嚴 明，張 云，劉珂舟，孫永紅

（1.杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院，浙江杭州 310018；2.紹興文理學院基礎醫(yī)學院，浙江紹興 312000；3.浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院，浙江省心腦血管檢測技術與藥效評價重點實驗室，浙江杭州 310027）

碲化鎘量子點對血管平滑肌細胞的損傷作用

嚴 明1，張 云2，劉珂舟1，孫永紅3

（1.杭州電子科技大學生命信息與儀器工程學院，浙江杭州 310018；2.紹興文理學院基礎醫(yī)學院，浙江紹興 312000；3.浙江大學生物醫(yī)學工程與儀器科學學院，浙江省心腦血管檢測技術與藥效評價重點實驗室，浙江杭州 310027）

目的 觀察碲化鎘量子點（CdTe QD）在體外對大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）的損傷作用。方法CdTe QD（0.01～100 mg·L-1）與原代培養(yǎng)的大鼠胸/腹主動脈平滑肌細胞共孵育24 h，MTT法檢測CdTe QD對細胞存活的抑制；鈣黃綠素乙酰甲酯（calcein-AM）熒光染色觀察CdTe QD對VSMC細胞活性的影響；DCFH-DA和JC-1染色、流式細胞術檢測CdTe QD作用后細胞內活性氧（ROS）含量和線粒體膜電位的變化；流式細胞術檢測細胞凋亡；Western蛋白印跡法檢測BCL-2和BAX蛋白表達變化。結果 MTT結果顯示，CdTe QD 0.01～100 mg·L-1作用VSMC細胞24 h，細胞存活率降低（P＜0.01），24 h IC50值為25.60 mg·L-1。Calcein-AM熒光檢測發(fā)現(xiàn)，CdTe QD 0.1～25 mg·L-1作用后，VSMC細胞活性下降。DCFH-DA染色結果顯示，CdTe QD 0.1～25 mg·L-1使細胞內ROS逐漸增加（P＜0.05，P＜0.01）；JC-1染色結果表明，VSMC線粒體膜電位呈濃度依賴性降低（r=0.903，P＜0.01）。Western蛋白印跡結果表明，CdTe QD誘導抗凋亡蛋白BCL-2表達顯著降低（P＜0.01），促凋亡蛋白BAX表達顯著上升（P＜0.01）；流式細胞術FITC-AnnexinⅤ染色結果顯示，CdTe QD 0.1～25 mg·L-1作用24 h能顯著促進VSMC細胞凋亡（P＜0.05，P＜0.01）。結論CdTe QD可誘導VSMC細胞凋亡，其機制可能與胞內ROS含量上升和線粒體介導的凋亡通路激活相關。

碲化鎘量子點；血管平滑肌細胞；活性氧；線粒體膜電位；凋亡

半導體納米量子點（quantum dots，QD）是一類由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒。QD具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)，發(fā)射光譜窄且對稱的特點，它的發(fā)射光譜還可通過改變其尺寸大小來控制，可方便地實現(xiàn)單激發(fā)、多發(fā)射的多色熒光標記。同時，QD還具有光穩(wěn)定性好、抗淬滅能力強等一系列顯著優(yōu)于傳統(tǒng)有機熒光染料的特性，因此，QD顯示出巨大的生物醫(yī)學應用前景。1998年，QD首次被用于活細胞體系熒光標記［1］。迄今大量研究顯示QD在從分子到細胞乃至組織的體外或在體標記，以及藥物追蹤、基因技術等眾多領域都有著不俗的表現(xiàn)［2］。盡管如此，伴隨著QD生物標記技術的迅速發(fā)展，人們與QD的接觸日益增多，尤其是用于生物成像時，QD會直接進入血液循環(huán)系統(tǒng)，這引發(fā)了科研工作者關于QD對人體健康尤其是心血管系統(tǒng)健康影響的擔憂。

