的另一類(lèi)特征性化學(xué)成分。在負(fù)離子模式下，甾體皂苷類(lèi)成分的ESIMS 譜主要生成 [M-H]-及[M+HCOO]- 的準(zhǔn)分子離子峰。
而它們的多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑也非常相似，均表現(xiàn)為一系列糖殘基（葡萄糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、阿拉伯糖等）的中性丟失，而且不同糖基的裂解順序也不同。其中，對(duì)于糖鏈部分有乙?；〈幕衔铮鋄M-H]-準(zhǔn)分子離子峰在ESIMSn譜中會(huì)產(chǎn)生丟失乙烯酮基的特征碎片，此外還常能檢測(cè)到[M-H-CH2CO-H2O]-的離子碎片。本研究應(yīng)用HPLCELSDMSn從用不同干燥方法得到的川麥冬中共篩選了11個(gè)差異性甾體皂苷類(lèi)成分。根據(jù)上述規(guī)律，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間以及多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)準(zhǔn)確鑒定了5個(gè)甾體皂苷的結(jié)構(gòu)，并對(duì)剩余的6個(gè)甾體皂苷類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷[1821]，見(jiàn)表1。
343其他未被鑒定的差異性成分本實(shí)驗(yàn)中有12個(gè)差異色譜峰未進(jìn)行鑒定：有1個(gè)差異峰只有色譜信息，缺乏準(zhǔn)確的質(zhì)譜信息；7個(gè)差異峰雖然有質(zhì)譜信息但未獲得其多級(jí)信息；4個(gè)差異峰雖然色譜、質(zhì)譜信息完整，但是未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，后續(xù)研究中將對(duì)這些成分進(jìn)行研究。
4討論
麥冬中的兩大類(lèi)特征性成分甾體皂苷和高異黃酮分別在ELSD和DAD檢測(cè)器上有較好的響應(yīng)，因此本研究建立了HPLCDADELSD多檢測(cè)器串聯(lián)的分析方法。例如，利用 DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，表明296 nm下高異黃酮類(lèi)化學(xué)成分的色譜峰信息豐富且分離度良好；當(dāng)ELSD檢測(cè)器的漂移管溫度為100 ℃，載氣流速為27 L·min-1時(shí)，甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分能夠有較好的響應(yīng)值。在此實(shí)驗(yàn)條件下，由于大部分色譜峰都可獲得良好的分離度，可以實(shí)現(xiàn)以上兩大類(lèi)化學(xué)成分的同時(shí)定性和半定量分析。同時(shí)，HPLCLTQOrbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀具有高分離度、高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，并能夠提供精確的化合物相對(duì)分子質(zhì)量信息，可以為本實(shí)驗(yàn)中麥冬差異性成分結(jié)構(gòu)的鑒定提供有力的技術(shù)支撐。
本實(shí)驗(yàn)考察了50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥3 種方式對(duì)麥冬品質(zhì)的影響。對(duì)比多檢測(cè)器串聯(lián)得到的色譜峰信息可以發(fā)現(xiàn)，不同的麥冬干燥方法對(duì)川麥冬固有化學(xué)成分有顯著的影響。其中，50 ℃烘干干燥更有利于麥冬藥材中化學(xué)成分的保留，可作為麥冬藥材適宜的產(chǎn)地干燥加工方法。同時(shí)，根據(jù)高分辨質(zhì)譜儀提供的碎片信息，從不同干燥方法得到的麥冬藥材中篩選了36個(gè)差異性成分，并鑒定了24個(gè)差異性化合物，包括11個(gè)甾體皂苷和13個(gè)高異黃酮類(lèi)成分。其中，川麥冬中甾體皂苷類(lèi)在50 ℃烘干條件下?lián)p失的量要比80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥低，在采用80 ℃干燥時(shí)，該類(lèi)成分的含量明顯下降，變化率大多在25%以上，可能是由于皂苷類(lèi)成分在高溫下容易分解[2223]；而在-70 ℃冷凍干燥條件下，皂苷類(lèi)成分也容易發(fā)生轉(zhuǎn)變，與人參皂苷、梔子苷等化學(xué)成分的轉(zhuǎn)變趨勢(shì)基本一致[22，24]。另外，根據(jù)DAD結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，發(fā)生轉(zhuǎn)變的高異黃酮類(lèi)成分主要為二氫高異黃酮，僅有1個(gè)高異黃酮（11號(hào)峰），可能與高異黃酮具有相對(duì)完整的共軛體系有關(guān)；當(dāng)化合物結(jié)構(gòu)中存在醛基時(shí)，在80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥條件下，化合物的穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生成分的轉(zhuǎn)變（如：25號(hào)峰和36號(hào)峰）。
