韓欣月，王 梓，李 偉，孫印石，許興月，唐 姍，李慧萍

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130112）

人參莖葉總皂苷對(duì)順鉑致小鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

韓欣月1，王 梓1，李 偉1，孫印石2，許興月1，唐 姍1，李慧萍1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130112）

目的 觀察人參莖葉總皂苷（GSLS）對(duì)順鉑（CDDP）誘導(dǎo)腎損傷小鼠的保護(hù)作用，并探討其可能機(jī)制。方法 32只雄性ICR小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CDDP模型組（一次性ip給予CDDP 20 mg·kg-1誘導(dǎo)小鼠腎損傷）、CDDP+GSLS 150和300 mg·kg-1給藥組。給藥組連續(xù)給予GSLS 7 d，末次給藥1 h后，一次性ip給予CDDP 20 mg·kg-1誘導(dǎo)小鼠腎損傷，繼續(xù)給予GSLS 150和300 mg·kg-13 d，分別采用脲酶法和肌氨酸氧化酶法檢測(cè)小鼠血尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平，評(píng)價(jià)腎功能的變化；分別采用可見(jiàn)光法和微量酶標(biāo)法檢測(cè)腎組織中過(guò)氧化氫酶（CAT）和還原型谷胱甘肽（GSH）水平，評(píng)價(jià)小鼠腎組織中氧化應(yīng)激的水平；采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β），評(píng)價(jià)腎組織中炎癥水平；HE和PAS染色法觀察腎組織病理變化；TUNEL和Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，CDDP組小鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05），腎指數(shù)和血清中CRE，BUN，TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），其中CRE和BUN分別升高了1倍和3倍，腎組織CAT和GSH顯著下降（P＜0.05）；CDDP組腎組織中出現(xiàn)腎小球腫脹、腎小管擴(kuò)張、腎小球上皮細(xì)胞壞死，管腔內(nèi)出現(xiàn)透明管型，細(xì)胞核固縮或消失，腎間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，大量糖原沉積，此外還有大量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和Hoechst33258陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)；與CDDP組比較，GSLS各治療組小鼠血清中CRE和BUN水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），腎組織糖原沉積減少，腎小管上皮細(xì)胞凋亡減少（P＜0.05）；CDDP+GSLS 300 mg·kg-1組TNF-α和IL-1β顯著降低（P＜0.05），CAT和GSH顯著升高（P＜0.05），腎組織壞死程度減輕（P＜0.05）。結(jié)論GSLS對(duì)CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)及抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。

皂苷；順鉑；腎損傷；氧化應(yīng)激；炎癥

順鉑全名為順式-1，2-二氯二氨合鉑（CDDP），是當(dāng)前臨床上最有效和最常用的抗腫瘤藥物之一，廣泛用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、惡性淋巴癌、乳腺癌、甲狀腺癌及成骨肉瘤等多種實(shí)體腫瘤的治療。目前，在美國(guó)和加拿大治療頭頸部癌、睪丸癌和卵巢癌等18種癌癥的推薦藥物中，CDDP被推薦為首選藥物［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，CDDP的療效隨著給藥劑量的增加而增加，其對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的毒副作用亦會(huì)隨著劑量的增加而增加，如腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性及胃腸道反應(yīng)等，其中腎毒性最為嚴(yán)重，使其臨床應(yīng)用受到限制［2-4］。

CDDP所致腎損傷一般是可逆的，但在大劑量或連續(xù)給藥時(shí)，可使腎小管損傷表現(xiàn)為不可逆性［5］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床用CDDP化療所致腎損傷發(fā)生率約為30%［6］。CDDP所致腎毒性的機(jī)制尚不十分清楚［7］。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于減輕CDDP腎毒性的研究工作，但在臨床上可應(yīng)用的藥物迄今為止甚少［8］。臨床上采用水方法或滲透性利尿藥可減少CDDP毒性，但其腎毒性的發(fā)生率仍然＞30%［9］。因此，如何減輕CDDP腎毒性仍是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

