李東紅，馬友記，許開云

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤733300；3.武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅武威733000）

遺傳育種與繁殖

湖寒雜交后代母羊多羔主效基因FecB檢測(cè)

李東紅1，2，馬友記1，2，許開云3

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，民勤733300；3.武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅武威733000）

該研究以小尾寒羊、湖羊、湖寒雜交羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)素材，以FecB基因?yàn)楹蜻x基因，探討多胎基因在3種羊群體中的變化規(guī)律。結(jié)果表明：小尾寒羊、湖羊、湖寒雜交羊FecB基因均有BB、B+、++三個(gè)基因型，其中小尾寒羊的基因型頻率分別為0.47（70）、0.30（44）、0.23（34），湖羊的分別為0.71（117）、0.23（37）、0.06（10），湖寒雜交羊的分別為0.28（70）、0.63（156）、0.08（20）；經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在746 bp處發(fā)生A→G的突變。通過對(duì)FecB的檢測(cè)，為下一步湖寒雜交后代母羊選育提供了理論依據(jù)。

綿羊；FecB基因；主效基因；檢測(cè)

綿羊的多胎性狀屬于經(jīng)濟(jì)性狀，直接影響其養(yǎng)殖效益。近年來，綿羊多胎基因成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)ecB是影響綿羊多胎性狀的主效基因之一。FecB是1980年在布魯拉美利奴羊中發(fā)現(xiàn)的［2］，后來證實(shí)該基因確實(shí)存在并影響綿羊排卵率和繁殖力，1989年正式被綿、山羊遺傳命名委員會(huì)命名為FecB基因［3］。FecB基因編碼區(qū)第746位上發(fā)生了突變位點(diǎn)，由A→G的改變，引起了第249位氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼幔?］。FecB基因在綿羊中的分布范圍狹小，只有在湖羊、小尾寒羊和一些雜種羊中可以檢測(cè)到該基因［5］。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因?qū)β雅蓊w粒細(xì)胞的發(fā)育具有促進(jìn)作用［1］。Piper認(rèn)為，F(xiàn)ecB基因多一個(gè)拷貝數(shù)可以增加1.6個(gè)卵，因此FecB被稱為排卵率的“促使者”［6］。Davis等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB每增加一個(gè)拷貝，排卵率增加90%［7］。本研究應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)湖寒雜交后代母羊的FecB基因進(jìn)行檢測(cè)，并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為研究綿羊多胎性及分子育種機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來自甘肅省民勤縣中信牧業(yè)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，主要的品種：湖羊、湖寒雜交羊、小尾寒羊，總共558只。采用頸靜脈采血，加肝素抗凝，采血后上下顛倒防止血液凝固，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 基因組DNA的提取參照常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 引物按照NCBI上Ovis Areas PRLR mRNA序列設(shè)計(jì)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，之后在NCBI上對(duì)引物進(jìn)行Blast檢測(cè)。設(shè)計(jì)的引物序列信息如表1，引物送到上海生工生物工程公司合成。

表1 候選基因引物序列信息

1.2.3 PCR反應(yīng)條件 PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：10 μL2× Taq PCR Mastermix，上下游引物（10 pmol/μL）各1 μL，模板1μL，ddH2O7μL，各成分加完以后，短暫離心后PCR。

FecB PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；33個(gè)循環(huán)，72℃延伸30 s；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.2.4 產(chǎn)物的回收與測(cè)序 根據(jù)RFLP分析結(jié)果，挑選出不同帶型的PCR產(chǎn)物各2個(gè)，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，并將回收后的產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Popgene32、PIC計(jì)算軟件對(duì)群體的純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）進(jìn)行分析，并評(píng)價(jià)該群體的遺傳多樣性指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果與分析

利用表1中引物序列對(duì)FecB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。由圖1可見，在100bp和150bp之間有1條特異性片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，可以進(jìn)行RFLP分析。

圖1 FecB基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 FecB基因的PCR-RFLP結(jié)果

用AvaⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)FecB基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)746位點(diǎn)上發(fā)生A→G突變時(shí)，就會(huì)使AvaⅡ酶產(chǎn)生酶切位點(diǎn)；由于個(gè)體不同會(huì)導(dǎo)致基因型之間也存在差異，F(xiàn)ecB基因共檢測(cè)出3種不同的類型：第1種：在此位點(diǎn)沒有突變出現(xiàn)，也就是說AvaⅡ限制性內(nèi)切酶沒有切出酶切位點(diǎn)，只有一個(gè)片段（140 bp）和擴(kuò)增片段大小一樣，例如圖2中7、8泳道，此基因型被命名為野生型（+型）；第2種：酶切后出現(xiàn)酶切位點(diǎn)，大小為110 bp，如圖2中5、6泳道，此基因型被命名為純合突變型（BB型）；第3種：酶切后切出2條片段，大小分別為140 bp和110 bp，如圖2中1～4泳道，此基因型被命名為雜合型（B+型）。

圖2 FecB基因擴(kuò)增產(chǎn)物AvaⅡ酶切結(jié)果

2.3 FecB基因的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)分析

由表2可知，3種基因型（BB、B+和++）均可在小尾寒羊、湖羊、湖寒雜交后代母羊群體中檢測(cè)到，BB型為優(yōu)勢(shì)基因型，B基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。由表3可知，小尾寒羊?qū)儆谥卸榷鄳B(tài)（0.25＜PIC＜0.5），χ2適合性檢驗(yàn)表明小尾寒羊群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；湖羊?qū)儆诘投榷鄳B(tài)（P＜0.25），χ2適合性檢驗(yàn)表明湖羊處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）；湖寒雜交屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），χ2適合性檢驗(yàn)表明，湖寒雜交羊處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.4 生物信息學(xué)分析

對(duì)候選基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。檢測(cè)到FecB基因分子量為6 613.73 Da；編碼58個(gè)氨基酸；28種疏水性氨基酸；12種極性氨基酸；理論等電點(diǎn)為pI=6.30；pH=7.0時(shí)，電荷為-0.817；Arg、Leu、Ser在氨基酸中含量最多，占氨基酸總數(shù)的12.1%；其次是Val、Pro、Gly、Ala、Thr，占氨基酸總數(shù)的8.6%；Ile占氨基酸總數(shù)的6.9%；Asp、Asn、Glu、Lys、His、Cys、Gln、Phe、Tyr占氨基酸總數(shù)的5.2%；含量最少的是Met，占氨基酸總數(shù)的3.4%。使用DNAMAN軟件將綿羊FecB基因的mRNA序列與山羊、牛、狗、豬、鼠和人類序列進(jìn)行同源性對(duì)照，結(jié)果顯示與山羊（Capra hircus，NCBI登錄號(hào)：NM-001285575.1）、牛（Bos taurus，NCBI登錄號(hào)：NM-001105328.1）、豬（Sus scrofa，NCBI登錄號(hào)：NM-001039745.1）、狗（Canis Iupus，NCBI登錄號(hào)：NM-001145151.1）、鼠（Mus musculus，NCBI登錄號(hào)：NM-0011277218.1）、人類（Homo sapiens，NCBI登錄號(hào)：NM-001256792.1）的相似性分別是，與山羊的同源性最高為98.81%，其次是與牛的同源性為98.21%，與豬和人類的同源性對(duì)比分別為93.24%、93.04%，與狗和鼠的同源性對(duì)比分別為92.58%、88.93%，這也表明與山羊的親緣關(guān)系最近，與鼠的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表2 FecB基因在羊群體中的基因頻率和基因型頻率

表3 FecB基因在羊群體中的Ho、He、Ne、PIC

3 討論與小結(jié)

綿羊的高繁殖力性能一直受到研究者的關(guān)注，目前在多羔綿羊品系中發(fā)現(xiàn)多個(gè)候選基因，其中以Booroola Merino羊的多羔機(jī)制了解的最為清楚［8］。FecB性狀僅在雌性中表達(dá)，并且直到初情期之后才能準(zhǔn)確度量，所以運(yùn)用DNA檢測(cè)比基于產(chǎn)羔數(shù)或排卵率的選擇具有明顯優(yōu)勢(shì)。DNA檢測(cè)能同時(shí)用于雄性和雌性，可從生后不久的羔羊中收集樣本，如果需要也可以檢測(cè)胚胎。當(dāng)表型不是很好地與基因型相關(guān)聯(lián)時(shí)，例如具有隱性等位基因的位點(diǎn)，外顯率不完全時(shí)，或當(dāng)基因是遺傳印記（genetic imprinting）的時(shí)候，DNA檢測(cè)將為育種方案提供更快的變化［1］。