因此，本研究基本闡明了川麥冬在不同干燥過(guò)程中的甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)化學(xué)成分的變化，可為建立適宜的麥冬藥材產(chǎn)地干燥加工方法提供科學(xué)依據(jù)。
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[責(zé)任編輯丁廣治]
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王菲 尚展鵬++馬志國(guó)++劉思燚 王子健 張加余
[摘要]該研究以川麥冬為研究對(duì)象，考察不同干燥方法對(duì)麥冬藥材中化學(xué)成分的影響。取新鮮川麥冬塊根粗粉，分別采用50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷凍干燥3種方法進(jìn)行干燥處理，應(yīng)用HPLCDADELSDMSn多檢測(cè)器串聯(lián)技術(shù)，篩選鑒定干燥過(guò)程中變化顯著的高異黃酮類(lèi)和甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分。結(jié)果顯示：與新鮮麥冬藥材的HPLC圖相比，50 ℃烘干干燥最能保持藥材固有化學(xué)成分；80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷凍干燥方法則對(duì)化學(xué)成分影響較大；結(jié)合HPLCHRMSn數(shù)據(jù)，最終篩選了36個(gè)差異性成分，并鑒定了其中24個(gè)差異性成分（11個(gè)甾體皂苷和13個(gè)高異黃酮）的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，不同干燥方法對(duì)川麥冬中甾體皂苷和高異黃酮有明顯影響；從成本、成分含量和實(shí)用性綜合分析，50 ℃烘干干燥更有利于川麥冬藥材中固有成分的保留，可以為川麥冬藥材的產(chǎn)地干燥加工提供借鑒。
[關(guān)鍵詞]川麥冬； 甾體皂苷； 高異黃酮； 干燥方法； HPLCUVELSDMSn
Influence of different drying methods on steroidal saponins and
homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus
WANG Fei1， SHANG Zhanpeng1， MA Zhiguo2， LIU Siyi1， WANG Zijian3， ZHANG Jiayu3*， LU Jianqiu4*
（1School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；
2College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China；
3Beijing Institution of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；
4Library of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
[Abstract]To study the influence of three different drying methods （including 50 ℃drying， 80 ℃drying and -70 ℃freezedrying methods） on steroidal saponins and homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus，a HPLCDADELSDMSn method was investigated to screen and identify the differential components Through comparing the HPLC chromatograms with that of fresh O japonicus， 50 ℃drying medicine was similar with fresh medicine whereas the other two drying methods had great influence on the components of O japonicus In this study， 36 differential components were screened， among which 24 constituents（13 homoisoflavonoids and 11 steroidal saponins） were identified via HPLCLTQOrbitrap MSAs a result， it was revealed that different drying methods had significant influences on the components of steroidal saponins and homoisoflavonoids Among them， 50 ℃drying method was the most suitable drying approach when the stability of components， cost and practicability were considered
