何靜云

國家食品藥品監(jiān)督管理總局 醫(yī)療器械技術審評中心，北京 100044

關于埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審評的探討

何靜云

國家食品藥品監(jiān)督管理總局 醫(yī)療器械技術審評中心，北京 100044

2014年埃博拉病毒出血熱疫情引起了全世界的關注，為做好疫情監(jiān)控，嚴防疫情輸入，藥監(jiān)總局啟動埃博拉病毒檢測試劑應急審批程序，推動應急用體外診斷試劑產(chǎn)品盡快完成審批。本文就埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審評要求及審批條件進行解析和介紹，并結合此次應急審批工作提出了對應急審評的思考。

體外診斷試劑；埃博拉病毒；應急審批

2014年初，埃博拉出血熱疫情在非洲暴發(fā)，并呈現(xiàn)迅速蔓延的趨勢。這是自埃博拉病毒發(fā)現(xiàn)以來最嚴重的一次疫情。世界衛(wèi)生組織于2014年8月8日宣布這次疫情為“國際突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[1]，并呼吁國際社會提供緊急支援，來自中國、美國、加拿大、澳大利亞等國家的醫(yī)護救援人員、移動實驗室等先后抵達疫區(qū)。在史無前例的國際社會援助和疫區(qū)國家的努力下，疫情在2015年初得到控制。

1 埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審批程序啟動的必要性

埃博拉病毒自1976年首次被發(fā)現(xiàn)以來，已暴發(fā)過20余次，2014年的暴發(fā)甚于以往任何一次，并已突破了美國防線，美國本土出現(xiàn)了9例埃博拉病患，其中1人死亡。我國與非洲國家在勞務、商務、留學教育等領域都有較為密切的來往，疫情的輸入風險較大。美國東北大學生物和社會-技術體系建模實驗室（MOB LAB）做了預測，對可能出現(xiàn)輸入性埃博拉病例的前30個國家進行排名,中國排名第16位[2]。

2014年，為做好國內的應對準備，嚴防疫情輸入，同時對非洲國家提供有效的醫(yī)療救援和支持，中國政府啟動了由衛(wèi)計委、科技部、檢驗檢疫總局、藥監(jiān)總局等多部門參與的聯(lián)防聯(lián)控機制；同時，國家食品藥品監(jiān)督管理總局亦啟動了埃博拉診斷試劑的應急審批程序，為已有相關工作基礎和技術儲備、可為埃博拉病毒核酸檢測試劑的研制和生產(chǎn)做出快速響應的體外診斷試劑企業(yè)開辟應急審批通道；同時由總局醫(yī)療器械技術審評中心建立相關技術審評方案，并以此為依據(jù)，指導埃博拉病毒核酸檢測試劑的開發(fā)和注冊申報，完成技術審評，推動埃博拉病毒檢測試劑的研制和生產(chǎn)，促進埃博拉出血熱疫情應急儲備用核酸檢測試劑的早日上市，為疫情防控提供有效的應急儲備。

作為國家藥監(jiān)總局醫(yī)療器械技術審評中心審評員，筆者參與了此次埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審批工作，包括應急審評方案的建立和相關產(chǎn)品的技術審評。下面就相關應急審評方案的內容和應急儲備產(chǎn)品審批條件進行解析和介紹，并結合此次應急審批工作進行討論。

2 埃博拉病毒核酸檢測試劑

埃博拉病毒是埃博拉出血熱的病原體,屬于絲狀病毒科埃博拉病毒屬，為有包膜、不分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒。2014年西非疫情是由致病性最強的埃博拉病毒扎伊爾型引起的。由于尚沒有針對性的埃博拉疫苗和治療方案，埃博拉病毒被歸入生物安全第4級病毒。埃博拉病毒致病性強，感染后病死率高，鑒于尚無預防疫苗和有效的治療手段，及時的實驗室診斷是控制傳染源、避免疫情擴散的重要手段[3]。同時，埃博拉出血熱的早期臨床表現(xiàn)和其他一些病毒性出血熱相似，因此實驗室檢測更是鑒別診斷的重要手段。實驗室病原學檢測的主要方法有病毒分離、病毒核酸檢測和抗原檢測等[4-5]。

