陸騰飛, 鄔楊楠, 裴文華, 馬月輝, 關(guān)偉軍

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193

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內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性及其應(yīng)用

陸騰飛, 鄔楊楠, 裴文華, 馬月輝*, 關(guān)偉軍*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193

內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，隨著對(duì)其培養(yǎng)、鑒定、歸巢和分化等研究的進(jìn)行，內(nèi)皮祖細(xì)胞被越來越多的引入到醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)血管疾病的研究之中，內(nèi)皮祖細(xì)胞可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和血管功能恢復(fù)，是構(gòu)建心血管組織工程的新力量。就內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性及其在動(dòng)物肢體缺血模型和臨床實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)行了概述，并分析了內(nèi)皮祖細(xì)胞應(yīng)用所面臨的挑戰(zhàn)，最后對(duì)未來的研究方向進(jìn)行了展望。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；體外擴(kuò)增；生物學(xué)特性；血管發(fā)生；臨床應(yīng)用

1997年，日本學(xué)者Asahara等[1]首次從人外周血中分離出血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vasucular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)和CD34均為陽性的單核細(xì)胞，而且能夠表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性抗原，故命名為內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，也稱為成血管細(xì)胞(angioblast)，在生理或病理等因素的刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血參與損傷血管的修復(fù)，通過遷移、歸巢到靶組織并進(jìn)入新生血管，定向增殖分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持血管內(nèi)膜的穩(wěn)定性起著重要作用[2,3]；此外，研究發(fā)現(xiàn)EPCs既參與血管生成，也參與機(jī)體和器官損傷后的血管修復(fù)與新生，在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，并為缺血性疾病的治療提供了新思路，具有廣闊的應(yīng)用前景[4～6]。然而，EPCs治療仍面臨諸多困難，從高齡病人分離的EPCs數(shù)量低、質(zhì)量差，達(dá)不到理想的治療效果[7]。本文就內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特征及臨床應(yīng)用等研究概況作簡(jiǎn)要概述,以期為內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用研究提供參考。

1 EPCs的生物學(xué)特性

1.1 EPCs的鑒定

內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外有兩種，分早期和晚期。早期EPCs呈現(xiàn)紡錘形，晚期EPCs形成鋪路石樣的橢圓形結(jié)構(gòu)。單從形態(tài)學(xué)特征上無法辨認(rèn)出早期EPCs，由于血液與血管的發(fā)生聯(lián)系緊密，其細(xì)胞也共享許多細(xì)胞表面標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn)，HSCs和EPCs都起源于血管干細(xì)胞，因此他們具有相同的表面標(biāo)記(CD34、CD133)[8]。人類EPCs的表面標(biāo)記物有CD34、CD133、FLK-1/KDR、CXCR4和CD105等，而在小鼠中其表面標(biāo)志物則為C-kit+/Sca-1+/Lin-(KSL)[1, 9～11]，這些細(xì)胞群在缺血條件下參與血管形成，表明它們具有血管再生能力?，F(xiàn)在最常用的鑒定EPCs的表面分子抗原組合有VEGFR-2、CD133和CD34，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為同時(shí)具有 CD34+、CD133+及VEGFR-2等表面抗原的稱為EPCs[12]，但單獨(dú)一個(gè)表面分子抗原是不具有特異性的。例如，CD34+在骨髓來源的內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)上都有所表達(dá)[13]。VEGFR-2是胚胎血管發(fā)育時(shí)的關(guān)鍵受體，是血液血管干細(xì)胞的表面標(biāo)記，在出生后也表達(dá)于早期造血干細(xì)胞和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞上[14]。CD133選擇性地表達(dá)于早期造血細(xì)胞和胚胎肝、骨髓以及外周血的祖細(xì)胞，在成熟內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)[15]。由此可見，EPCs在不同發(fā)育階段可能表達(dá)不同的表面標(biāo)記。最近有研究顯示，起源于臍血單核細(xì)胞的CD34+/CD14-或CD34-/CD14+的細(xì)胞也可分化為EPCs[16]，此外，還能通過多種方法鑒定EPCs，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)也是它的特征之一[17]。通過電鏡可觀察到內(nèi)皮細(xì)胞特有的細(xì)胞器Weibel-palade小體[18]，它是一種分泌性桿狀的細(xì)胞器，含有多種生物活性分子，如血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)，受到刺激后可以非常迅速的釋放這些內(nèi)容物，參與止血、炎癥和血管生成等生理功能。內(nèi)皮細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白是其重要的生物學(xué)功能之一，EPCs在分化過程中能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞免疫表型，且具有吞噬乙?；兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆凝集素的能力[19]，可以利用這種能力對(duì)EPCs進(jìn)行檢測(cè)，通過Dil標(biāo)記乙?；兔芏戎鞍缀虵ITC標(biāo)記的荊豆凝集素雙染實(shí)驗(yàn)來鑒定EPCs表型。