血肌酐（creatinine，CRE）和尿素氮（blood urea nitroge，BUN）是機(jī)體蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物，反映氮的分解和腎的排泄功能，因此二者常被作為腎組織損傷程度的指標(biāo)［10］。近年來(lái)研究表明，CDDP所致腎損傷與氧化應(yīng)激和抑制腎皮質(zhì)清除自由基的能力有關(guān)［11-12］。過(guò)氧化氫（H2O2）是一種代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢物，它會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，而過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）能有效催化過(guò)H2O2分解。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種非酶抗氧化劑，可與某些藥物、毒素等結(jié)合而具有整合解毒作用，對(duì)CDDP所致腎損傷起保護(hù)作用［13］。研究表明，腎GSH的減少可大大增加CDDP的毒性和腎對(duì)化學(xué)氧化損傷的敏感性。機(jī)體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大量產(chǎn)生的氧自由基如不能及時(shí)清除，誘發(fā)生物膜中不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致脂肪酸鏈和細(xì)胞膜完整性的破壞［14］。腎是機(jī)體中主要的代謝器官，易受各種應(yīng)激刺激的影響。研究確認(rèn)氧化應(yīng)激促發(fā)腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，損傷腎組織細(xì)胞。

腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）是參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞因子，其含量與病情的發(fā)展具有相關(guān)性［15］，可作為炎癥過(guò)程中具有標(biāo)志的因子。

人參為五加科人參屬植物人參（Panax gin?seng C.A.Meyer）的干燥根及根莖，是藥用歷史悠久的名貴中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品［16］。人參的主要活性成分為人參皂苷［17］，為了綜合利用人參的地上部分，人們開(kāi)始對(duì)人參莖葉的化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)人參莖葉含有大量的莖葉皂苷（約7%～16%），其藥理活性與人參根類似［18］。

人參莖葉總皂苷（total saponins from stems and leaves of P.ginseng，GSLS）是2015年版《中國(guó)藥典》收載的品種，由于其富含人參皂苷并具有顯著的生理活性，一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷具有抗高脂血癥及清除氧自由基的作用［19］，但尚未見(jiàn)其對(duì)順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷保護(hù)作用的相關(guān)研究報(bào)道。本研究探討GSLS對(duì)CDDP誘導(dǎo)小鼠腎損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為深入開(kāi)發(fā)皂苷類成分的腎損傷保護(hù)治療劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

SPF級(jí)雄性ICR小鼠32只，體質(zhì)量22～25g，（長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司），合格證號(hào)：SCXK（吉）2011-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)條件符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的要求，小鼠自由攝食和飲水，室溫（23.0～25.0）℃，濕度55%～65%，明暗交替12 h的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

GSLS（純度＞80%，紫外線法），（撫松縣安東參業(yè)有限公司）；CDDP（規(guī)格1g，99.0%Pt.＞64.5%，批號(hào)：C02150206）（上海思域化工科技有限公司）；蘇木素-伊紅染液（HE），CRE，BUN，CAT，GSH試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α和 IL-1β ELISA試劑盒（美國(guó) R&D公司）；Hoechst33258染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PAS染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為分析純。

PL303電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；HC-2517高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；T10高速組織勻漿機(jī)（德國(guó)IKA）；SPECTRO star Nano全波長(zhǎng)掃描式酶標(biāo)儀（德國(guó)BMG LABTECH公司）；顯微鏡Leica DM 500和Leica DM 2500熒光顯微鏡（德國(guó)徠卡）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組（ig給予同樣劑量的生理鹽水）、CDDP模型組（一次性ip CDDP 20 mg·kg-1）、CDDP+ GSLS 150，300 mg·kg-1給藥組（ig給予GSLS），每組8只。給藥組連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后，一次性ip給予CDDP 20 mg·kg-1誘導(dǎo)小鼠腎損傷，繼續(xù)給予GSLS 150和300 mg·kg-13 d。所有小鼠在ip給予CDDP 72 h后眼眶靜脈叢取血，全血離心（3500×g，4℃）2次，每次5 min，收集血清。解剖前12 h禁食不禁水，解剖后取腎組織，左腎置于-80℃保存，用于生化指標(biāo)檢測(cè)；右腎固定在10%甲醛中用于組織病理學(xué)分析。