目前，熒光探針PCR法檢測病毒核酸是病毒感染急性期實驗室診斷最重要的方法之一。該技術在PCR反應體系中加入特異性引物和探針，探針能與引物擴增區(qū)域中間的一段DNA模板特異性結合，探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，如樣本中存在待測靶序列，則PCR擴增時可監(jiān)測到熒光信號，熒光信號的累積與PCR模板量呈正相關。

埃博拉病毒基因組編碼7個結構蛋白和2個非結構蛋白，基因順序為3'-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5'。NP為核衣殼蛋白，是重要的結構蛋白；GP是跨膜糖蛋白，與病毒的入侵和細胞毒性有關；L為RNA依賴的RNA聚合酶，是病毒基因組復制必需的酶[6]。在埃博拉病毒核酸檢測試劑中，大多以NP和/或GP基因為檢測靶標，部分產(chǎn)品將L基因設為內參基因。

3 埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審評方案

3.1 應急審評方案重點解決的問題

體外診斷試劑的研制、評價、生產(chǎn)及產(chǎn)品注冊等，首先應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》[7]及其配套文件和指導原則的要求。但埃博拉病毒核酸檢測試劑開發(fā)和注冊申請尚無法完全滿足上述基本要求，主要難點在于缺少有效的參比系統(tǒng)。一般地，新的病毒核酸檢測試劑應以病毒分離培養(yǎng)為參比系統(tǒng)，評價檢測試劑的分析靈敏度和特異性，并在臨床試驗中以臨床診斷金標準為參比系統(tǒng)，采用相關病毒感染者樣本及陰性樣本評價試劑臨床性能。例如，以往的甲型H1N1（2009）流感病毒、手足口病以及人感染H7N9禽流感病毒檢測試劑，作為新的病毒檢測試劑，在應急審評中，均要求采用病毒培養(yǎng)物進行實驗室性能評價，并采用充分數(shù)量的陽性病例，對試劑的陽性檢出能力進行充分評價[8]。而本次應急儲備急需的埃博拉病毒核酸檢測試劑卻不具備如上條件。一方面，埃博拉病毒為生物安全等級4級病原體，目前在我國尚不具備體外培養(yǎng)的條件，無法獲得培養(yǎng)病毒或滅活病毒；另一方面，此次疫情主要發(fā)生在非洲，境內尚無感染的陽性病例，無法采用病毒感染陽性樣本進行陽性檢出能力評價。

可見對于埃博拉病毒核酸檢測試劑的臨床前研究和臨床試驗均不能按照一般的新的病毒核酸檢測試劑同樣要求。關于埃博拉病毒核酸檢測試劑應急儲備產(chǎn)品的審評方案需要重點解決的問題在于，在缺乏病毒培養(yǎng)物和臨床陽性樣本的情況下，設定分析性能評價和臨床性能評價要求，在現(xiàn)有條件下盡可能充分評估或預判被考核產(chǎn)品對于埃博拉感染者樣本中真實目標物的陽性檢出能力。涉及體外診斷試劑的其他審評要求，如原材料研究、生產(chǎn)工藝及反應體系研究、穩(wěn)定性研究等方面則可借鑒已有的相關法規(guī)、文件和指導原則。

3.2 應急審評方案解析

埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審評方案的建立，旨在為相關應急儲備體外診斷試劑的申報提供指導，為技術審評提供依據(jù)，促進埃博拉病毒實驗室檢驗方法的建立，為2014西非埃博拉出血熱疫情的防控提供診斷試劑儲備。雖然疫情防控的形勢十分緊迫，且此類產(chǎn)品的評價面臨如上所述的諸多困難，但鑒于其臨床意義重大，仍不能隨意降低技術審評標準，或減少審批程序。為保證應急審評方案的科學、合理和可操作性，我們多次征求相關企業(yè)的意見，并就技術指標的設定向病毒學、流行病學、臨床檢驗學等方面的專家進行咨詢，在充分考慮埃博拉病毒的特點，并結合體外診斷試劑注冊管理法規(guī)要求的前提下，最終形成《在緊急情況下埃博拉病毒核酸檢測試劑評價和臨床試驗要求》。下面就該方案中的具體要求進行詳細分析和討論。

