劉秋紅，鄒 穎，王 博，李紅云，李紅玲

（1.湖南省婦幼保健院，長(zhǎng)沙410008；2.湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410002）

VEGF與MMP-2在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜-肌層界面的表達(dá)及意義

劉秋紅1，鄒 穎1，王 博2，李紅云1，李紅玲2

（1.湖南省婦幼保健院，長(zhǎng)沙410008；2.湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410002）

目的：探討血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase -2，MMP-2）在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜-肌層界面（endometrial-myometrial interface，EMI）的表達(dá)及意義。方法：采用免疫組化ElivisiongTMSuper法對(duì)40 例子宮腺肌病患者（觀察組）子宮內(nèi)膜（含部分肌層）和對(duì)照組40 例子宮肌瘤患者子宮內(nèi)膜（含部分肌層）的組織進(jìn)行標(biāo)記、檢測(cè)并比較。結(jié)果：觀察組增生期及分泌期EMI處VEGF、MMP-2的表達(dá)均顯著高于遠(yuǎn)肌層，且顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：子宮腺肌病患者EMI處VEGF的高表達(dá)，可促使異位內(nèi)膜及其周?chē)友苌?，而EMI處MMP- 2的過(guò)度表達(dá)與子宮腺肌病內(nèi)膜組織侵襲力和平滑肌大量增生有關(guān)，二者可能在子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。

子宮內(nèi)膜-肌層界面；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；子宮腺肌??；免疫組化

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集湖南省人民醫(yī)院2008年1月～2011年12月間因子宮腺肌病行子宮切除的40例患者的子宮內(nèi)膜（含部分肌層）標(biāo)本作為觀察組，取因子宮肌瘤行子宮切除的40例患者的子宮內(nèi)膜（含部分肌層）標(biāo)本作為對(duì)照組。每組增生期、分泌期各20例。觀察組平均年齡43歲，對(duì)照組平均年齡45歲，兩組患者年齡無(wú)差異。所有病例術(shù)前3月內(nèi)無(wú)任何激素治療史。

1.2 方法 所有的標(biāo)本用10 %甲醛固定，石蠟包埋，5μm 切片，行免疫組化染色。鼠抗人VEGF單克隆抗體、即用型非生物素免疫組化ElivisiongTMSuper檢測(cè)試劑盒、DAB染色液均購(gòu)自福州麥新公司。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 免疫組化分析及結(jié)果判斷 免疫組化染色結(jié)果的評(píng)分按照參考文獻(xiàn)［4］評(píng)分方法，陽(yáng)性染色為細(xì)胞漿中出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺分級(jí)：（1）無(wú)細(xì)胞顯色為0；＜ 25 %細(xì)胞顯色為1；25 %～50 %細(xì)胞顯色為2；51 %～75 %細(xì)胞顯色為3；＞ 75 %細(xì)胞顯色為4；（2）不顯色或顯色不清為0；淺黃色為1；棕黃色為2；棕褐色為3；（3）兩項(xiàng)的乘積；0 分為陰性（-）；1～4 分為弱陽(yáng)性（+）；5～8 分為中度陽(yáng)性（+ +）；9～12 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+ + +）。陽(yáng)性率=陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，兩樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)檢驗(yàn)采用Spearman法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF的表達(dá)情況 VEGF陽(yáng)性的表達(dá)產(chǎn)物均定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中，呈淡黃色、棕黃色、棕褐色等不同強(qiáng)度染色。觀察組和對(duì)照組增生期、分泌期EMI處VEGF的表達(dá)強(qiáng)度高于遠(yuǎn)肌層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。觀察組增生期及分泌期在EMI處VEGF的表達(dá)強(qiáng)度高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。觀察組與對(duì)照組在遠(yuǎn)處肌層VEGF的表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組不同部位VEGF水平比較［例（%）］

2.2 MMP-2的表達(dá)情況 MMP-2蛋白免疫組化顯色主要位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的胞漿內(nèi)，呈棕黃色。觀察組和對(duì)照組增生期、分泌期EMI處MMP-2的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于遠(yuǎn)肌層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。觀察組增生期、分泌期在EMI處MMP-2的表達(dá)高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。觀察組與對(duì)照組在遠(yuǎn)處肌層MMP-2的表達(dá)比較無(wú)顯著性差異。（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組不同部位MMP-2水平比較 ［例（%）］

