肖英平，楊彩梅，代 兵，李開(kāi)鋒，陳鏡剛，楊 華，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300)

基于高通量測(cè)序的丁酸梭菌對(duì)肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

肖英平1，楊彩梅2，代 兵2，李開(kāi)鋒1，陳鏡剛1，楊 華1，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300)

采用高通量測(cè)序技術(shù)分析飼料中添加丁酸梭菌對(duì)肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響。選用300羽1日齡肉雞隨機(jī)分成2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25羽雞，分別飼喂基礎(chǔ)日糧和基礎(chǔ)日糧+丁酸梭菌3×107cfu·kg-1的試驗(yàn)日糧。在42日齡階段稱量體質(zhì)量后每個(gè)重復(fù)取3羽公雞用于采集盲腸內(nèi)容物，提取其基因組DNA，用特異性引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)，采用基于Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，添加丁酸梭菌可以顯著地降低肉雞的料肉比(P<0.05)。肉雞盲腸中細(xì)菌主要是硬壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和軟壁菌門(mén)；在門(mén)的水平上，丁酸梭菌處理具有降低硬壁菌門(mén)豐度、增加擬桿菌門(mén)豐度的趨勢(shì)。在屬的水平上，瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_uncultured)、糞棲桿菌屬(Faecalibacterium)、別樣桿菌屬(Alistipes)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae_incertae_sedis)是肉雞盲腸中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬；丁酸梭菌處理使肉雞盲腸中糞棲桿菌(Faecalibacterium)、別樣桿菌(Alistipes)、類桿菌屬(Bacteroides)、Phascolarctobacterium和丁酸梭菌(Butyricicoccus)相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，毛螺菌屬(包括Lachnospiraceae_incertae_sedis和Lachnospiraceae_unclassified)、理研菌屬(Rikenella)、鏈球菌(Streptococcus)和Blautia屬相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，其中豐度顯著升高菌群為主要的短鏈脂肪酸生成菌。由此表明，日糧中添加丁酸梭菌可降低肉雞的料肉比，增加盲腸中產(chǎn)短鏈脂肪酸菌群的豐度。

丁酸梭菌；高通量測(cè)序；肉雞；菌群結(jié)構(gòu)

早期腸道微生物研究主要基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，只能檢測(cè)可培養(yǎng)型微生物，而可培養(yǎng)細(xì)菌只占腸道菌群的 1%～10%，大多數(shù)的腸道菌群為非培養(yǎng)型菌[1]。近年來(lái)，基于分子生物學(xué)技術(shù)的熒光原位雜交、變性梯度凝膠電泳、熒光定量PCR、構(gòu)建克隆文庫(kù)等方法在微生物群落研究中得到了廣泛的運(yùn)用，但這些分析技術(shù)不能完整地反應(yīng)整個(gè)群落結(jié)構(gòu)信息，且耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大?，F(xiàn)在快速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)在腸道微生物研究中的運(yùn)用愈加廣泛，對(duì)微生物群落信息的采集與分析更準(zhǔn)確、詳細(xì)，可深度研究微生物的菌群結(jié)構(gòu)和功能，逐漸成為研究復(fù)雜腸道菌群最為有效的手段之一[2]。

肉雞等家禽消化系統(tǒng)包括嗉囊、胃(腺胃和肌胃)、小腸、盲腸和大腸，各個(gè)區(qū)段均分布著大量的微生物，硬壁菌門(mén)是主要的優(yōu)勢(shì)微生物類群[3-4]。其中盲腸中食糜轉(zhuǎn)運(yùn)速度較慢，微生物最為豐富，每克內(nèi)容物含1010～1011cfu；高通量測(cè)序技術(shù)表明，盲腸微生物中含有大約2 200運(yùn)算分類單元OTU(operational taxonomic units；95% sequence ID)和3 500個(gè)基因型[5]。腸道中的這些微生物對(duì)于宿主的營(yíng)養(yǎng)消化吸收、免疫系統(tǒng)發(fā)育、機(jī)體能量代謝等具有重要的生理調(diào)節(jié)作用[1]。腸道菌群結(jié)構(gòu)的平衡可有效地抑制病原微生物的侵襲，改善動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能，因此，使用益生菌、益生元等改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)逐漸成為養(yǎng)殖業(yè)中提高生產(chǎn)效益的研究熱點(diǎn)之一[6]。丁酸梭菌(ClostridiumButyricum)作為一種有效的益生菌，可顯著促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)，提高其免疫力和腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量，減少大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量[7-8]。因此，采用高通量測(cè)序?qū)Χ∷崴缶幚砣怆u腸道微生物進(jìn)行深入研究，闡明其腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化，可更加清晰地理解丁酸梭菌等益生菌的作用機(jī)理，為益生菌的研發(fā)和推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum， CB)購(gòu)自浙江惠嘉生物技術(shù)公司，活度為2×108cfu·g-1。試驗(yàn)用Ross 308肉雞購(gòu)自浙江正大肉雞有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、飼料組成及飼養(yǎng)管理