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是構成血管中膜組織結構的主要細胞成分，也是維持血管張力的物質基礎，對血管壁完整性和血管緊張性調節(jié)起重要作用。而VSMC的結構及功能改變是導致高血壓、動脈粥樣硬化（ath?erosclerosis，AS）和血管成形術后再狹窄等多種心血管病的細胞病理學基礎［3］。研究表明，多種促AS的病理刺激均能導致VSMC胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量上升，進而誘導VSMC凋亡［4］。我們前期利用水熱法合成了巰基丁二酸（mercaptosuccinic acid，MSA）修飾的碲化鎘QD（CdTe QD），并對該QD的理化性質進行了系統(tǒng)表征，結果顯示該CdTe QD具備良好的光學特性和穩(wěn)定性［5-6］，可滿足作為生物醫(yī)學熒光探針的基本要求。而前期的細胞毒性研究結果揭示，該CdTe QD會造成血管腔內表面的血管內皮細胞（vascular en?dothelial cells，VEC）的氧化損傷并誘導EC凋亡［5］，但上述CdTe QD是否對VSMC具有類似的損傷作用，目前尚未見報道。本研究擬采用體外培養(yǎng)大鼠胸/腹主動脈VSMC，研究CdTe QD對其的損傷作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

體質量180～250g的雄性Sprague-Dawley大鼠（浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心）。水熱法合成的CdTe QD（浙江大學秦海燕副教授饋贈）。低糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，線粒體膜電位熒光染料JC-1（美國Thermo Scientific公司），胰酶細胞消化液和活性氧檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Sigma公司），Annexin-Ⅴ/PI凋亡試劑盒，RIPA均細胞裂解液，蛋白濃度測定試劑盒（BCA法）（聯(lián)科生物科技有限公司），BCL-2和BAX多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

電子分析天平（德國梅特勒-托利多公司），恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司），高速臺式冷凍離心機（德國Hermle公司），酶標儀（美國Molecular Devices公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司），電泳儀、轉膜儀及凝膠成像分析系統(tǒng)均（美國Bio-Rad公司）。

1.2 CdTe QD細胞染毒液制備

用電子分析天平稱取10 mg CdTe QD，在超凈臺內將CdTe QD采用1 mL PBS復溶，得到10 g·L-1母液。上述母液采用0.22 μm濾膜過濾除菌消毒后4℃存儲備用。細胞染毒時采用將10 g·L-1的QD儲存液用PBS準確稀釋至1～1000 mg·L-1的工作液，使用時稀釋10倍作用于細胞。

1.3 VSMC培養(yǎng)及分組處理

取體質量約200 g SD大鼠處死后，無菌條件下分離出胸主動脈，采用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基和組織塊貼壁法進行VSMC原代培養(yǎng)［7］，48 h后換液，此后每隔2～3 d換液1次，至細胞90%融合時傳代，取3～5代VSMC進行實驗。

將VSMC隨機分成正常對照組和不同濃度CdTe QD損傷組：正常對照細胞每孔加入1/10體積的PBS，CdTe QD不同劑量組分別加入1/10體積相應濃度CdTe QD，使其終濃度分別為0.1～100 mg·L-1，孵育24 h后取細胞進行實驗。

1.4 MTT法檢測細胞存活率

將處于對數(shù)生長期的VSMC細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至基本融合后每孔加入180 μL低糖DMEM培養(yǎng)基和20μLCdTeQD染毒液，使各組CdTe QD終濃度分別為0.1～100 mg·L-1。37℃，5%CO2孵育24 h后，加入20 μL MTT 5 g·L-1，繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，并加入150 μL DMSO溶解藍紫色甲瓚結晶。酶標儀在490 nm處檢測吸光度值（A490nm），細胞存活率（%）=處理組A490nm/對照組A490nm×100%。每組6個復孔，實驗至少重復3次。

1.5 鈣黃綠素乙酰甲酯（calcein-AM）染色檢測細胞活性

Calcein-AM是一種低毒性、易透過細胞膜的活細胞熒光染料。只有在進入到細胞質后，才會被水解為calcein并發(fā)出強綠色熒光。研究表明，使用Calcein-AM進行細胞活性檢測的結果與金標準51Cr-釋放法的結果具有良好一致性［8］。因此，本研究通過calcein-AM染色實驗觀察CdTe QD對VSMC細胞活性的影響。將處于對數(shù)生長期的VSMC細胞接種于玻璃底培養(yǎng)皿，待細胞生長到90%融合后，隨機分為正常對照組和CdTe QD處理組。按1.3處理細胞24 h后，移除上清液，PBS洗2次后加入100 μL的calcein-AM染色液，避光孵育20 min，然后用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞活性。檢測過程中，激光功率及檢測器電壓放大倍數(shù)、增益等參數(shù)保持不變。