2.3 VEGF與MMP- 2表達(dá)的相關(guān)性分析 在腺肌病組增生期及分泌期EMI處VEGF與MMP- 2表達(dá)的相關(guān)系數(shù)r分別為0.457和0.488，P均 ＜ 0.05，說(shuō)明兩因子表達(dá)呈正相關(guān)。

3 討論

3.1 VEGF在子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制中的作用 VEGF是血小板生長(zhǎng)因子超家族的重要成員，是目前已知作用最強(qiáng)、最重要的促血管生成因子。它是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，能直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)和其特異性受體結(jié)合，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的生成，并可增加血管通透性，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)，從而更有利于血管生成。其表達(dá)高低反映了該組織的血管生成的活性。研究［5］表明，子宮腺肌病患者VEGF表達(dá)的相對(duì)增強(qiáng)使子宮腺肌病患者在位、異位子宮內(nèi)膜的血管形成能力大于正常婦女。近年來(lái)對(duì)于EMI的研究日益增多，對(duì)其與各種疾病發(fā)生的認(rèn)識(shí)也越發(fā)深刻，比較成熟的觀點(diǎn)認(rèn)為子宮結(jié)合帶結(jié)構(gòu)和功能的異常與子宮腺肌病的發(fā)生關(guān)系密切。有研究表明子宮腺肌病患者EMI處肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)缺乏周期性、規(guī)律性變化，不同于正常子宮［6］。Ibrahim MG等［7］用電子顯微鏡及免疫組化證實(shí)子宮腺肌病EMI處肌纖維混亂，并且核膜不規(guī)則，存在超微創(chuàng)傷。并且子宮缺乏粘膜下層［8］，因此粘膜向肌層侵入的屏障作用較弱，EMI易被破壞。賈喜菲等［9］研究發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤合并子宮腺肌病的子宮結(jié)合帶部位肌細(xì)胞功能減退及間隙連接蛋白43（connexin43，Cx43）的低表達(dá)可能與子宮肌瘤合并子宮腺肌病的發(fā)病有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)觀察組增生期和分泌期EMI處VEGF的表達(dá)高于對(duì)照組，提示在整個(gè)月經(jīng)周期中，EMI處子宮內(nèi)膜中VEGF均可使子宮內(nèi)膜間質(zhì)血管滲透性增加，導(dǎo)致間質(zhì)水腫和纖維素沉積，并可以誘導(dǎo)血管生成，促進(jìn)并維持異位病灶及其周?chē)M織的血管活性，為子宮內(nèi)膜侵入子宮肌層創(chuàng)造條件，使異位內(nèi)膜獲得血供后得以侵襲、發(fā)展，使得病灶不斷擴(kuò)大［10］。這與我們前期研究結(jié)果一致［11］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腺肌病患者病灶中VECF的表達(dá)水平明顯高于原位內(nèi)膜，且原位內(nèi)膜VECF的表達(dá)亦顯著高于正常子宮內(nèi)膜［12，13］。我們推測(cè)EMI處VEGF的高表達(dá)，為子宮腺肌病內(nèi)膜異位到子宮肌層創(chuàng)造了良好的內(nèi)環(huán)境，使得內(nèi)膜可以異位，且在肌層內(nèi)誘導(dǎo)血管生成，并維持異位病灶周?chē)M織的血管活性，使得異位病灶不斷發(fā)展擴(kuò)大。

