李蓉， 鄭雨田， 李春青， 陳艷艷， 楊振升， 陳善元， 肖蘅

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 昆明650091)

基于線粒體COI基因序列的壯真蝎與普洱真蝎的分子鑒定

李蓉#， 鄭雨田#， 李春青， 陳艷艷， 楊振升， 陳善元*， 肖蘅*

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 昆明650091)

對(duì)蝎類物種的傳統(tǒng)分類主要依靠形態(tài)和行為特征，但由于該類群種間形態(tài)特征極為相似，物種的劃分和鑒定困難。為彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的不足，本研究以線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COI)基因作為分子標(biāo)記，對(duì)形態(tài)相似的壯真蝎Euscorpiopsvalidus和普洱真蝎E.puerensis進(jìn)行分子水平的物種鑒定。采用PCR擴(kuò)增測(cè)序獲得壯真蝎與普洱真蝎共24個(gè)樣本的COI基因部分片段序列(660 bp)，進(jìn)行了遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析。結(jié)果顯示：壯真蝎15個(gè)樣本中共檢測(cè)到4個(gè)單倍型，單倍型之間的相似度為99.3%～99.8%；普洱真蝎9個(gè)樣本中共檢測(cè)到4個(gè)單倍型，單倍型之間的相似度為99.6%～99.8%；2種蝎的種間序列相似度為90.1%～90.6%，單倍型間的穩(wěn)定差異核苷酸位點(diǎn)數(shù)為61個(gè)。壯真蝎與普洱真蝎種內(nèi)平均遺傳距離分別為0.004 0、0.002 3，種間平均遺傳距離為0.103 9，且種間遺傳距離為種內(nèi)的34.6倍。此外，分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示壯真蝎與普洱真蝎的單倍型序列各自聚為2個(gè)單系枝，且具有很高的分枝自舉值(100%)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果也顯示壯真蝎與普洱真蝎8個(gè)單倍型明顯分為2大類群，且壯真蝎的單倍型HAP2與普洱真蝎的單倍型HAP7之間的突變步數(shù)高達(dá)62步。上述結(jié)果不僅進(jìn)一步確認(rèn)壯真蝎與普洱真蝎為2個(gè)不同的物種，且表明線粒體COI基因可用于開展真蝎屬Euscorpiops物種的分子鑒定。

壯真蝎；普洱真蝎；COI基因；分子鑒定

加拿大分類學(xué)家Hebert于2003年首次提出了DNA條形碼的概念，即將線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基 Ⅰ(COI)基因的一段長(zhǎng)度約648 bp的片段作為物種鑒定的基礎(chǔ)片段(Hebertetal.，2003a)。對(duì)動(dòng)物界11個(gè)門13 320個(gè)物種的研究結(jié)果顯示，COI基因序列間的差異能夠?qū)?dòng)物界所有物種進(jìn)行有效鑒定(Hebertetal.，2003b)。由于DNA條形碼技術(shù)無(wú)需依賴形態(tài)分類就能夠?qū)λ芯康奈锓N進(jìn)行準(zhǔn)確辨別，不僅操作簡(jiǎn)單迅速(彭居俐等，2008)，而且減少了物種鑒別的模糊性，因此被廣泛應(yīng)用。Yamashita和Rhoads(2013)基于線粒體COI基因?qū)Υ涛残珜貱entruroides的C.vittatus與C.pantheriensis構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行聚類分析，結(jié)果同形態(tài)學(xué)分類結(jié)果吻合。Barrett和Hebert(2005)利用線粒體COI基因?qū)?68種蜘蛛及其他35種蛛形綱物種(美洲沙漠木蝎Centruroidesvittatus、土耳其斯坦葉螨Tetranychusturkestani、美洲大革蜱Dermacentorvariabilis等)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離的DNA條形碼分析發(fā)現(xiàn)，COI基因能很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)蜘蛛及其他蛛形綱物種的有效鑒定。何靜超等(2016)對(duì)小五臺(tái)山10屬25種蟹蛛樣本進(jìn)行劃分及DNA條形碼分子鑒定分析發(fā)現(xiàn)，其劃分及鑒定結(jié)果同形態(tài)學(xué)分類方法得出的結(jié)果一致。Talal等(2015)利用COI及其他基因片段對(duì)中東金蝎Scorpiomaurus的S.maurusfuscus和S.mauruspalmatus2個(gè)亞種進(jìn)行形態(tài)特征、系統(tǒng)發(fā)育及遺傳差異分析發(fā)現(xiàn)，中東金蝎是一個(gè)復(fù)合種，與先前的分類觀點(diǎn)相符，并證明了S.fuscus、S.kruglovi、S.palmatus、S.propinquus物種分類修訂的合理性。