[Key words]Ophiopogon japonicus； steroidal saponins； homoisoflavonoids； drying methods； HPLCDADELSDMSn
doi：10.4268/cjcmm20162317
麥冬Ophiopogon japonicas （Lf） KerGawl為百合科植物麥冬的干燥塊根，主產(chǎn)于四川、浙江等地，故有川麥冬和杭麥冬之分[1]。麥冬為常用滋陰中藥，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心之功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，麥冬具有顯著的耐缺氧、改善心血管、抗癌、降血糖等活性[35]。
藥材產(chǎn)地干燥加工是中藥生產(chǎn)與品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，其間可能會(huì)發(fā)生成分相互轉(zhuǎn)化[6]。2015年版《中國(guó)藥典》中雖規(guī)定了麥冬的產(chǎn)地加工干燥方法，但未見(jiàn)具體干燥方法、干燥溫度等詳細(xì)參數(shù)[7]。目前，有文獻(xiàn)報(bào)道不同干燥方法對(duì)麥冬品質(zhì)的影響[810]，但僅局限于對(duì)特定主要活性成分的定量研究，并未系統(tǒng)研究差異性化學(xué)成分。因此，本研究應(yīng)用HPLCDADELSDMSn多檢測(cè)器串聯(lián)技術(shù)，對(duì)不同干燥方法下川麥冬差異性甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)成分進(jìn)行篩選鑒定，探討不同干燥方法對(duì)藥材中化學(xué)成分的影響，以期為川麥冬藥材產(chǎn)地干燥加工提供科學(xué)依據(jù)。
1材料
川麥冬鮮品于2016年春季采于四川雅安，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)譚鵬副教授鑒定為百合科植物川麥冬O japonicus的新鮮塊根。采收后，選擇個(gè)體完整、色澤鮮艷的新鮮麥冬，除去須根，以清水洗去表面雜質(zhì)，用保鮮塑料膜密封，置于冰箱內(nèi)4 ℃低溫保存。
高異黃酮類(lèi)對(duì)照品（5，7，4′三羥基6甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、5，7，2′三羥基4′甲氧基6，8二甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮E）和甾體皂苷類(lèi)對(duì)照品（ophiopojaponin C， 14hydroxysprengerinin C， ophiopogonin D′， ophiopogonin D， pennogenin 3O[αLrha（1→2）][βDxyl（1→4）]βDglc）均為本課題組前期從川麥冬藥材中分離得到[1112]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR， 13CNMR等手段得以確定，經(jīng)HPLC歸一化法檢測(cè)，純度均≥95%。所用色譜級(jí)乙腈和甲醇均購(gòu)于Fisher Scientific （Fair Lawn，USA），甲酸購(gòu)于Sigma Aldrich （StLouis，USA），其余試劑均為分析純。
Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000（德國(guó)Thermo公司），配有DAD檢測(cè)器（德國(guó)Thermo公司）、ELSD 6000ES檢測(cè)器（美國(guó)Alltech公司）、HPLCLTQOrbitrap XL質(zhì)譜檢測(cè)器（德國(guó)Thermo公司）；Xcalibur 21工作站（美國(guó)Thermo Scientific公司）；變色龍70工作站（美國(guó)Thermo Scientific公司）；R200D型電子分析天平（1/10萬(wàn)，德國(guó)Sartorius公司）；MilliQ Synthesis超純水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京惠誠(chéng)佳儀科技有限公司）等。
2方法
21不同干燥方法下的川麥冬樣品制備
