石群，張慶芳，楊麗娜，王曉輝，竇少華，遲乃玉*

海洋肌酐水解酶菌株的篩選鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究

石群1，2，張慶芳1，2，楊麗娜1，2，王曉輝1，2，竇少華1，2，遲乃玉1，2*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

從渤海海泥中篩選出一株肌酐水解酶高產(chǎn)菌株S-09，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征并結(jié)合16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株為微小桿菌屬(Exiguobacteriumsp.)。對(duì)所產(chǎn)肌酐水解酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究表明，該酶的最適作用溫度為30℃，熱穩(wěn)定性較差；最適作用pH值為7.5，堿性條件下，pH值穩(wěn)定性較好；Co2+、Mn2+對(duì)酶的激活作用較強(qiáng)，Ag+、Hg2+對(duì)酶有顯著的抑制作用。

海洋；肌酐水解酶；菌株篩選；鑒定；酶學(xué)性質(zhì)

肌酐（creatinine）是一種低分子質(zhì)量的含氮化合物，是肌酸代謝的終末產(chǎn)物[1]。它僅僅由腎小球排泄，不被腎小管重吸收，所以血清中肌酐濃度主要與腎小球?yàn)V過率相關(guān)，如果肌酐值超過707 μmol/L就被診斷為尿毒癥，因而血清中的肌酐濃度是一項(xiàng)判斷腎功能的重要指標(biāo)[2-3]。目前肌酐的檢測(cè)方法主要有化學(xué)法和酶促法[4]?；瘜W(xué)方法專一性不強(qiáng)、敏感性差、易受樣品干擾，而酶促法具有專一性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)[5-6]，因而備受國際臨床化學(xué)聯(lián)盟與我國臨床檢驗(yàn)中心重視并逐漸成為臨床主要檢測(cè)方法[7]。肌酐水解酶（creatininase）EC 3.5.2.10作為酶促檢測(cè)法中的關(guān)鍵酶之一，其性能的好壞直接影響到測(cè)定系統(tǒng)的可靠性[8]。但是直到目前，我國仍沒有自主研制的肌酐測(cè)定的工具酶，原酶生產(chǎn)技術(shù)不成熟及臨床所用的檢測(cè)試劑盒也主要依賴進(jìn)口[9-10]，并且鮮見從海洋中篩選產(chǎn)肌酐水解酶的菌株的相關(guān)報(bào)道和研究。為了推廣酶促法檢測(cè)肌酐，降低檢測(cè)成本，為臨床診斷提供可靠的依據(jù)，針對(duì)國內(nèi)這個(gè)幾乎空白的市場(chǎng)，本實(shí)驗(yàn)利用海洋這個(gè)巨大的資源篩選獲得高產(chǎn)肌酐水解酶的菌株S-09，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，進(jìn)而確定其種屬并研究酶學(xué)性質(zhì)，為研究海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)肌酐水解酶進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肌酐水解酶的國產(chǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

試驗(yàn)菌株篩選自渤海海域（123°371′E，39°6972′N）海泥樣品，經(jīng)鑒定為微小桿菌屬（Exiguobacteriumsp.），命名為S-09，現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：肌酐1%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2%，K2HPO40.2%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.01%，KCl 0.005%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基[11]：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2%，NaCl 1%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：肌酐0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.05%，KCl0.05%，水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；肌酐、肌酸：大連凱美化工工程配套有限公司；苦味酸：生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CX21FS3顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-H232可見紫外分光光度計(jì)：菲迪康樂（廣州）科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株初篩

取10 g海泥加入90 mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩30 min。用無菌水從10-1依次梯度稀釋至10-7，分別取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度樣品各0.1 mL，均勻涂布于初篩培養(yǎng)基上，25℃倒置培養(yǎng)。挑取能夠在初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，結(jié)合菌落形態(tài)與顯微鏡觀察，純化得到菌株于LB培養(yǎng)基，4℃保藏。

1.3.2 菌株復(fù)篩

將初篩獲得的菌株接入種子培養(yǎng)基中在25℃、200r/min培養(yǎng)24 h，按5%的接種量轉(zhuǎn)入相同種子培養(yǎng)基中，25℃、200r/min培養(yǎng)24h，按5%的接種量接種于初始發(fā)酵培養(yǎng)基，25℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。通過測(cè)定發(fā)酵液肌酐水解酶活，篩選出肌酐水解酶活高的菌株作為目的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 菌株鑒定

（1）細(xì)菌形態(tài)觀察

在初篩培養(yǎng)基上觀察菌落的形狀、大小、顏色等形態(tài)學(xué)特征，通過革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡（10×100）下觀察菌體形態(tài)。