Davis等檢測(cè)了世界21個(gè)羊種群（家系），僅在中國湖羊和小尾寒羊中發(fā)現(xiàn)FecB突變［5］。本研究通過對(duì)246個(gè)湖寒雜交群體樣本量的酶切檢測(cè)，結(jié)果顯示FecB基因在湖寒雜交羊中均可檢測(cè)到3種基因型（BB、B+和++），B+型為優(yōu)勢(shì)基因型，B基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。湖寒雜交屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。χ2適合性檢驗(yàn)表明，湖寒雜交羊處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)（P＜0.05）。說明FecB基因可能是湖寒雜交羊多羔性能的主效基因之一。中國有31個(gè)地方綿羊品種，只有少數(shù)是多羔品系，其中較為著名的是小尾寒羊（產(chǎn)羔率261.0%）和湖羊（產(chǎn)羔率228.92%）。湖寒雜交羊高繁殖力的分子機(jī)理研究，對(duì)這一優(yōu)勢(shì)資源的保護(hù)與開發(fā)，以及培育肉用多羔綿羊新品系具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR－RFLP研究了FecB基因在小尾寒羊、湖羊、湖寒雜交后代母羊的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)FecB基因中的BB型的頻率呈降低趨勢(shì)，揭示了多胎主效基因代際之間的變化特征。

［1］張利平.Booroola羊多胎基因FecB的研究進(jìn)展［J］.中國草食動(dòng)物，2004，24（S1）：48-50.

［2］Piper L R，B M Bindon.The Booroola Merino and the performance of medium non-Peppin crosses at Armidale［J］.CSIRO，Melbourne，1982：9-19.

［3］顧招兵，毛華明.綿羊FecB基因研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（11）:28-31.

［4］陳曉勇，敦偉濤，田樹軍，等.FecB基因?qū)d羊生產(chǎn)性能影響的研究進(jìn)展［J］.中國草食動(dòng)物科學(xué)，2012，32（4）:59-65.

［5］Davis G H，Balakrishnan L，Ross I K，et al.Investigation of the Booroola（FecB）and Inverdale（FecXI）mutationsin 21 prolific breeds and strains of sheep sampled in 13 countries［J］.Animal Reproduction Science，2006，92（1）:87-96.

［6］Piper LR，Bindon BM，Davis GH.Genetics ofreproduction in Sheep［M］.London：Buttenworths，1985：115-125.

［7］Davis G H，Dodds K G，Wheeler R，et al.Evidence that an imprinted gene on the X chromosome increases ovulation rate in sheep［J］. BiologyofReproduction，2001，64（1）:216-221.

［8］任艷玲，沈志強(qiáng)，李敏，等.洼地綿羊FecB基因多態(tài)性與其產(chǎn)羔數(shù)關(guān)系的研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（7）：159-161.

Detection on Fecundity FecB Gene of Hu Sheep，Small-tail Han Sheep and Their Crossbred Ewes

Li Donghong1，2，Ma Youji1，2，Xu Kaiyun3
（1.College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Sheep BreedingBiotechnologyEngineeringLaboratory，Minqin 737200，Gansu，China；3.Wuwei AcademyofAnimal Husbandryand VeterinaryScience，Wuwei 733000，Gansu，China）

Inorder toexplorethevariationoffecunditygeneintheflockofHusheep，Small-tailhansheepandtheir crossbredewes，the FecB gene were detected.The results showed that the FecB gene had three gene types of BB，B+and++.The gene type frequencies of the FecB gene in Small-tail han sheep were 0.47（70），0.30（44）and 0.23（34），respectively；the gene type frequencies of the FecB gene in Hu sheep were 0.71（117），0.23（37）and 0.06（10），respectively，the gene type frequencies of the FecB gene in their crossbred ewes were 0.28（70），0.63（156）and 0.08（20），respectively.The sequence analysis showed that there was a mutation at 746 bp（A→G）.This detection would provide a theoretical basis for the further breedingofhybrid offspring.

sheep；FecB gene；major gene；detection

S826.2

A

2095-3887（2017）02-0001-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.001

2017-02-16

甘肅省科技重大專項(xiàng)計(jì)劃（1602NKDH020）；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-39）

李東紅（1990-），在讀碩士。

馬友記（1976-），教授，主要從事綿山羊繁育與疫病防治工作。