目前，基于線粒體COI基因?qū)颜嫘c普洱真蝎的DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定的相關(guān)研究還未見報(bào)道，因此COI基因能否對(duì)壯真蝎與普洱真蝎進(jìn)行有效鑒定還未曾得知。鑒于此，本研究首次對(duì)形態(tài)相似的壯真蝎與普洱真蝎共24個(gè)個(gè)體進(jìn)行基因組總DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，并對(duì)二者的遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，以期為二者及其他蝎類物種的鑒定提供分子水平的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

壯真蝎(編號(hào)：HHMZ)與普洱真蝎(編號(hào)：PELC)分別采自云南省紅河州蒙自市和普洱市瀾滄縣的潮濕混交林石塊、土堆或廢墟中，總計(jì)24個(gè)樣本。采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度分別為103.0°E，22.9°N和99.9°E，22.5°N，采集后使用數(shù)碼相機(jī)記錄樣本的形態(tài)特征，選取較為完整的樣本進(jìn)行形態(tài)鑒定后，保存于75%乙醇中，標(biāo)本存放于云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 DNA提取

取樣本蝎腹部肌肉組織約30 mg，將組織剪碎用ddH2O處理為細(xì)胞懸液(處理2次)，按照血液細(xì)胞組織基因組提取試劑盒(TIANGEN，北京)說(shuō)明書的步驟提取樣本蝎基因組總DNA，提取后，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)，檢測(cè)后將提取的總DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

PCR擴(kuò)增所用引物為COI基因通用引物L(fēng)CO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)，HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)(Folmeretal.，1994)，所有引物均由上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括10×Buffer 5 μL，25 mM MgCl25 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.15 μL，2.5 mM dNTP4 μL，10 μM正反引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 31.85 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸5 min。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)置陰性對(duì)照，以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程不受外源DNA的污染。擴(kuò)增結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將2種蝎獲得的測(cè)序峰圖利用DNASTAR(Burland，2000)中的SeqMan(Swindell & Plasterer，1997)進(jìn)行正反鏈校對(duì)和編輯，手動(dòng)去除序列兩端的引物區(qū)，獲得有效片段的樣本序列，用MegAlign(Clewley & Arnold，1997)進(jìn)行排序后，利用Clustal X(Jeanmouginetal.，1998)進(jìn)行多序列比對(duì)，采用DnaSP v5(Librado & Rozas，2009)計(jì)算信息位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)，通過(guò)BioEdit(Hall，1999)計(jì)算單倍型序列間的相似度，利用MEGA 6.06(Tamuraetal.，2013)分析堿基組成、單倍型間變異位點(diǎn)，并基于Kimura-2-parameter(K2P)模型進(jìn)行遺傳距離分析及采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的節(jié)點(diǎn)支持率采用自舉值進(jìn)行估計(jì)，重復(fù)檢測(cè)1 000次(Felsenstein，1985)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖采用POPART(Leigh & Bryant，2015)構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于COI基因的序列分析

經(jīng)COI基因通用引物PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定，共獲得24條DNA序列，經(jīng)人工校對(duì)后，獲得有效序列長(zhǎng)度均為660 bp，所測(cè)COI基因序列中未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失。壯真蝎15個(gè)樣本的A、T、C、G平均含量分別為21.5%、45.4%、14.0%、19.1%，其中A+T含量(66.9%)大于G+C含量(33.1%)；15條序列共檢測(cè)到1個(gè)信息位點(diǎn)，占序列總長(zhǎng)度的0.15%，4個(gè)變異位點(diǎn)，4個(gè)單倍型(HAP1～HAP4)，單倍型之間的相似度為99.3%～99.8%。普洱真蝎9個(gè)樣本的A、T、C、G平均含量分別為23.1%、42.5%、15.2%、19.2%，其中A+T含量(65.6%)大于G+C含量(34.4%)，9條序列共檢測(cè)到2個(gè)信息位點(diǎn)，占序列總長(zhǎng)度的0.30%，3個(gè)變異位點(diǎn)，4個(gè)單倍型(HAP5～HAP8)，單倍型之間的相似度為99.6%～99.8%。壯真蝎與普洱真蝎種間相似度為90.1%～90.6%(表1)，2種蝎共8個(gè)單倍型中的變異位點(diǎn)數(shù)為68，其中61個(gè)位點(diǎn)為二者的穩(wěn)定差異位點(diǎn)，可作為壯真蝎與普洱真蝎物種鑒定的診斷位點(diǎn)(圖1)。