取新鮮川麥冬藥材洗凈擦干，混勻，稱(chēng)取3份，每份約20 g，分別進(jìn)行50 ℃烘干、80 ℃烘干干燥和真空冷凍干燥（-70 ℃）。干燥指標(biāo)：按照2015年版《中國(guó)藥典》一部附錄規(guī)定的水分測(cè)定，樣品連續(xù)2次干燥后的質(zhì)量差異在5 mg以下。①50 ℃烘干：將新鮮川麥冬藥材均勻放在電熱恒溫干燥箱中，50 ℃鼓風(fēng)干燥； ②80 ℃烘干：將新鮮川麥冬藥材均勻放在電熱恒溫干燥箱中，80 ℃鼓風(fēng)干燥； ③冷凍干燥：將新鮮川麥冬藥材放入超低溫冰箱中冷凍24 h，再放入冷凍干燥機(jī)中，真空度10 Pa，-70 ℃干燥。經(jīng)準(zhǔn)確稱(chēng)量計(jì)算后分別得到10021 1，9206 4，8013 2 g的干燥后藥材，備用。
22不同干燥方法下川麥冬供試液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
將干燥后的麥冬藥材粉碎，分別稱(chēng)取步驟21項(xiàng)中各干燥品2459 3 g（50 ℃）， 2278 6 g（80 ℃）， 2012 1g（凍干）以及鮮品5014 4 g（注：各藥材取樣量按照干燥得率計(jì)算，誤差均嚴(yán)格控制在1%以內(nèi)，以消除取樣誤差對(duì)峰面積差異的影響），加70%甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，50 ℃水浴蒸至近干，加水2 mL使溶解，通過(guò)預(yù)平衡過(guò)的SPE（Solid Phase Extraction）固相萃取C18Low小柱（1667 g·L-150 pk，美國(guó)Grace公司），分別以2 mL水、2 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，以022 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。
分別取上述各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解至01 g·L-1作為儲(chǔ)備液，進(jìn)樣前適當(dāng)稀釋后使用。
23液相色譜條件
色譜柱ZorbaxSBAq C18色譜柱（46 mm×150 mm，35 μm）；流動(dòng)相A 為01%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈甲醇（3∶1）；梯度洗脫：0～3 min，5%～10% B；3～6 min，10%～21% B；6～18 min，21%～26% B；18～40 min，26%～51% B；40～58 min，51%～55% B；58～60 min，55%～72% B；流速10 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm；ELSD檢測(cè)器：漂移管溫度100 ℃，載氣流速27 L·min-1。
24質(zhì)譜條件
電噴霧離子源負(fù)離子檢測(cè)模式，毛細(xì)管電壓30 V，噴霧電壓30 kV，毛細(xì)管溫度350 ℃，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb，CID碰撞能量35%。一級(jí)掃描分辨率為FWMH 3萬(wàn)；掃描范圍為m/z 100～1 500。流動(dòng)相采用柱后分流方式，進(jìn)入DAD檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器的流動(dòng)相流速為030 mL·min-1，剩余的流動(dòng)相進(jìn)入ELSD檢測(cè)器。
3結(jié)果與分析
31麥冬藥材供試樣品的提取方法優(yōu)選
實(shí)驗(yàn)分別考察了提取溶劑、溶劑倍量以及提取時(shí)間對(duì)川麥冬中主要成分高異黃酮和甾體皂苷提取率的影響，最終確定以25 mL 70%甲醇超聲提取30 min的供試樣品溶液制備方法。
由于麥冬藥材中含有大量的糖類(lèi)成分，借助于SPE固相萃取不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)選擇性高的提取、分離、濃縮三位一體的過(guò)程，而且可以從供試樣品中除去對(duì)麥冬固有成分分析有干擾的糖類(lèi)物質(zhì)。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用SPE固相萃取法進(jìn)行供試樣品的制備，基于對(duì)糖的去除和目標(biāo)成分的保留效果，最終優(yōu)選了SPE固相萃取處理方法。
32不同干燥方法下川麥冬HPLCMS分析條件的優(yōu)選
實(shí)驗(yàn)中分別考察了流動(dòng)相種類(lèi)、流速、柱溫、洗脫梯度等對(duì)川麥冬中高異黃酮和甾體皂苷類(lèi)成分的分離效果，得到不同干燥方法及鮮品川麥冬藥材的HPLCDAD，HPLCELSD特征圖譜，見(jiàn)圖1，2。同時(shí)，優(yōu)選了LTQOrbitrap高分辨質(zhì)譜的分析條件，從而為后續(xù)的差異性成分結(jié)構(gòu)鑒定提供依據(jù)。
33不同干燥方法下川麥冬藥材差異色譜峰的篩選