非造血系EPCs的來源不是HSCs，它可能來自組織或器官，非造血系EPCs通過連續(xù)培養(yǎng)獲得，它們具有分化為內(nèi)皮細(xì)胞的能力，這種細(xì)胞又被稱為EOCs[20]，它們?cè)隗w外培養(yǎng)條件下呈內(nèi)皮細(xì)胞樣特征，培養(yǎng)7 d后，匯合形成鵝卵石樣單層多角形細(xì)胞。這種EPCs亞型表達(dá)CD31、CD34、CD105、CD146、VE-cadherin和VEGFR-2，而不表達(dá)造血系表面標(biāo)志物CD133[21]。這類EPCs能形成毛細(xì)血管和產(chǎn)生NO，從而增強(qiáng)后肢血管的新生能力[22]。盡管這類具有血管生成潛能的EPCs能應(yīng)用于細(xì)胞治療，但在培養(yǎng)的過程中，它們的增殖活性減弱和逐步衰老的現(xiàn)象使之用于治療受到限制[23]，若同時(shí)考慮到分離技術(shù)和培養(yǎng)方法，這些非造血系EPCs是不適用于臨床的。

1.2 EPCs的歸巢和分化

EPCs的歸巢是在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell derived factor，SDF-1)的參與下，使外周血中的EPCs遷移到組織缺血或內(nèi)皮損傷部位，黏附并結(jié)合到受損血管的過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)將含有VEGF的填充物移植到缺血部位，可引起移植部位EPCs的聚集，促進(jìn)血管新生，表明VEGF有促進(jìn)EPCs歸巢的作用[24]。另外，還有研究人員發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白(caveolin)通過VEGF /NO通路來調(diào)控SDF-1介導(dǎo)的EPCs歸巢，從而直接影響血管的新生[25]。SDF-1是動(dòng)員EPCs向缺血部位聚集的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，能誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞遷移和EPCs的形成。

EPCs向缺血損傷部位歸巢，形成集群后修復(fù)損傷組織[26]。因此EPCs的克隆形成能力及其檢測(cè)方法對(duì)于研究血管的生成是很重要的。有研究人員從外周血或臍血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，并培養(yǎng)出了內(nèi)皮細(xì)胞克隆團(tuán)(colony-forming unit-endothelial cells, CFU-ECs)[27]。新的EPCs克隆形成(EPCs colony forming assay, EPCs-CFA)方法可以估計(jì)祖細(xì)胞的數(shù)量，也能評(píng)估克隆團(tuán)的質(zhì)量[28]。利用EPCs-CFA方法可以把兩種細(xì)胞群體區(qū)分開來，即原始的(小)EPCs群體和成熟的(大)EPCs群體。這兩類細(xì)胞群體各有特點(diǎn)，原始的(小)EPCs具有高度的增殖能力，而成熟的(大)EPCs具有分化和促進(jìn)血管修復(fù)的能力[29]。

有學(xué)者認(rèn)為CD133/CD14表達(dá)的喪失，同時(shí)伴隨vWF及其他成熟內(nèi)皮特異性標(biāo)志物和特征的形成就表明內(nèi)皮細(xì)胞分化成熟[30]。目前的研究認(rèn)為EPCs除了分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞以外，還可以分化為骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和心肌樣細(xì)胞[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，PPAR7受體激動(dòng)劑通過上調(diào)eNOS的表達(dá)使EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，而抑制其向平滑肌細(xì)胞分化[32]。而用C-反應(yīng)蛋白處理EPCs，可通過抑制eNOS mRNA的表達(dá)，顯著抑制EPCs 的分化，并加速其凋亡[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，層流切應(yīng)力促進(jìn)EPCs向動(dòng)脈ECs分化，而抑制其向靜脈ECs分化。剪切力在促進(jìn)EPCs向ECs分化的同時(shí)，抑制了干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD34的表達(dá)[34]。也有研究表明纖維連接蛋白促進(jìn)EPCs分化[35]。

2 EPCs的應(yīng)用

2.1 EPCs在動(dòng)物肢體缺血模型中的應(yīng)用

目前，EPCs治療肢體缺血疾病被廣泛研究。當(dāng)肢體缺血患者因?yàn)闆]有藥物治療，不適合手術(shù)而只能選擇截肢時(shí)，EPCs治療給他們帶來了希望。利用EPCs治療動(dòng)物損傷模型的治療方法有所差異，有的學(xué)者利用新分離的細(xì)胞，也有學(xué)者利用多種細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子組合培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞。研究人員利用鼠類和兔進(jìn)行了大量的研究，外源性EPCs能夠修復(fù)后肢缺血模型中受損的血管[36,37]。這些實(shí)驗(yàn)表明，EPCs在缺血損傷時(shí)參與毛細(xì)血管生成和改善組織灌注。