根據(jù)已有體外診斷試劑相關法規(guī)、規(guī)章、規(guī)范性文件及指導原則要求，對于新的病毒核酸檢測試劑，性能評估及臨床試驗基本要求包括：核酸提取/純化性能、最低檢測限、陽性檢出能力、分析特異性、精密度、企業(yè)參考品、臨床靈敏度、臨床特異性等。

3.2.1 核酸（RNA）提取/純化性能 此項分析性能要求與其他病原體核酸檢測試劑的要求一致，即在進行靶核酸檢測前，應設置適當?shù)暮怂幔≧NA）提取/純化步驟。企業(yè)可選擇在病毒核酸檢測試劑中配置核酸提取/純化組分，亦可選擇已上市核酸提取/純化試劑作為指定配套使用產(chǎn)品。無論哪種情況，企業(yè)都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取組分/試劑的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證。應當注意的是，這里的“驗證”應結合本檢測試劑的特性進行評價，重點評價該提取/純化方法是否滿足本試劑的要求。

3.2.2 最低檢測限 鑒于無法獲得埃博拉病毒培養(yǎng)物或滅活培養(yǎng)物，有關檢測限和陽性檢出能力的評價只能采用模擬樣本。為盡量模擬實際的病毒核酸提取和檢測情況，我們建議生產(chǎn)企業(yè)采用包裝目的基因的假病毒顆粒進行檢測限等性能評價。若檢測的靶物質包含多種埃博拉病毒型別，則在最低檢測限的評價中，要求針對試劑適用的埃博拉病毒所有型別分別進行。此外，要求在樣品基質方面應盡量與適用樣本類型一致，且假病毒應做準確的濃度滴定。試驗方法可將含有埃博拉病毒目的RNA片段的假病毒顆粒梯度稀釋于（與適用樣本一致的）適當基質中，每個濃度梯度最少重復3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。

3.2.3 埃博拉病毒RNA陽性檢出能力驗證 在最低檢測限的研究中已對產(chǎn)品的埃博拉病毒核酸檢測能力進行了初步評價，但評價的樣本僅限于假病毒。由于假病毒可包裝的序列長度有限，根據(jù)生產(chǎn)企業(yè)的反饋，一般僅能包裝PCR擴增序列，此樣本的檢測不能很好地代表試劑對病毒核酸的檢測能力，亦不能考察不同病毒株可能對試劑檢測能力產(chǎn)生的干擾。因此，在埃博拉病毒RNA陽性檢出能力的評價中，要求采用埃博拉病毒檢測目的基因的體外轉錄全長RNA進行檢出能力驗證，如NP、GP基因體外轉錄全長RNA；針對預期用途包含的每種埃博拉病毒型別，均應選擇NCBI上已登錄毒株中至少2個不同病毒株的基因序列分別完成此項驗證。在專家咨詢會中，專家對此項要求的提出亦比較認同，認為可以在缺乏真實病原體的情況下對診斷試劑的陽性檢出能力進行進一步的把握和控制。

3.2.4 分析特異性 病毒核酸檢測試劑的分析特異性主要包括其他病原體的交叉反應情況和內源及外源物質的干擾試驗。

埃博拉病毒屬于高致病性病原體，生物安全等級為4級，受試者樣本檢測出現(xiàn)假陰性或假陽性都將造成嚴重的后果。因此，在交叉反應方面須做充分的驗證和評價。首先，交叉反應驗證的病原體種類一般從兩方面考慮：其一，須考慮可能存在基因序列同源性的病原體，如近緣微生物（其他型別埃博拉病毒、馬爾堡病毒）等，以考察試劑是否有非特異擴增；其二，須考慮可引起相似癥狀或可在適用樣本中共存的其他微生物，特別是本次疫情主要分布于非洲，須特別關注非洲常見病原體，以評價產(chǎn)品的鑒別診斷能力。其次，須考慮核酸提取中不可避免的人基因組DNA的干擾情況。