1.6 流式細胞術檢測線粒體膜電位、凋亡率和細胞內ROS含量變化

VSMC細胞接種于24孔板中，按1.3處理細胞24 h，胰酶消化并離心收集細胞（400×g，5 min），將收集到的細胞重懸于適量PBS中，制成單細胞懸液，分別加入JC-1染料（終濃度5 mg·L-1），F(xiàn)ITCAnnexinⅤ（5 μL）或DCFH-DA（終濃度10 μmol·L-1），避光孵育15～30 min后上流式細胞儀檢測［9］。每組設4個復孔，實驗至少重復3次。

1.7 Western蛋白印跡法檢測BCL-2和BAX蛋白表達

VSMC細胞接種于6孔板中，按1.3處理細胞24 h，PBS清洗細胞后，用胰酶消化并離心收集細胞（400×g，5 min）。棄上清，加入RIPA裂解液冰上獲取細胞總蛋白。采用BCA法測定各組總蛋白量。每組各取50 μg蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育過夜（兔抗大鼠BCL-2和BAX 1∶1000，大鼠抗人β肌動蛋白1∶1000），辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗孵育1 h（1∶2500）后按ECL顯色試劑盒說明書，加入顯色液于凝膠成像系統(tǒng)中拍照［10］。用Quantity One軟件分析蛋白條帶，以目標條帶與內參的積分吸光度比值表示各蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 CdTe QD對VSMC細胞存活率的影響

MTT檢測結果顯示（圖1），與正常對照組相比，CdTe QD 0.01～100 mg·L-1作用24 h后VSMC細胞存活率下降（P＜0.01），分別為正常對照組的（83.7±6.2）%，（82.2±1.7）%，（79.7±2.1）%，（75.3±3.6）%，（65.1±0.8）%，（39.0±2.5）%和（18.7±1.8）%，提示CdTe QD對VSMC具有明顯的細胞毒性。經計算，CdTe QD作用24 h，VSMC的IC50值為25.60 mg·L-1。

Fig.1 Effect of CdTe quantum dots（CdTe QD）on vascular smooth muscle cell（VSMC）survival by MTT. VSCM cells were treated with CdTe QD 0.01-100 mg·L-1for 24 h.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 CdTe QD對VSMC細胞活性的影響

正常對照組的VSMC細胞呈現(xiàn)強烈綠色熒光；0.1和CdTe QD 1 mg·L-1均使VSMC細胞內的calcein熒光強度有所下降。CdTe QD 10和25 mg·L-1對VSMC的細胞活性抑制效應更加明顯（圖2）。

2.3 CdTe QD對VSMC細胞內活性氧含量的影響

Fig.2 Effect of CdTe QD on cell viability of VSMC by calcein-AM staining.See Fig.1 for the cell treatment

DCFH-DA標記法檢測CdTe QD對VSMC胞內ROS含量的影響結果（圖3）所示，CdTe QD 0.1 mg·L-1作用24 h后VSMC細胞內的DCFH-DA的平均熒光強度為14.9±0.8，與正常對照組的平均熒光強度值13.8±2.6相比無顯著變化。而CdTe QD 1～25 mg·L-1與VSMC共孵育24 h后細胞內的DCFH-DA熒光強度上升（P＜0.05，P＜0.01），分別為17.4±0.6，34.8±2.8和63.5±2.1，表明CdTe QD能導致VSMC細胞內ROS含量上升、誘導細胞發(fā)生氧化應激。

2.4 CdTe QD對VSMC細胞線粒體膜電位的影響

在0.1 mg·L-1的CdTe QD處理組，R1區(qū)域所包含的線粒體膜電位較低的VSMC比例為（8.6± 0.8）%，與正常對照組的（7.9±1.0）%相比無顯著差異。而QD濃度上升引起了VSMC細胞線粒體膜電位明顯下降（P＜0.01），在CdTe QD 1，10和25 mg·L-1作用下，線粒體膜電位較低的VSMC細胞的比例分別上升至（12.2±0.6）%，（33.7±1.0）%和（42.5±1.4）%（圖4）。

2.5 CdTeQD對VSMC細胞BCL-2和BAX蛋白表達的影響

Fig.3 Effect of CdTe QD on intracellular reactive oxygen species（ROS）in VSMC by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Fig.4 Effect of CdTe QD on mitochondrial membrane potential（MMP）of VSMC by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