由于造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞具有共同的表面標(biāo)記，利用當(dāng)前的技術(shù)無法將它們區(qū)分。最近，有研究表明通過CD34陽性分選可以得到一部分EPCs，對(duì)肢體缺血的糖尿病小鼠局部注射CD34+細(xì)胞，結(jié)果表明CD34+細(xì)胞具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和促進(jìn)血管生長(zhǎng)的功能[38]。Li等[39]發(fā)現(xiàn)分離自骨髓的CD34+在移植后具有更高的募集能力。Elsharawy等[40]將人CD34+細(xì)胞移植到后肢缺血的糖尿病裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)明顯恢復(fù)了血流。

2.2 EPCs在臨床試驗(yàn)上的應(yīng)用

治療性血管生成的主要目的是強(qiáng)化合適的血管形成和改善組織灌注。一些理想的動(dòng)物研究結(jié)果促進(jìn)了早期臨床試驗(yàn)的開展。促進(jìn)肢體缺血患者的側(cè)支血管生成和血管新生是減少組織損傷與嚴(yán)重缺血的主要治療策略。

根據(jù)細(xì)胞來源，治療方式可分為非選擇性EPCs治療和選擇性EPCs治療，非選擇性EPCs治療利用骨髓來源的單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells, MNCs)，它包括EPCs部分和非EPCs部分；選擇性EPCs治療利用的是外周血(peripheral blood,PB)或BM-MNCs中分離和純化的EPCs[40,41]。純化的CD34+細(xì)胞能參與血管新生和內(nèi)皮修復(fù)，BM-MNCs在收到促進(jìn)動(dòng)員、歸巢和分化的信號(hào)后，能形成成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。生理?xiàng)l件下循環(huán)血中的EPCs數(shù)量很少，粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)可以促進(jìn)EPCs從骨髓中動(dòng)員到外周血中，因此，促進(jìn)BM-MNCs動(dòng)員和歸巢會(huì)增強(qiáng)EPCs介導(dǎo)的血管新生[42,43]。

有學(xué)者利用BM-MNCs治療外周動(dòng)脈疾病(peripheral arterial disease, PAD)，他們使用的就是細(xì)胞移植治療血管生成方法。隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)表明，肌肉注射自體BM-MNCs能顯著改善腿部疼痛范圍、潰瘍大小和疼痛自由行走距離，這種良性結(jié)果能夠維持至少2年[44]。Kawamoto等[45]報(bào)道了一個(gè)自體移植的I/II期臨床試驗(yàn)，通過G-CSF動(dòng)員下肢嚴(yán)重缺血患者的BM-EPCs，G-CSF能有效地動(dòng)員BM-EPCs進(jìn)入血液，分離所得到的CD34+細(xì)胞即為EPCs。所有患者在細(xì)胞治療12周后，病情得到明顯改善，CD34+細(xì)胞移植后各項(xiàng)病理指標(biāo)得到明顯改善。

研究顯示，將自體動(dòng)員的CD34+細(xì)胞移植到頑固性糖尿病足患者體內(nèi)，I/II期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，5例患者中3例未發(fā)生小截肢、復(fù)發(fā)、死亡及其他嚴(yán)重不良事件。另外，當(dāng)以高劑量EPC-CFU和CD34+/KDR+細(xì)胞進(jìn)行治療時(shí)，傷口愈合效果明顯改善，無復(fù)發(fā)或異位潰瘍[44]。這些結(jié)果表明，EPCs的數(shù)量和血管生成潛力直接影響細(xì)胞療法的療效。因此，較高劑量的EPC-CFU和CD34+/KDR+細(xì)胞是EPCs進(jìn)行有效治療的關(guān)鍵。細(xì)胞治療對(duì)于下肢嚴(yán)重缺血患者基本沒有限制，具有一定的安全性和可行性。

3 EPCs的應(yīng)用挑戰(zhàn)

要成功地將EPCs介導(dǎo)的血管修復(fù)和血管生成應(yīng)用于臨床，還需要更好地理解EPCs的生物學(xué)特性。目前，EPCs治療應(yīng)用主要受到數(shù)量和質(zhì)量的限制。由于外周血中的EPCs較少，細(xì)胞分離過程中細(xì)胞質(zhì)量會(huì)降低，不得不進(jìn)行多次動(dòng)員和分離EPCs從而加重了病人的負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)PB CD34+細(xì)胞移植治療功能性血管再生具有劑量依賴效應(yīng)[46]。