2.2 遺傳距離分析

基于COI基因，利用MEGA 6.06中的雙參數(shù)模型計(jì)算壯真蝎與普洱真蝎的遺傳距離。結(jié)果顯示，壯真蝎4個(gè)單倍型(HAP1～HAP4)間的遺傳距離為0.002～0.006，平均遺傳距離為0.004 0；普洱真蝎4個(gè)單倍型(HAP5～HAP8)間的遺傳距離為0.002～0.003，平均遺傳距離為0.002 3；壯真蝎與普洱真蝎單倍型間的遺傳距離為0.101～0.107，種間平均遺傳距離為0.103 9(表1)。壯真蝎與普洱真蝎種間平均遺傳距離顯著高于種內(nèi)平均遺傳距離，為種內(nèi)平均遺傳距離的34.6倍。

表1 基于COI基因序列的壯真蝎與普洱真蝎單倍型之間的遺傳距離與相似度Table 1 Genetic distance and similarity of haplotypes from Euscorpiops validus and E. puerensis based on COI gene sequences

注： 對(duì)角線上方為單倍型間遺傳距離， 對(duì)角線下方為單倍型間相似度； HAP1～HAP4為壯真蝎的單倍型， HAP5～HAP8為普洱真蝎的單倍型。

Notes： The genetic distances between haplotypes are above the diagonal， and the similarities between haplotypes are below the diagonal; HAP1-HAP4 are the haplotypes ofE.validus， HAP5-HAP8 are the haplotypes ofE.puerensis.

圖1 基于COI基因序列的壯真蝎與普洱真蝎單倍型之間的變異位點(diǎn)

HAP1～HAP4為壯真蝎的單倍型， HAP5～HAP8為普洱真蝎的單倍型； 陰影部分為非穩(wěn)定變異位點(diǎn)。

HAP1-HAP4 are the haplotypes ofE.validus， HAP5-HAP8 are the haplotypes ofE.puerensis； the shaded regions are non-stable variable sites.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

以E.flavicaudis(GenBank登錄號(hào)：KF548117、JN018212、HM418267)的3條序列為外群，結(jié)合本研究的壯真蝎與普洱真蝎單倍型序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示，二者的單倍型序列都各自聚為獨(dú)立的單系枝，且具有較高的分枝自舉值(100%)。為進(jìn)一步了解二者單倍型之間的關(guān)系，利用POPART的中間結(jié)合法(Median-joining)構(gòu)建了2種蝎的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。結(jié)果顯示，8個(gè)單倍型可分為2大類群，普洱真蝎的單倍型為聚類A，壯真蝎的單倍型為聚類B，無(wú)共享單倍型。且壯真蝎的單倍型HAP2與普洱真蝎的單倍型HAP7之間的突變步數(shù)高達(dá)62步。

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的壯真蝎和普洱真蝎的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于COI基因序列構(gòu)建的壯真蝎與普洱真蝎的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

線粒體基因序列中穩(wěn)定的變異位點(diǎn)或核苷酸診斷位點(diǎn)可作為物種劃分的鑒別位點(diǎn)。朱振華等(2005)基于線粒體Cytb基因?qū)?種果實(shí)蠅進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因片段的30個(gè)變異位點(diǎn)具有較高的穩(wěn)定性，可作為果實(shí)蠅物種分子鑒定的依據(jù)。王康等(2016)通過(guò)比較沙果小食心蟲GrapholitadimorphaKomai和梨小食心蟲G.molestaBusck的線粒體COI基因與COⅡ基因序列發(fā)現(xiàn)，COI基因序列中存在30個(gè)穩(wěn)定變異位點(diǎn)，COⅡ基因序列中存在26個(gè)穩(wěn)定變異位點(diǎn)，并以此作為2種食心蟲鑒定的參考依據(jù)。Li等(2011)對(duì)棉鈴蟲Helicoverpa armigera和煙夜蛾H. assulta COI基因序列分析，發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的17對(duì)核苷酸診斷位點(diǎn)可對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。本研究發(fā)現(xiàn)，壯真蝎與普洱真蝎COI基因序列間存在61個(gè)穩(wěn)定差異核苷酸位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)可作為壯真蝎與普洱真蝎分子鑒定的依據(jù)。

