陳曉英，趙 麗，馬金英，旦增洛桑

（西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009）

VE對4℃保存娟珊牛精液品質的影響

陳曉英，趙 麗，馬金英，旦增洛桑

（西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，拉薩 850009）

為研究維生素E對4℃保存娟姍牛精液品質和抗氧化保護作用的影響，用假陰道法采集體格健碩的娟姍牛精液，在稀釋液中分別添加0 mg/mL、0.01 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.07 mg/mL、0.09 mg/mL的維生素E，將新鮮精液稀釋至1.47×106/mL，于4℃環(huán)境下保存48 h，以評價精子活力、精子頂體完整率、谷胱甘肽還原酶（GR）和過氧化氫酶（CAT）活性等精液品質指標。結果顯示：娟姍牛精液4℃保存至48 h時，維生素E 0.03 mg/mL添加組娟姍牛精子活力顯著高于0.05 mg/mL維生素E添加組（P＜0.05），極顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.01）；維生素E 0.03 mg/mL添加組牛精子頂體完整率極顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.01）；GR酶活性維生素E 0.03 mg/mL添加組牛達71.55 U/L，較0.05 mg/mL維生素E添加組和0.07 mg/mL維生素E添加組高，且差異顯著（P＜0.05），較對照組和其他添加組差異極顯著（P＜0.01）；維生素E 0.03 mg/mL添加組牛精子CAT值達5.68 U/mL，極顯著高于對照組和其他添加組（P＜0.01）。說明在精液稀釋液中添加0.03 mg/mL的維生素E可明顯提高4℃環(huán)境保存娟姍牛精液的品質。

維生素E；娟姍牛；溫度；精液品質

娟姍牛是源自英吉利海峽杰茜島的進口奶牛，是英國政府頒布法令保護的珍貴牛種，其最大的優(yōu)點是乳質濃厚，乳脂、乳蛋白含量均明顯高于普通奶牛，優(yōu)質乳蛋白含量達3.5%以上［1］。鑒于娟姍牛較其他高產奶牛品種體型小、乳脂率高，在高海拔地區(qū)飼養(yǎng)適應能力強等特點，在西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所為技術支撐單位，各級各類黃牛改良項目的支撐下，以娟姍牛精液改良西藏本地黃牛取得了顯著成效。

娟姍牛精液保存技術在低海拔地區(qū)已非常成熟，但推廣應用于高海拔地區(qū)后，由于配種環(huán)境溫度和技術員的操作熟練程度等因素，影響了解凍后人工授精母牛的受胎率。常溫保存人工授精的效果好，且方便經濟，但受到保存時間的限制［2-3］，隨著保存時間的延長公豬精液會引發(fā)脂質過氧化，超氧化物歧化酶（superoxidas dismutase，SOD）活力下降和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量［4-5］降低，最終引發(fā)脂質過氧化，降低體膜電位，提高等離子體膜透性，最終影響受胎率。而維生素E是一種脂溶性維生素，其水解產物為生育酚，是最主要的抗氧化劑之一，不易被酸、堿及熱破壞，但卻極易被氧化。維生素E對線粒體、網狀組織或漿膜的磷脂有著特殊的親和性，存在于這些膜的特定部位。維生素E是重要的抗氧化劑，能通過抑制自由基的形成，阻止誘發(fā)的膜脂質發(fā)生過氧化，從而維持精子頂體膜的完整，提高精子頂體完整率和降低精子畸形率［6-7］。

4℃低溫保存，精子代謝活動水平低，脂質過氧化程度低，保存時間比常溫更長，同時可應用普通冰箱保存，經濟方便［8］。本研究擬在稀釋液中分別添加0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL的維生素E，將娟姍牛新鮮精液稀釋至1.47×106/mL，于4℃環(huán)境保存48 h，以精子活力、精子頂體完整率、GR酶活性和CAT酶活性為評價精液品質指標，探討維生素E對娟姍牛精液品質的影響，以期為娟姍牛精液低溫保存的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與材料

1.1.1 試驗動物與試驗地點 試驗牛為成年、體格健碩的5頭娟姍牛。試驗時間為2016年6—9月，地點為西藏日喀則市江孜縣、西藏自治區(qū)農牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.1.2 主要設備與試劑 牛用假陰道（西藏牧樂農業(yè)科技有限公司提供），倒置熒光顯微鏡（IX73奧林巴斯），電熱恒溫水槽 （DKB-450A上海森信），變頻冰箱（BCD-649WDVC海爾），-80℃冰箱（MDF-U33V合肥榮事達三洋電器股份有限公司）。

維生素E（宜昌人福藥業(yè)有限責任公司），考馬斯亮藍（國藥集團化學試劑有限公司），Diff-Quik Stain染液（北京普博斯），牛用精液稀釋液（西藏牧樂農業(yè)科技有限公司提供），谷胱甘肽還原酶（GR）和過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