在一些特殊情況下，如高齡、糖尿病、心血管疾病和其他風(fēng)險(xiǎn)因素等都能損害EPCs的功能，使其遷移和歸巢到靶組織的能力受到影響[47,48]。年齡的升高會(huì)減弱內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞因子，并造成生長(zhǎng)因子的量減少，且活性減弱，導(dǎo)致患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[49]。老齡化也與血管壁內(nèi)源性的改變有關(guān)，主要是內(nèi)皮細(xì)胞的流失導(dǎo)致了內(nèi)皮功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性冠心病(coronary artery disease,CAD)患者術(shù)前的循環(huán)EPCs隨著年齡的增加而減少，隨著VEGF水平下降而減少。而同齡人中，含較少EPCs的人更易患心血管疾病。多因素分析表明，EPCs的減少預(yù)測(cè)了心血管疾病不良的預(yù)后[50]，通過減少風(fēng)險(xiǎn)因素能夠恢復(fù)循環(huán)中EPCs的正常水平[51]。

由于糖尿病和EPCs功能損傷有關(guān)，糖尿病通常伴隨著很多血管并發(fā)癥，缺乏血管內(nèi)皮再生和血管再生受損是糖尿病血管并發(fā)癥的根本原因。糖尿病患者的內(nèi)環(huán)境含有大量的活性氧簇，它們由活性NADPH氧化酶產(chǎn)生，NADPH氧化酶能降低NO的生物學(xué)利用度，從而導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和加重，抑制NADPH氧化酶的活性能恢復(fù)CD34+細(xì)胞的遷移和歸巢到靶組織的能力[52]。

由于病人內(nèi)源性EPCs的數(shù)量少、質(zhì)量差，與健康人相比自體EPCs移植治療效果不好。在治療糖尿病足患者時(shí)，PB CD34+細(xì)胞修復(fù)組比對(duì)照組的治療效果差，老年患者EPCs動(dòng)員數(shù)量降低，缺血性損傷可由正常人的CD34+細(xì)胞修復(fù)，但糖尿病患者的CD34+細(xì)胞治療效果很差[50]。為了克服這一問題，可使用細(xì)胞和分子生物學(xué)技術(shù)增強(qiáng)EPCs的存活率和細(xì)胞增殖。此外，收集和分離細(xì)胞的漫長(zhǎng)過程也會(huì)影響患者的康復(fù)。如前體祖細(xì)胞的增殖或前處理等步驟會(huì)造成移植時(shí)間的推遲。總之，盡管臨床試驗(yàn)表明自體EPCs治療具有安全性和有效性，但仍然需要克服一些缺陷，如：分離技術(shù)和過程、細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞數(shù)量。

4 展望

內(nèi)皮祖細(xì)胞以其獨(dú)特的生物學(xué)特性成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中重要的治療工具，在機(jī)體缺血、組織損傷、細(xì)胞因子或藥物刺激下，EPCs可從骨髓向靶部位動(dòng)員、增殖、分化，形成新生血管，在多種缺血性疾病和血管損傷方面有著廣闊的應(yīng)用前景。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將必要的基因轉(zhuǎn)給EPCs，從而增強(qiáng)其增殖或新生血管的能力，擴(kuò)大在臨床上的應(yīng)用范圍。此外，EPCs在組織工程和腫瘤治療方面也有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，我們必須要先理解EPCs的生物學(xué)特性，并繼續(xù)研究了解EPCs在健康和疾病中的身份和角色。這些努力將提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)來指導(dǎo)研究者對(duì)細(xì)胞治療進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。

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Biological Characteristics and Applications of Endothelial Progenitor Cells

LU Tengfei, WU Yangnan, PEI Wenhua, MA Yuehui*, GUAN Weijun*

InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China

Endothelial progenitor cells (EPCs) are the precursor cells of the vascular endothelial cells. EPCs is now being more and more introduced into the basic research in medicine, cell biology and other fields about vascular disease with the study of its culture, identification, homing and differentiation. Studies have shown that endothelial progenitor cells can promote wound healing and the recovery of vascular function, becoming a new method to construct cardiovascular tissue engineering. This paper reviewed the biological characteristics of EPCs and its application in animal ischemia models and clinical trial. The paper also analyzed the challenge of EPCs application. Finally, we prospected the research direction of EPCs in the future.

endothelial progenitor cell; exvivo expansion; biological properties; vasculogenesis; clinical application

2017-02-22; 接受日期：2017-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31672404)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(cxgc-ias-01)資助。

陸騰飛，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail:tengkongfeilu@163.com。*通信作者：關(guān)偉軍，教授，博士，研究方向?yàn)榧?xì)胞與分子生物學(xué)。E-mail:wjguan86@iascaas.net.cn；馬月輝，研究員，博士，研究方向?yàn)榧?xì)胞與分子生物學(xué)。E-mail:yuehui.Ma@263.net

10.19586/j.2095-2341.2017.0009