1.3 體質(zhì)量和臟器系數(shù)的測(cè)定

計(jì)算實(shí)驗(yàn)前后小鼠體質(zhì)量的差值，記為體質(zhì)量變化值。連續(xù)給藥10 d，處死小鼠，稱取肝、脾和腎質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)重（g）×100［20］。

1.4 試劑盒測(cè)定血清中CRE，BUN和腎組織中GSH，CAT的含量

采用肌氨酸氧化酶法和脲酶法試劑盒測(cè)定血清中CRE和BUN水平。取凍存的腎組織，制備組織勻漿，取上清液，采用二硫代對(duì)硝基苯法和鉬酸銨法試劑盒測(cè)定GSH和CAT的水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各自的吸光度（A405nm）值，根據(jù)說(shuō)明書要求計(jì)算含量。

1.5 ELISA法檢測(cè)血清TNF-α 和IL-1β 含量

采用ELISA法測(cè)定血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。

1.6 HE和PAS染色法檢測(cè)腎組織病理變化

1.6.1 HE染色

取小鼠腎組織，經(jīng)過(guò)固定、透明、脫水、浸蠟和包埋，制作常規(guī)病理切片，切片厚度5 μm。每組取4張切片，通過(guò)二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水至水化，蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，自來(lái)水返藍(lán)，伊紅對(duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色，常規(guī)脫水和透明，最后用中性樹(shù)膠封片。通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)病變情況進(jìn)行觀察。病理標(biāo)本進(jìn)行編號(hào)，每組選取3個(gè)標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選取8個(gè)視野，根據(jù)腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)分［22］。0：無(wú)損傷；1：腎小管上皮腫脹，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；2：腎小管出現(xiàn)大面積炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔擴(kuò)張；3：腎小管上皮細(xì)胞核染色消失，管腔明顯擴(kuò)張；4：腎小管結(jié)構(gòu)破壞，上皮細(xì)胞無(wú)核著色。利用Ridit分析［23］HE染色結(jié)果。

1.6.2 PAS染色

每組隨機(jī)取4個(gè)樣本，每個(gè)樣本選3張片子進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，切片厚度5 μm，石蠟切片脫蠟和水化，PAS染液進(jìn)行染色，脫水和透明，最后中性樹(shù)膠封片封存。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織變化。

1.7 Hoechst33258和TUNEL染色法檢測(cè)腎小管細(xì)胞凋亡

1.7.1 Hoechst33258染色

取厚度5 μm的切片，用Hoechst33258進(jìn)行染色。首先進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化，染色，逐級(jí)常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，最后封片。在熒光顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞核變化以及凋亡狀態(tài)。細(xì)胞核亮度增強(qiáng)的為陽(yáng)性表達(dá)，顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，計(jì)算腎小管陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和腎小管細(xì)胞總數(shù)［21］。腎小管細(xì)胞凋亡率（%）=腎小管陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腎小管細(xì)胞總數(shù)×100%

1.7.2 TUNEL染色

取厚度5 μm的石蠟切片，進(jìn)行TUNEL染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞核變化及凋亡。細(xì)胞核染成棕色為陽(yáng)性表達(dá)，計(jì)算腎小管細(xì)胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GSLS對(duì)CDDP致腎損傷小鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)的影響

正常對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)情況良好，毛順色亮，體質(zhì)量增加。表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，CDDP組毛色成縷，且無(wú)光，體質(zhì)量減輕，但并無(wú)小鼠死亡，脾系數(shù)顯著降低（P＜0.01），腎系數(shù)顯著升高（P＜0.05），表明小鼠腎和脾受到損傷。與CDDP組相比，CDDP+GSLS 300 mg·kg-1組，小鼠毛色明顯好轉(zhuǎn)，體質(zhì)量下降得到緩解，CDDP+GSLS 150 mg·kg-1組脾系數(shù)降低以及CDDP+GSLS 300 mg·kg-1組腎系數(shù)升高的幅度都得到明顯改善（P＜0.05）。各組肝系數(shù)均無(wú)明顯變化。

2.2 GSLS對(duì)CDDP致腎損傷小鼠血清BUN，CRE水平及腎組織GSH和CAT水平的影響

與正常對(duì)照組相比，CDDP組小鼠血清中的CRE和BUN水平顯著升高（P＜0.01），表明腎組織受到損害，順鉑腎損傷造模成功；與模型組比較，CDDP+ GSLS和300 mg·kg-1組血清中CRE和BUN水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖1）。