將300羽1日齡肉雞隨機(jī)分成2個(gè)處理，為對(duì)照組和丁酸梭菌組，分別飼喂基礎(chǔ)日糧和基礎(chǔ)日糧+丁酸梭菌3×107cfu·kg-1的試驗(yàn)日糧，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25羽雞?；A(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。

試驗(yàn)在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)前對(duì)雞舍全舍及飼養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格消毒。飼養(yǎng)周期為42 d。試驗(yàn)期間采用人工投料，自由飲水和采食。試驗(yàn)第1周保持溫度為35 ℃，每周逐漸減低2～3 ℃，直至室溫；保持通風(fēng)良好。

1.3 樣品采集和保存

在試驗(yàn)第42天時(shí)全群稱體質(zhì)量，各組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3羽公雞屠宰，收集盲腸內(nèi)容物。宰前禁飼12 h，禁飼期自由飲水。按每個(gè)重復(fù)計(jì)算肉雞的平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率等。

1.4 DNA提取和16S rRNA 基因擴(kuò)增PCR反應(yīng)

將每個(gè)處理組的2個(gè)重復(fù)(即6羽雞)的盲腸內(nèi)容物等量混合用于DNA提取。用QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN， CA)試劑盒抽提肉雞盲腸內(nèi)容物總基因組DNA，采用引物338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)[9]。

表1 日糧組成及主要營(yíng)養(yǎng)成分

試驗(yàn)雞在1～21 d飼喂小雞料，22～42 d飼喂中雞料。

The chickens were fed with starter diet from 1-day-old to 21-day-old and grower diet from 22-day-old to 42-day-old.

1.5 PCR反應(yīng)和高通量測(cè)序分析

測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)肉雞盲腸微生物16s rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，獲得的序列通過(guò)Mothur軟件平臺(tái)，剔除低質(zhì)量的DNA序列之后，計(jì)算序列之間的距離。每一個(gè)運(yùn)算分類單元OTU代表序列相似度大于97%的DNA序列，用于對(duì)照組和丁酸梭菌處理組的樣品進(jìn)行菌群多樣性分析和聚類分析，并使用Sliva和RPD數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所有OTUs的代表性序列進(jìn)行物種匹配，對(duì)樣品的各個(gè)細(xì)菌門(mén)組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌群分析結(jié)果[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

平均日增重、飼料轉(zhuǎn)化率和微生物相對(duì)豐度變化采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為顯著性差異，P<0.10為具有顯著性差異的趨勢(shì)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，日糧中添加丁酸梭菌對(duì)肉雞體質(zhì)量、平均日增重和平均日采食量無(wú)明顯影響，但可顯著地降低料肉比(P<0.05)。

2.2 肉雞盲腸微生物物種豐度及多樣性

各樣品的有效序列數(shù)均較高，在24 798～36 667之間；覆蓋度指數(shù)也均大于0.99，說(shuō)明了該測(cè)序結(jié)果已基本覆蓋樣本的多樣性(表3)。運(yùn)用Mothur 軟件計(jì)算97%相似水平上各樣品的 OTU 數(shù)量，在所有樣品中，OTU 數(shù)量最多為407，最少為368，表明肉雞盲腸內(nèi)容物中微生物的豐度較高。Alpha多樣性分析表明，對(duì)照組香農(nóng)指數(shù)也高于丁酸梭菌組(P=0.03)。

表2 丁酸梭菌對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

Table 2 Effects ofC.butyricumon productive performance of broiler chickens (n=6)

項(xiàng)目Item對(duì)照組Controlgroup丁酸梭菌組CB-treatedgroupP值P-value體質(zhì)量BW/g2489.98±196.872610.07±216.840.37平均日增重ADG/g58.13±4.6560.99±8.690.16平均日采食量ADFI/g108.11±12.39103.32±11.380.18料肉比F∶G1.86±0.041.69±0.030.04