川麥冬鮮品與各干燥品均平行測(cè)定3次，采用自動(dòng)積分的方法分別對(duì)4種不同樣品色譜圖中的各色譜峰進(jìn)行積分，并利用變色龍數(shù)據(jù)處理平臺(tái)進(jìn)行色譜峰面積歸一化處理，根據(jù)各成分在檢測(cè)器中的響應(yīng)值，建立tRS（tR：保留時(shí)間；S：峰面積）數(shù)據(jù)集。每個(gè)保留時(shí)間tR下的色譜峰面積S取3次測(cè)定結(jié)果的平均值，以新鮮川麥冬藥材中的色譜信息作為參照，計(jì)算峰面積差異率ω（%）。
ω=|Sx-Sy|/Sx×100%
Sx為tR下新品峰面積平均值；Sy為tR下干燥品峰面積平均值。
由此，篩選出ω≥10%的色譜峰，標(biāo)注為差異色譜峰。結(jié)果，共篩選出36個(gè)差異色譜峰，其中HPLCDAD檢測(cè)結(jié)果中有20個(gè)，見(jiàn)圖1；HPLCELSD檢測(cè)結(jié)果中有16個(gè)，見(jiàn)圖2。
從上述特征圖譜中可以發(fā)現(xiàn)，不同干燥方法對(duì)川麥冬固有成分有顯著影響。無(wú)論是DAD還是ELSD檢測(cè)結(jié)果，各干燥品在色譜峰數(shù)量和峰面積上有較大差異：與川麥冬鮮品相比，50 ℃烘干樣品的色譜吸收峰數(shù)目與鮮品相當(dāng)，且各吸收峰的峰面積也最為相近；80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥色譜吸收峰偏少，且峰面積與鮮品相比差異較大。這表明，在50 ℃烘干條件下川麥冬藥材不僅能夠較快地得以干燥，且不易發(fā)生固有化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化。
34相關(guān)差異性成分的HPLCLTQOrbitrap結(jié)構(gòu)鑒定
甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)化合物是川麥冬的特征性成分，其基本裂解規(guī)律的相關(guān)研究已較為深入[1317]，可以為甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)差異性成分的結(jié)構(gòu)鑒定提供借鑒。
341高異黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合對(duì)照品裂解方式發(fā)現(xiàn)，高異黃酮與普通黃酮類(lèi)化合物裂解途徑有顯著的差別。高異黃酮類(lèi)化合物一般有2條裂解途徑： ①一般脫去B環(huán)+甲基，產(chǎn)生A環(huán)+C環(huán)的碎片信息。如化合物27，在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰m/z 327086 5 [M-H]-（C18H15O6，誤差04），在其二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中會(huì)脫去m/z 121，產(chǎn)生m/z 206 [M-H-C7H6O-CH3]-的碎片離子； ②只脫去B環(huán)，產(chǎn)生A環(huán)+C環(huán)+甲基的碎片信息。例如，化合物14，其準(zhǔn)分子離子峰m/z 299092 5 [M-H]- （C17H15O5，誤差26），在其進(jìn)一步的二級(jí)質(zhì)譜裂解過(guò)程中，能夠產(chǎn)生m/z 203 [M-H-C6H7O]-的特征碎片離子。應(yīng)用HPLCDADMSn技術(shù)，本研究從用不同干燥方法得到的麥冬藥材中共鑒定了13個(gè)差異性高異黃酮類(lèi)成分。其中，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)準(zhǔn)確鑒定了6個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合保留時(shí)間、質(zhì)譜裂解規(guī)律以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其余7個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推測(cè)，見(jiàn)表1。
342甾體皂苷類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分是川麥冬的另一類(lèi)特征性化學(xué)成分。在負(fù)離子模式下，甾體皂苷類(lèi)成分的ESIMS 譜主要生成 [M-H]-及[M+HCOO]- 的準(zhǔn)分子離子峰。