新鮮娟姍牛精液來自西藏自治區(qū)日喀則市江孜縣某奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.2 試驗方法與內容

1.2.1 牛用精液稀釋液 參照廠家提供的說明書使用。

1.2.2 精液采集及處理 采用假陰道法于每周二和周五上午9：00采集體格健碩的娟姍牛精液。鮮精經過常規(guī)檢測，活力大于0.60，密度在1.47×109/mL以上的正常精液用于本次試驗。采用一步稀釋法對精液進行稀釋，稀釋后的精液濃度在1.47×106/mL以上。用6層以上紗布包裹后放入培養(yǎng)箱中，17℃平衡2h后，放入冰箱4℃保存。

1.2.3 精子質量評價 精子活力和精子畸形率兩項精液常規(guī)性狀參照世界衛(wèi)生組織標準（WHO）［9］的方法測定，具體方法如下：

精子活力：精液過濾后立即在顯微鏡下觀察精子活力，采用百分制法，直線前進精子數占總精子數的百分比為精子活力。

精子頂體完整率參照文獻［10］采用考馬斯亮藍R250染色法進行評價。

1.2.4 精液GR和CAT活性的測定 參照GR和CAT測定試劑盒說明書進行。

1.3 試驗設計

試驗分6組，在稀釋液中分別添加0、0.01、0.03、0.05、0.07和0.09 mg/mL的維生素E，將牛新鮮精液稀釋至1.47×106/mL，用6層以上紗布包裹后放入培養(yǎng)箱中，17℃平衡2 h后，放入4℃冰箱保存48 h，檢測娟姍牛精子活力、精子頂體完整率。

每次采精后收集精液，取2 mL鮮精液于玻璃離心管中，在4 000 r/min離心分離15 min，取精漿分裝于5 mL塑料離心管，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于精漿GR和CAT測定。試驗重復3次。

1.4 數據處理

所得試驗數據用Excel進行前期處理，再用SPSS11.5軟件進行One-WayANOVA方差分析，并進行多重比較，試驗結果用“平均數±標準差”表示，檢驗誤差為5%和1%。

2 結果與分析

2.1 維生素E對4℃保存娟姍牛精液品質的影響

由表1可以看出，娟姍牛精液4℃保存至48 h時，維生素E 0.03 mg/mL添加組娟姍牛精子活力顯著高于0.05 mg/mL維生素E添加組（P＜0.05），極顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.01）；維生素E 0.03 mg/mL添加組精子頂體完整率也極顯著高于對照組和其他試驗組（P＜0.01）。

2.2 維生素E對4℃保存娟姍牛精液GR和CAT的影響

由表2可以看出，娟姍牛精液4℃保存至48 h時，維生素E 0.03 mg/mL添加組娟姍牛精子GR酶活性達71.55 U/L，顯著高于0.05 mg/mL維生素E添加組和0.07mg/mL維生素E添加組（P＜0.05），極顯著高于對照組和其他添加組（P＜0.01）；維生素E 0.03 mg/mL添加組娟姍牛精子CAT值達5.68 U/mL，極顯著高于對照組和其他添加組（P＜0.01）。

表1 維生素E對4℃保存48 h娟姍牛精液品質的影響

表2 維生素E對4℃保存48 h娟姍牛精液GR和CAT的影響

3 討論

精子的活力與受精能力密切相關，既是評定凍后精液品質的重要指標，又是評定解凍后精子是否具備輸精資格的重要因素［11］。

Sarlos等［12］研究發(fā)現，維生素E是動物機體最重要的抗氧化劑，它可以通過抑制體內自由基的形成，阻止誘發(fā)膜脂質發(fā)生過氧化，最終提高動物精子頂體完整率和降低精子畸形率。Elizabeth等［13］研究表明，維生素E還能防止精子發(fā)生冷休克，提高凍精解凍后的精子活力，從而提高受精率。趙曉娥等［14］在波爾山羊凍精的稀釋液中添加維生素E，發(fā)現解凍后的波爾山羊精子活力較對照組明顯升高。補飼維生素E不僅可有效減少兔子精液中活性氧（ROS）的產物，而且還可有效改善精液品質［15］。本試驗證明維生素E可以提高高海拔環(huán)境下飼養(yǎng)的娟姍牛精液4℃保存48 h后精子的活力和頂體完整率，保護精漿中的GR酶活性和CAT酶活性，從而提高精液品質。

維生素E 0.03 mg/mL添加組娟姍牛的精子活力和頂體完整率均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）高于其他添加組；且維生素E 0.03 mg/mL添加組對精漿中的GR酶活性和CAT酶活性起到最大保護作用，4℃保存48 h娟姍牛精液GR可達71.55 U/L，CAT值可達5.68 U/mL。

4 結論

在精液稀釋液中添加維生素E 0.03 mg/mL可有效提高4℃保存48 h娟姍牛精液精子的活力和頂體完整率，保護精漿中的GR酶活性和CAT酶活性，進而提高精液品質。本研究不僅可為娟姍牛精液低溫保存的進一步研究奠定基礎，而且還可為高海拔地區(qū)奶牛繁育技術力量薄弱的基層技術人員提供技術參考。

［1］王根林.養(yǎng)牛學［M］.2版.北京：中國農業(yè)出版社，2010：30-31.