表3 樣品測(cè)序概況

Table 3 Overview of sequencing results of each sample

樣品Samples序列數(shù)量Sequencenumber運(yùn)算分類單元OTUs豐度指數(shù)ACE豐度指數(shù)Chao1覆蓋度指數(shù)Goodscoverage香農(nóng)指數(shù)Shannon辛普森指數(shù)SimpsonC1335153924013990.99934.540.0247C2312094074204220.99914.560.0267C3247983683884000.99844.050.0601CB1366673813953930.99923.950.0663CB2343253934064030.99913.890.0981CB3264093853974000.99894.040.0524

C1， C2， C3， 對(duì)照組樣品；CB1， CB2， CB3， 丁酸梭菌處理組樣品。下同。

C1， C2， C3， Control group samples; CB1， CB2， CB3， CB-treated group samples. The same as below.

依據(jù)隨機(jī)抽到的序列數(shù)與觀測(cè)到的 OTU 數(shù)量構(gòu)建的稀釋性曲線結(jié)果如圖 1 所示。從圖上分析，各樣品曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明有效測(cè)序數(shù)量已經(jīng)能夠較好地覆蓋菌種的多樣性。

2.3 肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)

在微生物分類門(mén)的水平上(圖2)，通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序，共檢測(cè)到 13 個(gè)菌門(mén)，對(duì)照組和丁酪梭菌組有4個(gè)相同的優(yōu)勢(shì)微生物類群(豐度>0.5%為優(yōu)勢(shì)菌群)，分別是硬壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和軟壁菌門(mén)(Tenericutes)，這些微生物共占肉雞盲腸微生物的99.38%以上。與對(duì)照組相比，丁酸梭菌處理表現(xiàn)出降低厚壁菌門(mén)豐度(對(duì)照組vs丁酸梭菌組，83.92% vs 80.36%；P=0.07)、增加擬桿菌門(mén)豐度(對(duì)照組vs 丁酸梭菌組，13.53% vs 17.01%；P=0.08)的趨勢(shì)。對(duì)照組和丁酸梭菌組厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比例分別為6.16和4.72。對(duì)照組和丁酸梭菌組變形菌門(mén)的平均豐度分別為1.11%和1.45%，軟壁菌門(mén)的平均豐度分別為0.99%和0.83%，差異不顯著。

圖1 腸道菌群稀釋性曲線分析Fig.1 Rarefaction curve analysis of cecal microflora

圖2 在門(mén)水平上的腸道菌群結(jié)構(gòu)Fig.2 Relative abundance of sequences belonging to different bacterial phyla

圖3 在屬水平上的腸道菌群結(jié)構(gòu)Fig.3 Relative abundance of sequences belonging to different bacterial genus

在屬的水平上進(jìn)行深入分析，能更清晰地反映出2組不同處理肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)。所有樣品共檢測(cè)到92個(gè)屬，其中瘤胃菌屬(Ruminococcaceae_uncultured)、糞棲桿菌屬(Faecalibacterium)、別樣桿菌屬(Alistipes)和毛螺菌屬(Lachnospiraceae)是主要的優(yōu)勢(shì)屬(圖3)。選取相對(duì)豐度>0.2%的屬進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，丁酸梭菌處理使肉雞盲腸中糞棲桿菌屬(Faecalibacterium)、別樣桿菌屬(Alistipes)、類桿菌屬(Bacteroides)、Phascolarctobacterium和丁酸菌屬(Butyricicoccus)的相對(duì)豐度分別提高了62.68%、79.63%、55.12%、50.00%和350.00%(P<0.01或P<0.05)；丁酸梭菌處理使毛螺菌屬Lachnospiraceae_incertae_sedis與Lachnospiraceae_unclassified、理研菌屬(Rikenella)、鏈球菌屬(Streptococcus)和Blautia屬相對(duì)豐度分別降低了35.13%、35.50%、72.35%、87.98%和35.56%(P<0.01或P<0.05)。

2.4 肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)聚類分析

由圖4可知，對(duì)照組和丁酸梭菌組表現(xiàn)出不同的聚類趨勢(shì)。同樣地，在主要坐標(biāo)分析圖上，丁酸梭菌組樣本也和對(duì)照組樣本顯著分離(圖5)。

表4 在屬水平上對(duì)照組和丁酸梭菌組顯著差異的序列

Table 4 Different taxonomic assignments between control group and CB-treated group at genus level