與正常對(duì)照組相比，CDDP組小鼠腎組織勻漿中GSH和CAT的水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，CDDP+GSLS 150 mg·kg-1組組織勻漿中GSH和CAT水平無(wú)明顯變化；CDDP+GSLS 300 mg·kg-1組GSH和CAT水平均顯著升高（P＜0.05）。表明GSLS 300 mg·kg-1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)GSH和CAT的氧化應(yīng)激水平，從而起到腎保護(hù)作用（圖1）。

Tab.1 Effect of total saponins from stems and leaves of P.Ginseng（GSLS）on body mass，and indices of liver，spleen and kidney in cisplatin（CDDP）-induced acute kidney injury mice

Fig.1 Effect of GSLS on creatinine（CRE）and blood urea nitroge（BUN）in serum，and glutathione（GSH）and catalase（CAT）levels in kidney tissue of CDDP-induced acute kidney injury mice.See Tab.1 for mouse treatment.，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with CDDP group.

2.3 GSLS對(duì)CDDP致腎損傷小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平的影響

與正常對(duì)照組比，CDDP組小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平顯著升高（P＜0.05）；與CDDP組相比，CDDP+GSLS 150mg·kg-1組血清中TNF-α和IL-1β水平變無(wú)明顯變化；CDDP+GSLS300mg·kg-1組血清中TNF-α和IL-1β的水平顯著降低（P＜0.05）。表明GSLS 300 mg·kg-1能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮腎保護(hù)作用（圖2）。

2.4 GSLS對(duì)CDDP致腎損傷小鼠組織形態(tài)的影響

2.4.1 HE染色

Fig.2 Effect of GSLS on levels of tumor necrosis factor α（TNF-α ）and interleukin-1β （IL-1β ）of CDDP-induced acute kidney injury mice.See Tab.1 for mouse treatment.，n=8.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CDDP group.

根據(jù)HE染色結(jié)果（圖3），正常對(duì)照組腎組織中，腎小球及其周圍腎小管結(jié)構(gòu)正常且清晰，細(xì)胞外基質(zhì)分布均勻，無(wú)病變現(xiàn)象；而CDDP組中腎小球腫脹，體積明顯增大，囊腔模糊，腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞部分壞死，管腔內(nèi)出現(xiàn)透明管型，細(xì)胞核固縮或消失，腎間充質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CDDP+GSLS 150 mg·kg-1組與CDDP組比較，腎小管上皮細(xì)胞壞死程度減輕，細(xì)胞核固縮和消失現(xiàn)象減少；CDDP+GSLS 300 mg·kg-1組腎小球囊腔內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞壞死明顯減少，透明管型現(xiàn)象減少，間充質(zhì)內(nèi)水腫及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常。根據(jù)Ridit分析可知，CDDP組與正常對(duì)照組比較出現(xiàn)更高的腎小管壞死等級(jí)，同時(shí)GSLS 300 mg·kg-1+CDDP組與CDDP組相比，壞死等級(jí)降低（P＜0.05）（表2）。

Fig.3 Effect of GSLS on pathological changes of acute kidney injury mice induced by CDDP（HE staining）.See Tab.1 for mouse treatment.The arrows show renal pathological changes including renal tubular epithelial cell necrosis，cell structure collapse and inflammatory infiltration.

2.4.1 PAS染色

根據(jù)PAS染色結(jié)果（圖4），正常對(duì)照組小鼠腎小球和腎小管較少糖原沉積，著色較淡，未見(jiàn)病理變化；CDDP組腎小球基底膜增厚，系膜基質(zhì)增生，大量糖原沉積，部分腎小管輕度萎縮或管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞壞死，細(xì)胞核消失；CDDP+GSLS 150 mg·kg-1組腎小球和腎小管細(xì)胞內(nèi)糖原沉積減少；CDDP+GSLS 300 mg·kg-1組細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常。

2.5 GSLS對(duì)CDDP致腎損傷小鼠細(xì)胞凋亡的影響

2.5.1 Hoechst33258染色

Fig.4 Effect of GSLS on pathological changes in acute kidney injury mice induced by CDDP（PAS staining）.See Tab.1 for mouse treatment.The arrows show the glycogen deposition.