線粒體DNA序列的差異可作為不同物種劃分的依據(jù)(Wiens&Penkrot，2002；Hebertet al.，2003a)。例如，Avise和Walker(1999)基于線粒體Cytb基因序列對(duì)252種脊椎動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，90%的脊椎動(dòng)物顯示出超過(guò)2%的序列差異。Hebert等(2003a)基于COI基因序列對(duì)200種鱗翅目Lepidoptera昆蟲分析發(fā)現(xiàn)，COI基因3%的序列差異可用于鱗翅目昆蟲的物種鑒定。Barrett和Hebert(2005)對(duì)203種蛛形綱物種COI基因序列研究發(fā)現(xiàn)，COI基因4%的序列差異可作為鑒定不同物種的標(biāo)準(zhǔn)。本研究中壯真蝎與普洱真蝎的種間平均序列差異為9.6%，同Barrett和Hebert(2005)的研究結(jié)果一致。

種內(nèi)、種間遺傳距離是進(jìn)行物種鑒別的主要標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于COI基因?qū)颜嫘推斩嫘倪z傳距離進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的種內(nèi)平均遺傳距離分別為0.004 0、0.002 3，同Hebert等(2003b)對(duì)動(dòng)物界11個(gè)動(dòng)物門13 320個(gè)物種進(jìn)行分析得出的種內(nèi)遺傳距離大多小于1%，很少大于2%的結(jié)論相符。壯真蝎與普洱真蝎的種間平均遺傳距離(0.103 9)顯著高于種內(nèi)平均遺傳距離(0.003 0)，為種內(nèi)平均遺傳距離的34.6倍，符合種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離10倍以上的原理(Hebertet al.，2004)，且種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離無(wú)重疊區(qū)域，符合對(duì)物種進(jìn)行有效性鑒定的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(Hebertet al.，2003a；Aliabadianet al.，2009)。因此，基于線粒體COI基因的壯真蝎與普洱真蝎的遺傳距離分析表明，COI基因可用于2種蝎的分子鑒定。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，壯真蝎與普洱真蝎的單倍型序列都各自聚為單系枝，且具有較高的分枝自舉值(100%)，與遺傳距離分析得出的結(jié)論一致。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)所有單倍型明顯分為2大類群，整個(gè)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖無(wú)共享單倍型，且種間的單倍型突變步數(shù)高達(dá)62步。以上鑒定結(jié)果同傳統(tǒng)分類結(jié)論吻合(Diet al.，2010a，2010b)。綜上所述，基于線粒體COI基因可實(shí)現(xiàn)對(duì)壯真蝎與普洱真蝎物種的分子鑒定。

本研究首次利用COI基因的部分片段序列對(duì)真蝎屬的壯真蝎與普洱真蝎進(jìn)行分子鑒定，初步證明了DNA條形碼對(duì)壯真蝎與普洱真蝎物種鑒定的有效性。鑒于本實(shí)驗(yàn)的研究利用了COI基因的部分序列片段，與全長(zhǎng)序列相比，包含的信息量有限，且只運(yùn)用了線粒體COI基因進(jìn)行了分析，難免存在一定的局限性。為此，今后需要考慮全長(zhǎng)序列的分析及結(jié)合其他核基因或運(yùn)用下一代測(cè)序技術(shù)開發(fā)更加穩(wěn)定準(zhǔn)確的分子鑒定的基因組標(biāo)記，以此來(lái)驗(yàn)證采用分子手段對(duì)壯真蝎與普洱真蝎物種鑒定的有效性。

致謝：感謝羅康、羅正榮、唐天強(qiáng)、黃順福在樣品采集中給予的支持和幫助，感謝楊陽(yáng)、沈靈、饒峻瑜在實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面給予的指導(dǎo)與幫助。

何靜超， 胡嵐嵐， 郭晨輝， 等. 2016. 小五臺(tái)山蟹蛛DNA條形碼分子鑒定[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 36(3)： 286-292.