項(xiàng)目Item對(duì)照組Controlgroup丁酸梭菌組CB-treatedgroupP值P-value糞棲桿菌屬Faecalibacterium14.90±2.3224.24±4.210.006別樣桿菌屬Alistipes7.71±1.2613.85±2.540.009毛螺菌屬Lachnospiraceae_incertae_sedis9.79±1.536.35±1.060.023毛螺菌屬Lachnospiraceae_unclassified6.14±1.213.96±0.970.003理研菌屬Rikenella3.87±0.941.07±0.310.042類桿菌屬Bacteroides1.27±0.421.97±0.160.049鏈球菌屬Streptococcus2.33±1.030.28±0.120.000Blautia1.35±0.240.87±0.060.046Phascolarctobacterium0.48±0.080.72±0.110.039丁酸菌屬Butyricicoccus0.06±0.020.27±0.050.000

圖4 肉雞盲腸微生物的聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis chart of flora in cecal contents of broilers

3 討論

動(dòng)物腸道是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，棲居著大量的微生物，不同菌群之間保持著一定的比例關(guān)系，與宿主機(jī)體相互作用并處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

圖5 肉雞盲腸微生物的主坐標(biāo)分析Fig.5 PcoA (principal coordinate analysis) plot based on the weighted UniFrac metric

腸道微生物可以看作宿主體內(nèi)的一個(gè)器官，對(duì)動(dòng)物生理功能的發(fā)育以及疾病防治等都發(fā)揮著重要作用[11]。主要功能包括：促進(jìn)腸道發(fā)育、發(fā)揮腸道屏障作用、介導(dǎo)免疫反應(yīng)；消耗、儲(chǔ)存并重新分配能量；降解膳食中一些宿主自身無(wú)法消化的營(yíng)養(yǎng)成分，比如果膠、纖維素、半纖維素、抗性淀粉等植物性多糖，產(chǎn)生單糖、短鏈脂肪酸等利于宿主吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[12]。

腸道微生物包括細(xì)菌、古菌和真核微生物，其中細(xì)菌1 000～1 150種，占大多數(shù)且絕大部分是厭氧細(xì)菌[13]。Qu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在雞盲腸中細(xì)菌的環(huán)境基因標(biāo)簽 (environmental gene tags， EGTs)占97.3%，古菌EGTs為0.81%，真核生物EGTs為1.76%，病毒EGTs為0.12%，其中細(xì)菌主要是硬壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)。在本研究中，共檢測(cè)到肉雞盲腸微生物13個(gè)菌門(mén)，主要是硬壁菌門(mén)(Firmicutes)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)，二者占據(jù)盲腸總細(xì)菌16S rRNA基因序列的95%以上，其次為變形菌門(mén)(Proteobacteria)和軟壁菌門(mén)(Tenericutes)，與前人的研究相一致[4]。

丁酸梭菌是存在于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一種益生菌，可代謝產(chǎn)生丁酸，抑制腸道有害菌生長(zhǎng)，并刺激粘膜免疫反應(yīng)；同時(shí)丁酸梭菌還可以產(chǎn)生淀粉酶等多種酶類物質(zhì)、B族維生素、維生素K、葉酸等對(duì)機(jī)體具有重要生理功能的物質(zhì)[14]。在家禽飼料中添加丁酸梭菌，可有效地改善家禽的生產(chǎn)性能、腸道微生物結(jié)構(gòu)和健康狀況[15]。Yang[7]和Cao等[8]研究表明，日糧中添加丁酸梭菌可以促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)，提高其免疫力和盲腸中乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量，減少盲腸中大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量，從而減少肉雞的下痢。劉亭婷等[16]發(fā)現(xiàn)，在蛋用仔公雞飼料中添加1 000 mg·kg-1丁酸梭菌能顯著增加腸道中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，改善蛋用仔公雞小腸黏膜厚度、絨毛高度，增加黏膜上皮淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞及IgA陽(yáng)性物質(zhì)的數(shù)量。我們通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在門(mén)水平上，丁酸梭菌處理使硬壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比例降低(對(duì)照組和丁酸梭菌組硬壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比例分別為6.16和4.72)，該2類細(xì)菌均是動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和宿主能量代謝方面起著重要作用[17]。肉雞盲腸變形菌門(mén)在對(duì)照組和丁酸梭菌組的平均豐度分別為1.11%和1.45%，軟壁菌門(mén)在對(duì)照組和丁酸梭菌組的平均豐度分別為0.99%和0.83%。在屬的水平上，丁酸梭菌處理使肉雞盲腸中霍氏真桿菌屬(Faecalibacterium)、阿里葉柄屬(Alistipes)、類桿菌屬(Bacteroides)、Phascolarctobacterium、埃希氏桿菌屬(Escherichia-Shigella)和丁酸梭菌(Butyricicoccus)的相對(duì)豐度顯著升高。值得注意的是，霍氏真桿菌屬、阿里葉柄屬、類桿菌屬、Phascolarctobacterium和丁酸梭菌是產(chǎn)生短鏈脂肪酸的重要菌群[2]，這從屬的水平上說(shuō)明丁酸梭菌使產(chǎn)生短鏈脂肪酸的有益菌數(shù)量增加，也進(jìn)一步解釋了Zhang等[18]的研究結(jié)果，即丁酸梭菌處理使肉雞盲腸中乙酸、丁酸和戊酸等短鏈脂肪酸濃度升高。而丁酸可以誘導(dǎo)禽類巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和單核細(xì)胞AvBD9基因的表達(dá)，也可促進(jìn)肉雞空腸和盲腸AvBD9、AvBD14和CathB1等宿主防御素基因的表達(dá)，有效地抑制異源微生物侵襲[19]。同時(shí)腸道中短鏈脂肪酸濃度較高時(shí)，腸道中pH降低，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，從而改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和提高生產(chǎn)性能。