3.2.5 精密度 測量精密度的試驗方法可以參考相關的CLSI-EP文件或國內有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。企業(yè)應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。精密度評價中應考慮檢測試劑本身以及其他要素可能造成的精密度波動，包括PCR分析儀、操作者、地點等要素；應設定合理的精密度評價周期，從而對批內/批間、日內/日間精密度進行綜合評價；用于精密度評價的質控品應至少包括3個水平（陰性、臨界陽性和中、強陽性），可采用包含目的RNA的假病毒，基質應與適用樣本類型一致。

3.2.6 臨床研究 按照《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求，針對新的病毒核酸檢測試劑應在相應的臨床環(huán)境中完成總例數(shù)不少于1000例的臨床試驗，入組樣本應符合產(chǎn)品預期用途要求，并包括陽性樣本和陰性樣本，對試劑的臨床性能進行系統(tǒng)性研究。但鑒于目前國內尚未有埃博拉病毒感染的陽性病例，允許采用符合要求的模擬陽性樣本完成相關評價，因此該臨床試驗只能稱為“模擬臨床試驗”，而非真正意義上的“臨床試驗”。但對于臨床特異性驗證所需的陰性樣本，應當為有病原體感染癥狀的患者樣本及留觀人員樣本，建議考慮有發(fā)熱、腹瀉、出血熱等癥狀的患者，同時還應包括其他病毒感染或細菌血癥患者的樣本，特別應包含出血熱病毒感染患者樣本。這樣，模擬臨床試驗中臨床特異性的評價能夠達到一般體外診斷試劑的要求。

此外，我們要求生產(chǎn)企業(yè)收集非洲疫區(qū)受試者樣本與對照方法（建議使用WHO認可的同類檢測試劑，如無法獲得，可采用其他國際權威組織認可的同類檢測試劑）進行對比試驗。鑒于此項工作開展的難度較大，建議埃博拉病毒核酸陽性樣本不少于200例，總樣本不少于300例。此項工作在科技部的協(xié)調下最終由援非醫(yī)療隊協(xié)助完成。

通過非洲臨床樣本，特別是埃博拉病毒感染者樣本的臨床試驗，被評價產(chǎn)品的陽性檢出能力得到了較好的驗證，為產(chǎn)品臨床有效性的評價提供了保障。

3.3 埃博拉檢測試劑應急產(chǎn)品的條件審批

在埃博拉病毒核酸檢測試劑評價方案的指導下，我們于2014年底到2015年初先后完成了5項埃博拉病毒核酸檢測試劑的技術審評。但鑒于這些產(chǎn)品尚不能滿足《體外診斷試劑注冊管理辦法》等相關法規(guī)的要求，因此不能按照常規(guī)體外診斷試劑予以批準，僅批準其用作2014埃博拉病毒性出血熱疫情的應急儲備，并對這些產(chǎn)品的應用提出如下限制：僅作為應對2014年暴發(fā)于西非的埃博拉病毒出血熱疫情的體外診斷應急儲備，不能作為常規(guī)體外診斷試劑應用于臨床；在使用上應當遵守衛(wèi)計委發(fā)布的“埃博拉出血熱防控方案”及相關實驗室檢測的要求；試劑適用人群應符合“埃博拉出血熱防控方案”的要求，包括2014年埃博拉出血熱疫區(qū)有疑似癥狀人群或有埃博拉病毒接觸或暴露風險的人群等。同時，應急儲備批準的有效期限按照疫情的持續(xù)情況，設定為6個月，并明確說明如需再次啟動本產(chǎn)品的應急儲備，企業(yè)應重新申請；用于常規(guī)臨床診斷則應按照《辦法》另行注冊；并要求待中檢院應急參考品正式發(fā)布后，上述申請人應提交3批檢驗報告。