Western蛋白印跡法（圖5）結果顯示，與正常對照組相比，0.1～25 mg·L-1的CdTe QD處理組VSMC的抗凋亡蛋白BCL-2水平顯著下調（P＜0.01），促凋亡蛋白BAX水平顯著上升（P＜0.01）。BCL-2/β肌動蛋白比值分別從0.56±0.09下降至0.41±0.06，0.38±0.08，0.18±0.05和0.11±0.04；BAX/β肌動蛋白比值分別從0.34±0.13上升至0.42±0.18，0.64±0.19，0.86±0.13和0.95±0.11。結果表明，隨CdTe QD濃度的上升，BCL-2蛋白表達逐漸減弱，BAX蛋白的表達逐漸增加。

2.6 CdTeQD對VSMC細胞凋亡率的影響

正常對照組細胞僅有少量細胞呈現(xiàn)AnnexinⅤ陽性（即R4框內的細胞），這是由于正常細胞不斷衰老，機體通過凋亡清除衰老細胞；而各QD處理組AnnexinⅤ陽性細胞的數(shù)量明顯上升（P＜0.05，P＜0.01）：AnnexinⅤ陽性細胞的百分比分別從正常對照組的（1.28±0.24）%上升至（2.42±0.44）%，（2.90± 0.76）%，（18.75±1.77）%以及（33.90±1.02）%，提示CdTe QD能誘導VSMC細胞凋亡（圖6）

Fig.5 Effect of CdTe QD on protein expression of BCL-2（A）and BAX（B）in VSMC by Western blot?ting.See Fig.1 for the cell treatment.C was the semi-quantitative result of A and B.IA：integrated absorbance.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with respective normal control group.

Fig.6 Effect of CdTe QD on apoptosis in VSMC by flow cytometry.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，com?pared with normal control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，CdTe QD對VSMC細胞的存活率和細胞活性具有抑制作用，且存活率和細胞活性隨QD濃度增加而下降，表明CdTe QD對VSMC細胞具有明顯的細胞毒性作用。根據(jù)MTT的結果，計算得到CdTe QD對VSMC細胞的IC50值為25.60 mg·L-1，該濃度約為CdTe QD對人臍靜脈內皮細IC50值的2.42倍［5］，但遠低于CdTe QD對HONE1，PC12和PNAC等永生化細胞株的IC50值［11-13］。據(jù)此推測，血管內皮細胞和VSMC細胞可能對CdTe QD造成的損傷更為敏感。此外，根據(jù)上述IC50值，在后續(xù)實驗中，本研究采用較為接近IC50的25 mg·L-1作為研究CdTe QD對VSMC細胞毒性的最高濃度。

QD是一類光電特性優(yōu)異的納米晶體，具有良好的的生物醫(yī)學應用前景，尤其是基于QD的熒光標記技術可用于體外或在體生物標記和藥物示蹤等領域［14］。然而，實際使用過程中QD可能通過靜脈注射［14］或皮膚接觸［15］等途徑暴露于人體并因此對人體皮膚和血管系統(tǒng)帶來潛在傷害。有研究表明，QD能被人表皮角質細胞（human epidermal keratinocytes，HEK）攝取，并導致HEK細胞活性下降和炎癥反應［15］；QD還能造成內皮細胞胞內ROS過度上升，進而造成多種細胞器損傷，并最終誘導細胞凋亡［5-6］。但關于QD對VSMC細胞的毒性研究國內外鮮有報道。

本研究結果表明，CdTe QD影響了VSMC的線粒體凋亡調節(jié)蛋白BCL-2和BAX表達量的變化，并誘導VSMC凋亡。細胞凋亡作為一種主動的、受到多種基因嚴格調控的程序性死亡，在細胞維持內環(huán)境穩(wěn)定及個體發(fā)育方面起著極為重要的作用。然而許多因素能誘導細胞過度凋亡，進而誘導各種疾病的發(fā)生。例如，氧化低密度脂蛋白能誘導VSMC細胞凋亡，而上述VSMC細胞凋亡參與AS及再狹窄的發(fā)生發(fā)展［16］。因此，QD能導致VSMC細胞凋亡意味著其存在觸發(fā)AS的風險，對于QD的臨床應用是不利的。這要求QD的制備者必須使用于臨床的QD具有更佳的光學性能來降低其使用濃度，或使其具有更好的生物相容性來降低對細胞的損傷。研究表明，外源性毒性物質導致的細胞內ROS過量蓄積可能對細胞器及細胞功能造成嚴重的氧化損傷［17］。目前公認，線粒體通過氧化磷酸化作用合成ATP，從而為細胞生命活動提供能量，是胞內最重要的細胞器之一。而病理刺激或毒性物質導致的細胞內ROS上升和氧化應激將引發(fā)線粒體代謝狀態(tài)的改變和線粒體膜電位崩解；后者常被視為細胞凋亡的早期事件之一［18］。本研究顯示，CdTe QD作用24 h能造成VSMC線粒體膜電位呈劑量依賴性下降，這與以往在巨噬細胞、血管內皮細胞等所觀察到的QD毒性研究結果大體一致［5，19］。此外，由于線粒體還是內源性凋亡通路信號的匯聚和傳輸中心，病理或毒性因素除了影響線粒體的能量供給，還會進一步造成線粒體膜通透性的改變，釋放BCL-2和BAX等凋亡相關蛋白、激活下游家族蛋白并最終誘導細胞凋亡［20］。