[1] DENG P， YU Z. Intestinal microbiome of poultry and its interaction with host and diet[J].GutMicrobes， 2014， 5(1)：108-119.

[2] ZHANG J， GUO Z， XUE Z， et al. A phylo-functional core of gut microbiota in healthy young Chinese cohorts across lifestyles， geography and ethnicities[J].TheISMEJournal， 2015， 9(9)：1979-1990.

[3] YEOMAN C J， CHIA N， JERALDO P， et al. The microbiome of the chicken gastrointestinal tract[J].AnimalHealthResearchReview， 2012， 13(1)：89-99.

[4] CHOI J H， KIM G B， CHA C J. Spatial heterogeneity and stability of bacterial community in the gastrointestinal tracts of broiler chickens[J].PoultryScience， 2014， 93(8)：1942-1950.

[5] QU A， BRULC J M， WILSON M K， et al. Comparative metagenomics reveals host specific metavirulomes and horizontal gene transfer elements in the chicken cecum microbiome[J].PLoSOne， 2008， 3(8)：e2945-1-e2945-19.

[6] STANLEY D， HUGHES R J， MOORE R J. Microbiota of the chicken gastrointestinal tract: influence on health， productivity and disease[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology， 2014， 98(10)：4301-4310.

[7] YANG C M， CAO G T， FERKET P R， et al. Effects of probiotic，Clostridiumbutyricum， on growth performance， immune function， and cecal microflora in broiler chickens[J].PoultryScience， 2012， 91(9)：2121-2129.

[8] CAO G T， XIAO Y P， YANG C M， et al. Effects ofClostridiumbutyricumon growth performance， nitrogen， metabolism， intestinal morphology and cecal microflora in broiler chickens[J].JournalofAnimalandVeterinaryAdvances， 2012， 11(15)：2665-2671.

[9] ZHANG Y， WANG X， HU M， et al. Effect of hydraulic retention time (HRT) on the biodegradation of trichloroethylene wastewater and anaerobic bacterial community in the UASB reactor[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology， 2015， 99(4)：1977-1987.

[10] SUEZ J， KOREM T， ZEEVI D， et al. Artificial sweeteners induce glucose intolerance by altering the gut microbiota[J].Nature， 2014， 514(7521)：181-186.

[11] NICHOLSON J K， HOLMES E， KINROSS J， et al. Host-gut microbiota metabolic interactions[J].Science， 2012， 336(6086)：1262-1267.

[12] CHO I， YAMANISHI S， COX L， et a1. Antibiotics in early life alter the murine colonic microbiome and adiposity[J].Nature， 2012， 488(7413)：621-626.

[13] GILL S R， POP M， DEBOY R T， et a1. Metagenomic analysis of the Human distal gut microbiome[J]. Science， 2006， 312(5778)：1355-1359.