應急審批完成后6個月左右，我們就埃博拉應急儲備產(chǎn)品的生產(chǎn)和臨床應用情況進行了調研，部分產(chǎn)品分別有數(shù)千至上萬人份銷售量，主要應用于非洲疫區(qū)國家、國內各級疾病預防控制中心和出入境檢驗檢疫局等。為疫區(qū)埃博拉病毒出血熱疫情的控制提供了支持，亦為我國境內疫情防控提供了保障。其中一項產(chǎn)品還受到WHO認可，并被批準列入WHO官方采購目錄。

在本次國家藥監(jiān)總局埃博拉檢測試劑應急審批任務的執(zhí)行過程中，面對現(xiàn)有產(chǎn)品缺乏有效的陽性參照系統(tǒng)，尚不能完全符合相關產(chǎn)品注冊申報要求，但出于疫情防控需要，急需診斷試劑儲備的現(xiàn)實，我們在充分調研和討論的基礎上建立了技術審評方案，一方面充分論證產(chǎn)品的檢測特異性，最大程度避免假陽性反應；另一方面借助國家疫情聯(lián)防聯(lián)控機制的支持，將被考核試劑應用于非洲疫情陽性樣本的檢測，以評價其真實的陽性檢出能力，在現(xiàn)有條件下盡可能保證產(chǎn)品的檢測靈敏度。

值得一提的是，美國FDA于2014年8月發(fā)布了一項獲得緊急情況應用授權（Emergency Use Authorization，EUA）的扎伊爾型埃博拉病毒核酸檢測試劑[9]，由于美國具備BSL-4實驗室條件和體外培養(yǎng)的埃博拉病毒株，因此對試劑的評價采用了滅活的埃博拉病毒株進行，但未能采用埃博拉病毒感染的臨床陽性樣本進行臨床性能評估。與我國同類產(chǎn)品審批情況相同的是，兩者雖然都在一定程度上驗證了試劑的陽性檢出能力，但均不夠充分，因此均未按照常規(guī)體外診斷試劑（IVD）產(chǎn)品予以批準。隨后，美國FDA相繼又批準了超過4項Ebola核酸檢測試劑的緊急情況應用授權[9]。

4 有關應急儲備產(chǎn)品審評審批的思考

此次埃博拉病毒核酸檢測試劑應急審評的情況與以往歷次突發(fā)公共衛(wèi)生事件急需的體外診斷試劑的審評情況有很大不同。在甲型H1N1（2009）流感病毒、手足口病以及人感染H7N9禽流感病毒檢測試劑的應急審評中，我國境內均有疫情發(fā)生，可以獲得足夠數(shù)量的陽性病例，對試劑的陽性檢出能力進行充分評價。而埃博拉病毒核酸檢測試劑的評價既缺少陽性樣本又不能獲得真實的病毒，大部分評價僅限于模擬樣品，而這樣的評價是無法滿足《體外診斷試劑注冊管理辦法》的基本要求的。在這樣的情形下，我們探索了新的審評審批方式，即，僅以疫情防控用應急儲備產(chǎn)品予以批準，而非常規(guī)體外診斷試劑，并在注冊證有效期及產(chǎn)品適用范圍上予以嚴格限定。這樣，既保證了疫情防控的應急儲備需要，又實現(xiàn)了審評審批的客觀和科學，亦為以后的新發(fā)、高致病性病原體相關檢測試劑的審評審批工作提供了借鑒和經(jīng)驗。

如上文所述，美國FDA批準的扎伊爾型埃博拉病毒核酸檢測試劑，是采用了“緊急情況應用授權”的方式，而不是常規(guī)體外診斷試劑批準的510（k）或PMA形式。主要原因也在于因缺少確診的陽性病例，無法按正常程序對產(chǎn)品的檢測性能和臨床性能進行完整充分的評價，僅可采用EUA的審批要求對申報產(chǎn)品進行審評；同時在批準緊急情況應用授權的同時，對產(chǎn)品的使用進行嚴格限制，如該產(chǎn)品只能在緊急情況下使用，并且只能在美國國防部認可并指定的實驗室中使用，檢測人群為來自疫區(qū)并且有相應感染癥狀或暴露于流行病學危險因素下的人群，獲得此項授權的申請人必須將此授權通知指定的實驗室和相關的公共健康機構等。同時FDA有相關規(guī)定，F(xiàn)DA將在疫情結束后終止授權產(chǎn)品的使用，并建議申請人在條件允許及產(chǎn)品研制符合要求后再根據(jù)正常程序進行產(chǎn)品申報[10]。