［2］龔宏智.牛精液低溫保存時間長短對受胎率的影響［J］.黃牛雜志，1997（3）：51.

［3］米占鋒.環(huán)境控制和不同稀釋液對牛冷凍精液中微生物含量的影響［J］.中國奶牛，2015（S4）：21-23.

［4］楊威.三種抗氧化劑對豬精子冷凍保存效果的影響［D］.陜西楊凌：西北農林科技大學，2015.

［5］朱林煒.GSH和SOD對豬精液常溫保存效果的研究［D］.陜西楊凌：西北農林科技大學，2015.

［6］楊海濤，賈永紅.維生素E和C保護精子的作用研究進展［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2009，28（3）：39-40.

［7］姚桂東，陶勇，章孝榮.維生素B12、E和C在家畜精液保存中的應用［J］.動物醫(yī)學進展，2006，27（3）：36-39.

［8］任子利，趙彥玲，王建洲，等.維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2016，47（5）：1057-1061.

［9］WHO.Laboratory test handbook about the interaction between semen and cervical mucus［M］.PressⅢ，Beijing：Scientific Editor，1994：9-13.

［10］胡傳活，許春榮，陸媚，等.黃芪多糖對豬精液低溫保存的影響［J］.中國獸醫(yī)學報，2015，35（1）：150-154.

［11］劉玉堂.精液冷凍保存的影響因素分析［J］.黑龍江動物生產雜志，2003，11（2）：10-14.

［12］Sarlos P，Blanco M T.Improvement of ram sperm cryopreservation protocols assessed by sperm quality parameters and heterogeneity analysis［J］.Cryobiology，2008，37（1）：1-12.

［13］Elizabeth Breininger，Norma B Beorlegui，Cristian M O'Flaherty.Alpha-tocopherol improves biochemical and dynamic parameters in cryopreserved boar semen［J］.Theriogenology，2005（63）：2126-2135.

［14］趙曉娥，王光亞，王希朝.布爾山羊精液保存條件研究［J］.動物醫(yī)學進展，1999，20（2）：31-33.

［15］YousefMI，Abdallah GA，Kamel KI.Effect of ascorbic acid and vitamin E supplementation on semen quality and biochemical parameters ofmale rabbits［J］.AnimReprod Sci，2003，76（2）：99-111.

Effects of Vitamin E on the Semen Quality of Jersey Cattle at 4℃

Chen Xiaoying，ZhaoLi，Ma Jinying，et al
（Institute ofAnimal Science，Tibet AcademyofAgricultural and Animal HusbandryScience，Lhasa 850009，China）

In order toinvestigate the effects ofvitamin E on the qualityand antioxidation ofsemen at 4℃in Jerseycattle，the sperm motility，acrosome integrityrate，glutathione reductase（GR），catalase（CAT）activityofsemen，which were diluted to1.47×106/mL with dilutions with different additions of vitamin E（0 mg/mL，0.01 mg/mL，0.03 mg/mL，0.05 mg/mL，0.07 mg/mL，0.09 mg/mL）and stored at 4℃for 48 h，were studied.The results showed that the sperm motility in the group of 0.03 mg/mL was significantly higher than that in the group of 0.05 mg/mL（P＜0.05）and extremely significantly higher than those in other groups（P＜0.01）；the acrosome integrity rate in the group of 0.03 mg/mL was extremely significantly higher than those in other groups（P＜0.01）；the glutathione reductase（GR）activity in the group of 0.03 mg/mL reached 71.55 U/L，significantly higher than those in the groupsof0.05mg/mLand0.07mg/mL（P＜0.05），extremelysignificantlyhigherthanthoseinothergroups（P＜0.01）；thecatalase（CAT）activityreached 5.68 U/L，extremelysignificantlyhigher than those in other groups（P＜0.01）.It was concluded that the addition of vitamin E at the concentration of0.03 mg/mLin the dilution could improve the environment for storingJerseycattle semen at 4℃.

vitaminE；Jerseycattle；temperature；semenquality

S823.3

A

2095-3887（2017）02-0008-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.003

2017-01-06

西藏自治區(qū)自然科學基金（2016ZR-15-51）

陳曉英（1981-），女，助理研究員，碩士，主要從事高原奶牛生產和疫病防控研究工作。