[14] MO S J， KIM B S， YUN S J， et al. Genome sequencing ofClostridiumbutyricum， DKU-01， isolated from infant feces[J].GutPathogens， 2015， 7(8)：1-7.

[15] ZHAO X， GUO Y， GUO S， et al. Effects ofClostridiumbutyricum， andEnterococcusfaecium， on growth performance， lipid metabolism， and cecal microbiota of broiler chickens[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology， 2013， 97(14)：6477-6488.

[16] 劉亭婷， 滑靜， 王曉霞，等. 丁酸梭菌對(duì)蛋用仔公雞腸道菌群、形態(tài)結(jié)構(gòu)及黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞的影響[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2012， 24(11)：2210-2221. LIU T， HUA J， WANG X， et al.Clostridiumbutyricum: Effects on intestinal microflora， morphology and mucosal immunity-associated cells in egg-laying male chicks[J].ChineseJournalofAnimalNutrition， 2012, 24(11):2210-2221. (in Chinese with English abstract)

[17] TILG H， MOSCHEN A R. Microbiota and diabetes: an evolving relationship[J].Gut， 2014， 63(9)：1513-1521.

[18] ZHANG B， YANG X， LONG Y G F. Effects of dietary lipids andClostridiumbutyricumon the performance and the digestive tract of broiler chickens[J].ArchivesofAnimalNutrition， 2011， 65(4)：329-39.

[19] LAKSHMI T S， MALLIKA A， NICOLE B S， et al. Butyrate enhances disease resistance of chickens by inducing antimicrobial host defense peptide gene expression[J].PLoSOne， 2011， 6(11)：e27225.

(責(zé)任編輯 盧福莊)

Effect ofClostridiumbutyricumin feed on structures of cecal microbiota in broilers based on high-throughput sequencing

XIAO Yingping1， YANG Caimei2， DAI Bing2， LI Kaifeng1， CHEN Jinggang1， YANG Hua1，*

(1.InstituteofQualityandStandardforAgro-products，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.CollegeofAnimalScience&Technology，ZhejiangA&FUniversity，Hangzhou311300，China)

The aim of this study was to investigate the effects ofClostridiumbutyricum(CB) on cecal microbiota in broiler chickens based on high-throughput sequencing. A total of 300 one-day-old birds were randomly allotted to 2 groups， representing control (basal diet) and CB-treated group (basal diet+3×107cfu·kg-1CB)， 6 replications per group with 25 chickens per replication. All chickens were weighted and cecal contents were collected from 3 male chickens per replication to extract genomic DNA after a 42-d treatment. The V3 and V4 regions in 16S rRNA gene of bacteria were amplified and analyzed based on Illumine Miseq sequencing. Results showed that the feed to gain ratio significantly reduced (P<0.05) in CB treatment. Among all bacterial groups revealed by the interpretable sequences， Firmicutes， Bacteroidetes， Proteobacteria and Tenericutes were the predominant phylum in cecum of chickens. It indicated the trend that the relative abundance of Firmicutes decreased by CB treatment， whereas Bacteroidetes increased. At the genera level，Ruminococcaceaeuncultured，F(xiàn)aecalibacterium，Alistipes，Lachnospiraceae_incertae_sedisdominated in cecum. Compared with the control group， administration of CB increased the relative abundance ofFaecalibacterium，Alistipes，Bacteroides，PhascolarctobacteriumandButyricicoccus(P<0.05)， but decreased the relative abundance ofLachnospiraceae_incertae_sedis，Lachnospiraceae_unclassified，Rikenella，StreptococcusandBlautia(P<0.05). Interestingly， the genera of increasing abundance were major bacteria which produce short-chain fatty acids (SCFAs) in cecum and large intestine. These findings suggested that the addition of CB to diet decreased the feed to gain ratio but increased the abundance of bacteria producing SCFAs in cecum of broiler chickens.

ClostridiumButyricum; high-throughput sequencing; broiler chicken; microbiota

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.03.04

2016-07-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(31402083)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)際合作項(xiàng)目

肖英平(1984—)，男，江西興國(guó)人，博士，助理研究員，從事單胃動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。 E-mail: ypxiaozju@126.com

*通信作者，楊華，E-mail: yanghua806@hotmail.com

S831；Q93-332

A

1004-1524(2017)03-0373-07

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(3): 373-379

http://www.zjnyxb.cn

肖英平，楊彩梅，代兵，等. 基于高通量測(cè)序的丁酸梭菌對(duì)肉雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(3): 373-379.