本研究結果提示，進入血液的QD具有顯著的VSMC細胞毒性，是一種潛在的、致心血管疾病發(fā)生的危險因素。研究結果為了解QD的血管毒性提供了一定的實驗依據(jù)，也可有利于QD的安全使用和設計。

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CdTe quantum dots induced impairment in primary vascular smooth muscle cells

YAN Ming1,ZHANG Yun2,LIU Ke-zhou1,SUN Yong-hong3
(1.Department of Biomedical Engineering,College of Life Information Science and Instrument Engineering,Hangzhou Dianzi University,Hangzhou 310018,China;2.College of Medicine, Shaoxing Academy,Shaoxing 312000,China;3.Zhejiang Provincial Key Laboratory of Cardio-Cerebral Vascular Detection Technology and Medical Effectiveness Appraisal, Department of Biomedical Engineering,College of Biomedical Engineering and Instrument Science,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China)

OBJECTIVE To study the effect of CdTe quantum dots(QD)induced injuries in vascular smooth muscle cells(VSMCs)and the potential mechanism.METHODS The rat thoracic/abdominal aorta VSMCs were treated with 0.01-100 mg·L-1CdTe QD for 24 h.The cell survival of CdTe QD-treated VSMCs was detected with MTT assay.The cell viability of VSMCs was measured by calcein-AM staining.Then,the CdTe QD-treated VSMCs were labeled with DCFH-DA and JC-1 probes. The intracellular ROS and mitochondrial membrane potential(MMP)were examined by flow cytometry.The cellular apoptosis in VSMCs was also examined in a flow cytometer after being labeled with FITC-AnnexinⅤ.Finally,the level of mitochondrial apoptosis pathways proteins including BCL-2 and BAX was observed by Western blotting.RESULTS MTT data showed that CdTe QD(0.01-100 mg·L-1) inhibited the cell survival(r=0.957,P＜0.01),and that IC50was 25.6 mg·L-1at 24 h.The results of calcein-AM staining showed that the cell viability was gradually decreased.DCFH-DA staining results showed that 1-25 mg·L-1CdTe QD induced an increase in intracellular ROS levels(P＜0.05,P＜0.01).The results of JC-1 data showed a concentration-dependent disruption of MMP(r=0.903,P＜0.01).Moreover,the results of Western blotting suggested that CdTe QD significantly increased the expression of BCL-2 and decrease the expression of BAX in VSMCs(P＜0.01).The flow cytometry results from FITC-AnnexinⅤassay showed 0.1-25 mg·L-1CdTe QD significantly increased the apoptosis of VSMCS.CONCULSION CdTe QD induces apoptotic cell death in VSMCs,which is possibly related to the up-regulation of intra?cellular ROS and activation of mitochondria-mediated apoptosis pathways.

CdTe quantum dot;vascular smooth muscle cells;reactive oxygen species;mitochon?drial membrane potential;apoptosis.

YAN Ming,E-mail:yanming@hdu.edu.cn,Tel:(0571)86878667

R995

A

1000-3002-（2017）02-0165-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.02.07

Foundation item:The project supported by Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LY15H180012); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LY17H060043);Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China(LY14C100004);and National Natural Science Foundation of China(31401008)

2016-07-12 接受日期：2017-01-18）

（本文編輯：賀云霞）

浙江省自然科學基金（LY15H180012）；浙江省自然科學基金（LY17H060043）；浙江省自然科學基金（LY14C100004）；國家自然科學基金（31401008）

嚴 明，女，博士，講師，主要從事生物制造和微納米材料生物相容性研究。

嚴 明，Email：yanming@hdu.eud.cn，Tel：（0571）86878667