彭居俐， 王緒楨， 何舜平. 2008.DNA條形碼技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 水生生物學(xué)報(bào)， 32(6)： 916-919.

王康， 李玉婷， 鄭燕， 等. 2016. 基于線粒體COI和COⅡ基因的沙果小食心蟲與梨小食心蟲的分子鑒定[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 44(2)： 156-164.

楊振升. 2012. 云南省蝎類資源分布、部分種類再記述和形態(tài)差異研究[D]. 昆明： 云南大學(xué).

朱振華， 葉輝， 張智英. 2005. 基于mtDNACytb的六種果實(shí)蠅的分子鑒定(雙翅目： 實(shí)蠅科)[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)， 48(3)： 386-390.

Aliabadian M， Kaboli M， Nijman V，etal. 2009. Molecular identification of birds： performance of distance-based DNA barcoding in three genes to delimit parapatric species[J]. PLoS ONE， 4(1)： e4119. DOI:10.1371/journal.pone.0004119.

Avise JC， Walker D. 1999. Species realities and numbers in sexual vertebrates： perspectives from an asexually transmitted genome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 96(3)： 992-995.

超臨界CO2絡(luò)合萃取法是選擇帶有正電荷的金屬離子和帶有負(fù)電荷的絡(luò)合劑，通過(guò)絡(luò)合反應(yīng)形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，最后在相中加入極性改性劑使配合物與超臨界流體分離。袁超［24］用超臨界CO2絡(luò)合萃取綠茶中Cu2+、Pb2+、Cd2+和萃取壓力為25 MPa、萃取溫度為333 K，靜態(tài)萃取時(shí)間為30 min，重金屬的總萃取率最達(dá)到73.9%，Cu2+、Pb2+、Cd2+的萃取率分別為75.1%，62.3%和61.9%。

Barrett RDH， Hebert PDN. 2005. Identifying spiders through DNA barcodes[J]. Canadian Journal of Zoology， 83(3)： 481-491.

Burland TG. 2000. DNASTAR’s Lasergene sequence analysis software[J]. Methods in Molecular Biology， 132： 71-91.

Clewley JP， Arnold C. 1997. MEGALIGN. The multiple alignment module of LASERGENE[J]. Methods in Molecular Biology， 70(70)： 119-129.

Di Z， He Y， Wu Y，etal. 2011. The scorpions of Yunnan (China)： updated identification key， new record and redescriptions ofEuscorpiopskubaniandE.shidian(Arachnida， Scorpiones)[J]. Zookeys， 30(82)： 1-33.

Di ZY， Cao ZJ， Wu YL，etal. 2010a. A new species of the genusEuscorpiopsVachon， 1980 (Scorpiones： Euscorpiidae， Scorpiopinae) from Yunnan， China[J]. Zootaxa， 2361(1)： 39-48.

Di ZY， Wu YL， Cao ZJ，etal. 2010b. A catalogue of the genusEuscorpiopsVachon， 1980 (Scorpiones： Euscorpiidae， Scorpiopinae) from China， with description of a new species[J]. Zootaxa， 2361(2477)： 49-61.

Felsenstein J. 1985. Confidence limits on phylogenies： an approach using the bootstrap[J]. Evolution， 39(4)： 783-791.

Folmer O， Black M， Hoeh W，etal. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit Ⅰ from diverse metazoan invertebrates[J]. Molecular Marine Biology & Biotechnology， 3(5)： 294-299.

Hebert PDN， Cywinska A， Ball SL，etal. 2003a. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences， 270(1512)： 313-321.

Hebert PDN， Ratnasingham S， de Waard JR. 2003b. Barcoding animal life： cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J]. Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences， 270(suppl_1)： S96-S99.

Hebert PDN， Stoeckle MY， Zemlak TS，etal. 2004. Identification of birds through DNA barcodes[J]. PLoS Biology， 2(10)： e312. DOI:10.1371/journal.pbio.0020312.

Jeanmougin F， Thompson JD， Gouy M，etal. 1998. Multiple sequence alignment with Clustal X[J]. Trends in Biochemical Sciences， 23(10)： 403-405.

Leigh JW， Bryant D. 2015. Popart： full-feature software for haplotype network construction[J]. Methods in Ecology & Evolution， 6(9)： 1110-1116.