綜上，本次埃博拉病毒核酸檢測應急儲備產(chǎn)品的審批方式與上述FDA的EUA批準模式較為類似，包括產(chǎn)品應用范圍的限制、批準/授權期限的限制等。但在美國，EUA是FDA的一條專門的審批途徑，具有配套的流程和審批標準；而此次我國相關產(chǎn)品的審批仍采用了常規(guī)IVD產(chǎn)品的審批途徑，有關“疫情應急儲備用產(chǎn)品”的條件審批限制，僅以注冊證備注形式提出，其執(zhí)行有賴于審批部門和相關注冊人的充分溝通，在某種程度上缺少制度上的規(guī)范和保障。2015年MERS疫情暴發(fā)后，相關應急審評工作也面臨同樣的問題?？梢娫谌缃竦牧餍胁⌒蝿菹拢@樣的情況再次發(fā)生的可能性很大，筆者認為國家藥監(jiān)總局有必要考慮應急審批途徑的建立，以實現(xiàn)相關產(chǎn)品批準的規(guī)范化和制度化。

[1]WHO Statement on the Meeting of the International Health Regulations Emergency Committee Regarding the 2014 Ebola Outbreak in WestAfrica[EB/OL].http://www.who.int/medicacentre.[2014-08-08]

[2]最可能出現(xiàn)輸入性埃博拉病例的30個國家，中國第 16位[EB/OL].http://www.biodiscover.com/news/poli-tics/113724.html.[2014-10-17]

[3]張應濤,劉康康,陸家海.2014年西非埃博拉出血熱流行狀況與防控研究[J].暨南大學學報（自然科學與醫(yī)學版）,2014,35(5):421-426.

[4]高偉,趙平,任浩,等.埃博拉病毒感染的實驗室檢測方法[J].微生物與感染,2014,9(4):202-209.

[5]郭雅玲,王超君.埃博拉出血熱的防控策略及其研究進展[J].國外醫(yī)學醫(yī)學地理分冊,2015,36(1): 5-8.

[6]程穎,劉軍,李昱,等.埃博拉病毒?。翰≡瓕W、致病機制、治療與疫苗研究進展[J].科學通報,2014, 59(30):2889-2899.

[7]體外診斷試劑注冊管理辦法[Z].國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號.2014-07-30.

[8]國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術審評中心.人感染H7N9禽流感病毒檢測試劑審評要點[Z].2014-07-09.

[9]Emergency use authorization[EB/OL].http://www.fda.gov.[2017-01-18]

[10]Emergency use authorization of medical products and related authorities[EB/OL].http://www.fda.gov.[2017-01-18]

Discussion on the Emergency Use Evaluation for Ebola De?tection Kits

HE Jing-Yun*
Center of Medical Device Evaluation,CFDA,Beijing 100044,China
*Corresponding author,hejy@cmde.org.cn

The outbreak of Ebola hemorrhagic fever in 2014 had got a global attention.In order to monitor and prevent input of Ebola epidemic effectively,CFDA started the Review and Approval Procedure for Medical Device Registration under Emergency Situation for Ebola RNA detection kits to prompt the registration of the needed invitro diagnostics kit（IVD）products.The requirements and restrictive condition for the emergency use Ebola RNA detection kits are reviewed,and based on this project of conditional approval,the thinking about emergency evelua?tion is introduced.

in-vitro diagnostics kit;Ebola virus;emergency evaluation

R373;R197

A

1009-0002（2017）01-0023-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.005

2017-12-22

何靜云（1978-），女，助理研究員

何靜云，（E-mail）hejy@cmde.org.cn