（2）菌株生理生化特征鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。主要包括葡萄糖氧化發(fā)酵測(cè)定、氧化酶反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、產(chǎn)生吲哚試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生、含碳化合物的利用、檸檬酸鹽的利用。

（3）16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列分析

采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。以提取到的菌株S-09 DNA為模板，以16S rDNA基因通用引物對(duì)16S rDNA序列片段進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。其引物如下：正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。擴(kuò)增后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，根據(jù)分析結(jié)果對(duì)菌株S-09進(jìn)行種屬鑒定，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 肌酐水解酶活測(cè)定方法[13-14]

取0.1 mL的酶液加入0.9 mL肌酸溶液中，37℃反應(yīng)10 min后取出0.1 mL反應(yīng)液加入1 mol/L NaOH和0.5%苦味酸（各1 mL）終止反應(yīng)，加入0.9 mL蒸餾水，于25℃水浴鍋水浴20 min后于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度值。肌酐水解酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 μmol肌酐轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 粗酶液的制備

將純化后的菌株S-09接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h。發(fā)酵菌液于4℃、4000r/min離心30min得到菌體，用超純水將菌體水洗2次，4℃、4000r/min離心30min。將離心得到的濕菌體用0.1 mol/L pH 7.5的磷酸緩沖液溶解。冰浴條件下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂菌（作用3s，間隔3s，120W，共10min）。低溫（4℃）10 000 r/min離心10 min收集上清液即為肌酐水解酶粗酶液。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

（1）酶最適反應(yīng)溫度

取一定量酶液，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃條件下，測(cè)定肌酐水解酶酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中保存30 min立即冷卻，并測(cè)定肌酐水解酶酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（3）酶最適作用pH

在酶最適作用溫度下，分別在pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的磷酸鹽緩沖液反應(yīng)體系中測(cè)定肌酐水解酶酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（4）酶的pH穩(wěn)定性

在pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的磷酸鹽緩沖液中加入酶液，于25℃保溫24 h，測(cè)定肌酐水解酶酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（5）不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活性的影響

以不添加任何化學(xué)物質(zhì)的發(fā)酵液為對(duì)照，在發(fā)酵液中加入不同化學(xué)物質(zhì)，于25℃處理30 min，使ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CoCl·6H2O、MnCl2·4H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O、CrCl2·6H2O、HgCl2、AgNO3終濃度均為1mmol/L，鰲合劑乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）終濃度為20 mmol/L，表面活性劑Tween-20 0.1%及TtritonX-100 0.5%，測(cè)定肌酐水解酶活力，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及形態(tài)特征

對(duì)渤海海域海泥進(jìn)行初篩和復(fù)篩，得到9株具有肌酐水解酶活性的菌株。從中獲得一株高產(chǎn)肌酐水解酶菌株，該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶穩(wěn)定，命名為S-09。其菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果見圖1。

圖1 菌株S-09菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果Fig.1 Colonial morphology and gram staining results of strain S-09

由圖1可知，該菌株在LB培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)18～36 h，菌落呈淡橙色、圓形、平坦、不生孢、不透明，革蘭氏染色呈陽性。菌株S-09幼齡細(xì)胞為桿狀，常呈V形排列，老齡細(xì)胞呈球狀。細(xì)胞培養(yǎng)過程中有明顯的桿、球狀周期變化。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（第8版）對(duì)菌株S-09進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 菌株S-09的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain S-09

由表1可知，菌株S-09生理生化特征如下：好氧，氧化酶、脲酶試驗(yàn)呈陰性，過氧化氫酶、硝酸鹽還原、接觸酶均呈陽性。利用葡萄糖不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能利用多種含碳化合物如檸檬酸鈉、乙酸鈉等。能利用多種碳水化合物如D-果糖、甘露醇、葡萄糖、D-木糖。不能利用L-山梨糖和棉子糖。

2.3 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株S-09經(jīng)PCR擴(kuò)增電泳，結(jié)果見圖2。鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果見圖3。

圖2 菌株S-09的16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 16S rDNA PCR amplification results of strain S-09

由圖2可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為1 516 bp。由圖3可知，該菌株與Exiguobacteriumsp.9AN NR 114970.1同源性較高，相似度為99%，結(jié)合菌體形態(tài)特征和16S rDNA的序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定該菌株屬于微小桿菌屬（Exiguobacteriumsp.）。

2.4酶學(xué)性質(zhì)初步研究

2.4.1 酶作用的最適溫度

由圖4可知，肌酐水解酶最適作用溫度為30℃。該酶在25～35℃低溫環(huán)境下能保持較高水平的酶活，符合低溫酶性質(zhì)[15]。這對(duì)于縮短反應(yīng)時(shí)間、降低開發(fā)成本具有重要意義。