Li QQ， Li DY， Ye H，etal. 2011. UsingCOIgene sequence to barcode two morphologically alike species： the cotton bollworm and the oriental tobacco budworm (Lepidoptera： Noctuidae)[J]. Molecular Biology Reports， 38(8)： 5107-5113.

Librado P， Rozas J. 2009. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics， 25(11)： 1451-1452.

Swindell SR， Plasterer TN. 1997. SEQMAN. Contig assembly[J]. Methods in Molecular Biology， 70(70)： 75-89.

Talal S， Tesler I， Sivan J，etal. 2015. Scorpion speciation in the Holy Land： multilocus phylogeography corroborates diagnostic differences in morphology and burrowing behavior amongScorpiosubspecies and justifies recognition as phylogenetic， ecological and biological species[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution， 91： 226-237.

Tamura K， Stecher G， Peterson D，etal. 2013. MEGA6： molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 30(12)： 2725-2729.

Wiens JJ， Penkrot TA. 2002. Delimiting species using DNA and morphological variation and discordant species limits in spiny lizards (Sceloporus)[J]. Systematic Biology， 51(51)： 69-91.

Yamashita T， Rhoads DD. 2013. Species delimitation and morphological divergence in the scorpionCentruroidesvittatus(Say， 1821)： insights from phylogeography[J]. PLoS ONE， 8(7)： e68282.DOI:10.1371/journal.pone.0068282.

Molecular Identification ofEuscorpiopsvalidusandE.puerensisBased on MitochondrialCOIGene Sequences

LI Rong#， ZHENG Yutian#， LI Chunqing， CHEN Yanyan， YANG Zhensheng，CHEN Shanyuan*， XIAO Heng*

(School of Life Sciences， Yunnan University， Kunming 650091， China)

The traditional classification and taxonomy of scorpiones are mainly based on morphological and behavioral characteristics. However， due to the similar morphological characteristics among species， it is difficult to classify and identify distinct species among scorpions. To compensate for the insufficiency of traditional taxonomic methodology， this study used mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ (COI) gene as molecular marker to conduct molecular identification of 2 morphologically similar scorpion speciesEuscorpiopsvalidusandE.puerensis. The partialCOIgene sequences (660 bp) from 24 samples ofE.validusandE.puerensiswere amplified by PCR followed by gene sequencing. The genetic distances， phylogenetic and haplotype network analyses were then carried out. The results showed that： 4 haplotypes with similarity of 99.3%-99.8% were detected in 15 individuals ofE.validus， and 4 haplotypes with similarity of 99.6%-99.8% were found in 9 individuals ofE.puerensis； the interspecific similarity was 90.1%-90.6% and the number of stable differentiated nucleotide sites between the haplotypes of 2 species was 61. The intraspecific average genetic distances amongE.validushaplotypes and amongE.puerensishaplotypes were 0.004 0 and 0.002 3， respectively， while the interspecific average genetic distance betweenE.validusandE.puerensiswas 0.103 9， being 34.6 times higher than that of intraspecific values. In addition， molecular phylogenetic tree clearly showed that the haplotype sequences ofE.validusandE.puerensisclustered as 2 reciprocally monophyletic clades with high bootstrap values (100%). The haplotype network also showed that 8 haplotypes ofE.validusandE.puerensiscan be clearly divided into 2 clades， and the mutation steps between HAP2 haplotype ofE.validusand HAP7 haplotype ofE.puerensisreached 62. These results further confirmed thatE.validusandE.puerensiswere 2 distinct species， and indicated that mitochondrialCOIgene was suitable for molecular species identification ofEuscorpiopsspecies.

Euscorpiopsvalidus；Euscorpiopspuerensis；COIgene； molecular identification

2016-11-07 接受日期：2017-01-03

云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310673008)； 云南大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)資金項(xiàng)目(XT412002)

李蓉(1990—)， 女， 碩士研究生， 主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究， E-mail：12014000884@mail.ynu.edu.cn； 鄭雨田(1992—)， 女， 本科生， 主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究， E-mail：leizhenyu201@163.com#同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者Corresponding author， E-mail：chensy@ynu.edu.cn； xiaoheng@ynu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160305

Q953； Q38

A

1000-7083(2017)02-0139-06