3.2 MMP-2在子宮腺肌病發(fā)病機(jī)制中的作用 在正常情況下，子宮內(nèi)膜基底層具有抵制內(nèi)膜向肌層方向生長(zhǎng)的作用，異位內(nèi)膜組織必須降解基底膜和其它ECM成分，破壞正常間質(zhì)細(xì)胞之間的連接并侵襲子宮肌層才能在子宮肌層深處浸潤(rùn)生長(zhǎng)。因此，異位子宮內(nèi)膜的侵襲性增強(qiáng)導(dǎo)致ECM降解和重建，是子宮腺肌病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。這個(gè)過(guò)程主要依靠基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）、纖溶酶原激活劑、組織蛋白酶D蛋白水解酶等。其中MMPs在ECM的破壞和降解過(guò)程中起重要作用，它與妊娠和分娩、腫瘤侵襲等一系列生理、病理過(guò)程密切相關(guān)［9］。MMP-2又稱(chēng)明膠酶A，是MMPs家族中主要成員之一，能降解ECM中Ⅳ型、V型膠原和明膠籌主要成分，而這些成分是細(xì)胞侵襲必須跨越的屏障。有研究表明p21的激活激酶4（p21-activated kinase 4，PAK4）通過(guò)調(diào)控MMP-2的活動(dòng)可增強(qiáng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲力導(dǎo)致子宮腺肌病的發(fā)展［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)觀察組增生期、分泌期EMI處MMP-2的表達(dá)均高于對(duì)照組，提示EMI處MMP-2的高表達(dá)在月經(jīng)期周期中使蛋白水解酶活性增強(qiáng)，改變ECM的生長(zhǎng)和合成，使得其對(duì)組織的侵襲性增強(qiáng)，導(dǎo)致ECM降解和重建，長(zhǎng)期作用造成EMI結(jié)構(gòu)的破壞，使得子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞侵入肌層異位種植形成病灶而發(fā)病。3.3 VEGF與MMP-2的相關(guān)性分析 細(xì)胞的增殖能力以及免疫逃逸的能力的增加，會(huì)引起一個(gè)區(qū)域組織的增生，當(dāng)達(dá)到一定點(diǎn)時(shí)，就必須有新生血管的形成提供血供才能進(jìn)一步生長(zhǎng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞必須穿越其基底膜才能形成新的血管。在血管生成過(guò)程中MMPs的活性對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的侵入是非常重要的，抑制MMP-2與其底物作用可以減少血管的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2與VEGF之間呈正相關(guān)，在觀察組增生期、分泌期EMI處，二者的表達(dá)均高于對(duì)照組。VEGF可以改變血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)方式，促進(jìn)MMPs的合成，使其對(duì)組織的侵襲性增強(qiáng)，導(dǎo)致ECM降解和重建，長(zhǎng)期作用造成EMI結(jié)構(gòu)破壞，為子宮內(nèi)膜異位到肌層創(chuàng)造了良好條件。這也符合朗景和教授“在位內(nèi)膜決定論”的觀點(diǎn)［16］。由此可見(jiàn)，VEGF、MMP-2在EMI處高表達(dá)并呈正相關(guān)，二者可能在子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展中有協(xié)同作用。

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Expression and significance of vascular endothel growth factor and matrixmetalloproteinase-2 in the Endometrial-Myometrial Interface of Adenomyosis

Liu Qiu-hong1, Zou Ying1, Wang Bo2, Li Hong-yun1, Li Hong-ling2
(1. The Maternal And Child Health Hospital of Hunan Province, Changsha 410008, China; 2. Hunan Provincial People,s Hospital, Changsha 410002, China)

endometrial-myometrial interface; VEGF; MMP-2; adenomyosis; immunohistochemistry子宮腺肌病是子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層所致，常引起痛經(jīng)、月經(jīng)過(guò)多、子宮增大和不孕。其雖是良性疾病，卻有浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)行為。近年來(lái)其發(fā)病率逐年攀升，但發(fā)病機(jī)理尚不明確。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展與子宮內(nèi)膜侵襲力及局部血供的增加、血管形成密切相關(guān)［1］。VEGF是重要的血管生成因子，與血管的形成密切相關(guān)。MMP-2與組織侵襲有關(guān)，可引起細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）的降解和重建，與子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2］。2000年Uduwela等［3］提出子宮內(nèi)膜-肌層界面（endometrialmyometkial inferface，EMI）的概念，認(rèn)為EMI在結(jié)構(gòu)、功能上具有特殊性，是一個(gè)重要的區(qū)域。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)EMI處VEGF、MMP-2的表達(dá)，探討二者與子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

R711.71

A

1673-016X（2017）01-0004-04

2016-10-11

鄒穎，E-mail：506921055@qq.com

［Abstract］Objective To observe the expressions of vascular endothelial growth factor(VEGF)and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in the endometrial-myometrial interface(EMI)of adenomyosis. Methods Immunohistochemistry ElivisiongTMSuper method was adopted to determine the expressions of VEGF and MMP-2 in EMI of forty cases of adenomyosis and of forty cases of uterine fibroids subjects. Results The expression level of VEGF and MMP-2 were higher in EMI versus outer layer, and higher in adenomyosis group versus control group, both proliferative stage and progestational stage. Conclusion The high expression of VEGF in EMI of adenomyosis may facilitate the angiopoiesis of ectopic endometrium and myomemtrium, the overexpression of MMP-2 in EMI may be related to over growth of smooth muscle of uterus and invasiveness of endometrium tissue during progression of adenomyosis. MMP- 2 and VEGF are two important factors involved in progression of adenomyosis.