Tab.2 Effect of GSLS on pathological changes of acute kidney injury mice induced by CDDP analyzed by renal tubular necrosis grade

Fig.5 Effect of GSLS on CDDP-induced apoptosis by Hoechst33258 staining（A）and TUNEL staining(B).See Tab.1 for mouse treatment.The arrows show renal tubular epithelial cell apoptosis.A2 and B2 was semi-quatitative results of A1 and B1，respectively.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with CDDP group.

根據(jù)Hoechst33258染色結(jié)果（圖5A1），正常對(duì)照組未見(jiàn)藍(lán)色熒光細(xì)胞核，說(shuō)明無(wú)細(xì)胞凋亡；CDDP組出現(xiàn)大量分布均勻的藍(lán)色熒光細(xì)胞核，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)破碎，且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；CDDP+GSLS 150和300 mg·kg-1組藍(lán)色熒光細(xì)胞核減少，說(shuō)明GSLS能夠顯著抑制細(xì)胞凋亡。由圖5A2可知，CDDP組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01），給予GSLS治療后，CDDP+ GSLS150和300mg·kg-1組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

2.5.2 TUNEL染色

根據(jù)TUNEL染色結(jié)果（圖5B1），正常對(duì)照組小鼠正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，無(wú)病理變化；CDDP組腎小管上皮細(xì)胞核呈棕色，且陽(yáng)性表達(dá)較多，同時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞核不同程度裂解。CDDP+GSLS 150和300 mg·kg-1組損傷有不同程度的緩解。由圖5B2可知，CDDP組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01），在給予GSLS治療后，CDDP+GSLS 150和300 mg·kg-1組與CDDP組相比細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，CDDP 20 mg·kg-1誘導(dǎo)小鼠血清CRE和BUN水平顯著升高的同時(shí)，腎組織中的GSH和CAT水平顯著降低。GSLS給藥組，血清CRE和BUN水平降低，GSH和CAT水平升高，CDDP所致小鼠腎功能損傷得到不同程度的恢復(fù)。應(yīng)用CDDP腹腔注射誘導(dǎo)急性腎損傷，結(jié)果顯示，順鉑注射后小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平明顯升高，而CDDP+GSLS 150和300 mg·kg-1組TNF-α和IL-1β水平均不同程度地降低，表明GSLS能夠通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮腎保護(hù)作用。

HE染色中蘇木素使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿呈紅色，因此組織成分與病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均可顯示出來(lái)；PAS染色可觀察到組織中的糖原以及腎小球基底膜的著色，進(jìn)而觀察組織病理變化。本研究同時(shí)進(jìn)行了HE染色和PAS染色。對(duì)腎組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。兩種結(jié)果同時(shí)表明，GSLS對(duì)CDDP誘導(dǎo)的腎組織損傷具有治療效果。

Hoechst33258為特異性DNA染料，與A-T鍵結(jié)合，這種染料對(duì)死細(xì)胞立即染色，而活細(xì)胞的著色是漸進(jìn)的，在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞呈彌散均勻熒光，出現(xiàn)凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染的顆粒狀熒光；TUNEL染色是對(duì)組織細(xì)胞凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA斷裂情況的檢測(cè)，與斷裂DNA的3′-OH端特異性結(jié)合，出現(xiàn)凋亡時(shí)呈深棕色。為了進(jìn)一步佐證Hoechst33258染色結(jié)論，本研究又進(jìn)行了TUNEL染色。研究結(jié)果表明，GSLS各組凋亡現(xiàn)象明顯減少，說(shuō)明GSLS通過(guò)抗凋亡作用發(fā)揮腎保護(hù)作用。

腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度損傷是急性腎功能異常的重要機(jī)制。當(dāng)損傷程度相對(duì)較輕時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，較重時(shí)致使細(xì)胞死亡，可通過(guò)藥物治療降低細(xì)胞損傷，從而達(dá)到治療疾病的目的［24］。