圖4 酶最適作用溫度曲線Fig.4 Optimal temperature curve of creatininase

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性

將酶液在不同溫度下處理30 min后測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖5。由圖5可知，該酶在30～50℃處理30min后保持較高酶活且相對(duì)穩(wěn)定。在60℃處理30 min后，相對(duì)酶活為70%；65℃處理30 min后，相對(duì)酶活僅為45%，說明該酶熱穩(wěn)定性較差。

圖5 酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of the creatininase

2.4.3 酶作用的最適pH及穩(wěn)定性

圖6 酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性曲線Fig.6 Optimal pH and pH stability curve of creatininase

由圖6可知，肌酐水解酶的最適作用pH值為7.5。在pH值＞8.0時(shí)，相對(duì)酶活呈下降趨勢(shì)；當(dāng)pH值為7.0～8.0時(shí)，該酶的相對(duì)酶活能保存80%以上，說明該酶在偏堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較好。因此，選擇pH 7.5作為最佳保藏的pH值。

2.4.4 不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活性的影響

以不添加任何化學(xué)物質(zhì)的發(fā)酵液為對(duì)照，在發(fā)酵液中加入不同化學(xué)物質(zhì)，于25℃處理30 min，使ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CoCl·6H2O、MnCl2·4H2O、CuSO4·5H2O、MgSO4·7H2O、CrCl2·6H2O、HgCl2、AgNO3終濃度均為1 mmol/L，鰲合劑EDTA終濃度為20 mmol/L，表面活性劑Tween-200.1%及TtritonX-1000.5%，測(cè)定肌酐水解酶活力，結(jié)果見表2。

表2 不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活性的影響Table 2 Effect of different chemical substances on creatininase activity

由表2可知，Ag+、Hg2+幾乎能使酶完全喪失失活；Co2+、Mn2+對(duì)酶的激活作用較強(qiáng)；Cr2+、EDTA、Triton X-100、表面活性劑Tween-20對(duì)酶有較弱的抑制作用；Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mg2+對(duì)酶幾乎無影響。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)共從渤海海域的海泥中篩選出9株產(chǎn)肌酐水解酶的菌株，并選中一株酶活較高的菌株命名為S-09，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rDNA序列分析，鑒定菌株S-09為微小桿菌屬。菌株S-09與國內(nèi)外篩選的其他產(chǎn)肌酐水解酶的菌株相比[16]，具有最適生長(zhǎng)溫度低（25℃）、高耐壓能力（菌株篩選深度＞100 m）、原始菌株產(chǎn)酶活力高等優(yōu)點(diǎn)。菌株S-09作為一株產(chǎn)肌酐水解酶的新菌源，具有潛在的開發(fā)價(jià)值。對(duì)其所產(chǎn)的肌酐水解酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明，該酶的最適作用溫度為30℃；酶的最適作用pH值為7.5；酶的作用溫度較低，屬于低溫酶類。海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫肌酐水解酶具有很大優(yōu)勢(shì)，肌酐水解酶在低溫下具有高酶活力及高催化效率，在應(yīng)用中能減少工藝流程可大大縮短處理時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用[17-18]。海洋肌酐水解酶的研究，為實(shí)現(xiàn)我國自主研發(fā)的肌酐檢測(cè)試劑盒并將其商品化拓寬了應(yīng)用前景。后續(xù)關(guān)于該酶的分離純化及工業(yè)發(fā)酵等試驗(yàn)還在進(jìn)一步深入探究中。

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Screening and identification of creatininase-producing strain from marine and its enzymatic properties

SHI Qun1,2,ZHANG Qingfang1,2,YANG Lina1,2,WANG Xiaohui1,2,DOU Shaohua1,2,CHI Naiyu1,2*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center,Dalian 116622,China)

A high creatininase-producing strain S-09 was screened from the Bohai Sea mud,and identified asExiguobacteriumsp.by morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA phylogenetic analysis.The research of enzymatic properties of creatininase showed that the optimal temperature was 30℃,the thermostability was weaker;the optimal pH was 7.5,pH stability was better in alkaline condition;the activation of Co2+and Mn2+on creatininase was stronger,the Ag+and Hg2+had significant inhibitory effect on creatininase.

marine;creatininase;strain screening;identification;enzymatic characteristics

Q93

0254-5071（2017）03-0019-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.005

2017-02-08

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA021306）；遼寧省自然科學(xué)基金（NO.2050775）

石群（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶工程。

*通訊作者：遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶工程。