而它們的多級(jí)質(zhì)譜裂解途徑也非常相似，均表現(xiàn)為一系列糖殘基（葡萄糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、阿拉伯糖等）的中性丟失，而且不同糖基的裂解順序也不同。其中，對(duì)于糖鏈部分有乙?；〈幕衔铮鋄M-H]-準(zhǔn)分子離子峰在ESIMSn譜中會(huì)產(chǎn)生丟失乙烯酮基的特征碎片，此外還常能檢測(cè)到[M-H-CH2CO-H2O]-的離子碎片。本研究應(yīng)用HPLCELSDMSn從用不同干燥方法得到的川麥冬中共篩選了11個(gè)差異性甾體皂苷類(lèi)成分。根據(jù)上述規(guī)律，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間以及多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)準(zhǔn)確鑒定了5個(gè)甾體皂苷的結(jié)構(gòu)，并對(duì)剩余的6個(gè)甾體皂苷類(lèi)成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推斷[1821]，見(jiàn)表1。
343其他未被鑒定的差異性成分本實(shí)驗(yàn)中有12個(gè)差異色譜峰未進(jìn)行鑒定：有1個(gè)差異峰只有色譜信息，缺乏準(zhǔn)確的質(zhì)譜信息；7個(gè)差異峰雖然有質(zhì)譜信息但未獲得其多級(jí)信息；4個(gè)差異峰雖然色譜、質(zhì)譜信息完整，但是未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，后續(xù)研究中將對(duì)這些成分進(jìn)行研究。
4討論
麥冬中的兩大類(lèi)特征性成分甾體皂苷和高異黃酮分別在ELSD和DAD檢測(cè)器上有較好的響應(yīng)，因此本研究建立了HPLCDADELSD多檢測(cè)器串聯(lián)的分析方法。例如，利用 DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描分析，表明296 nm下高異黃酮類(lèi)化學(xué)成分的色譜峰信息豐富且分離度良好；當(dāng)ELSD檢測(cè)器的漂移管溫度為100 ℃，載氣流速為27 L·min-1時(shí)，甾體皂苷類(lèi)化學(xué)成分能夠有較好的響應(yīng)值。在此實(shí)驗(yàn)條件下，由于大部分色譜峰都可獲得良好的分離度，可以實(shí)現(xiàn)以上兩大類(lèi)化學(xué)成分的同時(shí)定性和半定量分析。同時(shí)，HPLCLTQOrbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀具有高分離度、高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，并能夠提供精確的化合物相對(duì)分子質(zhì)量信息，可以為本實(shí)驗(yàn)中麥冬差異性成分結(jié)構(gòu)的鑒定提供有力的技術(shù)支撐。
本實(shí)驗(yàn)考察了50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥3 種方式對(duì)麥冬品質(zhì)的影響。對(duì)比多檢測(cè)器串聯(lián)得到的色譜峰信息可以發(fā)現(xiàn)，不同的麥冬干燥方法對(duì)川麥冬固有化學(xué)成分有顯著的影響。其中，50 ℃烘干干燥更有利于麥冬藥材中化學(xué)成分的保留，可作為麥冬藥材適宜的產(chǎn)地干燥加工方法。同時(shí)，根據(jù)高分辨質(zhì)譜儀提供的碎片信息，從不同干燥方法得到的麥冬藥材中篩選了36個(gè)差異性成分，并鑒定了24個(gè)差異性化合物，包括11個(gè)甾體皂苷和13個(gè)高異黃酮類(lèi)成分。其中，川麥冬中甾體皂苷類(lèi)在50 ℃烘干條件下?lián)p失的量要比80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥低，在采用80 ℃干燥時(shí)，該類(lèi)成分的含量明顯下降，變化率大多在25%以上，可能是由于皂苷類(lèi)成分在高溫下容易分解[2223]；而在-70 ℃冷凍干燥條件下，皂苷類(lèi)成分也容易發(fā)生轉(zhuǎn)變，與人參皂苷、梔子苷等化學(xué)成分的轉(zhuǎn)變趨勢(shì)基本一致[22，24]。另外，根據(jù)DAD結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，發(fā)生轉(zhuǎn)變的高異黃酮類(lèi)成分主要為二氫高異黃酮，僅有1個(gè)高異黃酮（11號(hào)峰），可能與高異黃酮具有相對(duì)完整的共軛體系有關(guān)；當(dāng)化合物結(jié)構(gòu)中存在醛基時(shí)，在80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥條件下，化合物的穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生成分的轉(zhuǎn)變（如：25號(hào)峰和36號(hào)峰）。
因此，本研究基本闡明了川麥冬在不同干燥過(guò)程中的甾體皂苷和高異黃酮類(lèi)化學(xué)成分的變化，可為建立適宜的麥冬藥材產(chǎn)地干燥加工方法提供科學(xué)依據(jù)。
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[責(zé)任編輯丁廣治]
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