本研究結(jié)果表明GSLS對(duì)順鉑誘導(dǎo)腎損傷小鼠的保護(hù)作用，其可能的機(jī)制包括抑制氧化應(yīng)激，減少炎癥反應(yīng)及抑制細(xì)胞凋亡。GSLS主要包括二醇型皂苷（Rb1，Rb2，Rc和Rd）和三醇型皂苷（Rg1和Re），而具體何種皂苷發(fā)揮腎保護(hù)作用將是以后研究重點(diǎn)。

綜上所述，GSLS通過(guò)改善氧化應(yīng)激水平，減少炎性反應(yīng)，以及抗細(xì)胞凋亡途徑，減輕CDDP誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。

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Protective effect of total saponins from stems and leaves of Panax ginseng on cisplatin-induced kidney damage in mice and its mechanism

HAN Xin-yue1,WANG Zi1,LI Wei1,SUN Yin-shi2,XU Xin-yue2,TANG Shan1,LI Hui-ping1
(1.College of Chinese Medicinal Materials,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China; 2.Institute of Special Wild Economic Animals and Plants,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Changchun 132109,China)

OBJECTIVE To investigate the protective effect of total saponins from stems and leaves of Panax ginseng(GSLS)on cisplatin(CDDP)-induced kidney damage in mice and its possible mechanism.METHODS Thirty-two male ICR mice were randomly divided into normal control group,CDDP group,and GSLS(150 and 300)+CDDP groups.GSLS was administered to mice by oral gavage once a day for 7 d.On the 7thday,a single injection of CDDP 20 mg·kg-1was given 1 h after GSLS 150 and 300 mg·kg-1before GSLS 150 and 300 mg·kg-1continued to be given for 3 d.Blood urea nitrogen (BUN)and creatinine(CRE),catalase(CAT)in renal tissue,reduced glutathione(GSH),tumor necrosis factor α(TNF-α)and interleukin 1β(IL-1β)of cisplatin induced mice were detected after 72 h.HE and PAS staining were used to observe the renal histopathological changes;While TUNEL and Hoechst33258 staining were employed to observe apoptosis in kidney tissues.RESULTS Compared with normal control group,CDDP group had a significant reduction in relative body mass(P＜0.05),and the level of GSH and CAT in kidney tissues(P＜0.05).The level of CRE,BUN,TNF-α,and IL-1β in serum and renal indexes significantly increased(P＜0.05,P＜0.01),especially BUN and CRE that respectively doubled and quadrupled. CDDP group developed glomerulus swelling,renal tubular expansion and epithelial cell necrosis.Trans?parent tube type of tube cavity appeared,the nucleus pycnosis disappeared,but renal interstitial edema and inflammatory cell infiltration appeared.There was a large amount of glycogen deposition and high expressions of TUNEL positive cells and Hoechst33258 positive cells.Compared with CDDP group,the levels of BUN and CRE in GSLS treatment group significantly decreased(P＜0.05,P＜0.01)in serum, glycogen deposition was reducted and apoptosis of renal tubular epithelial cells decreased in kidney tissues (P＜0.05).The level of TNF-α,IL-1β(P＜0.05)and the degree of renal tissue necrosis were significantly reduced(P＜0.05)in CDDP+GSLS 300 group,but there was a significant increase in the level of CAT and GSH(P＜0.05).CONCLUSION GSLS can protect against mouse kidney injury induced by cisplatin.The mechanism may be related to oxidation,reduced inflammation reaction and resistance to apoptosis.

saponins;cisplatin;kidney damage;oxidative stress;inflammation

LI Wei,E-mail:liwei7727@126.com

R285

A

1000-3002-（2017）02-0151-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.05

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31201331);Jilin Province Study Abroad Retumees Start-Up Fund(20130303096YY);Ginseng Industry Technology System(20130311);Jilin Province Research Start Funds Returned People;and The First Youth Top Creative Talents Support Program of Jilin Agricultural University

2016-03-30 接受日期：2017-01-23）

（本文編輯：賀云霞）

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201331)；吉林省留學(xué)歸國(guó)人員啟動(dòng)基金(20130303096YY)；人參產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(201303111)；吉林省留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)首批青年拔尖創(chuàng)新人才支持計(jì)劃

韓欣月，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)與生物活性研究；李 偉，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

李 偉，E-mail：liwei7727@126.com