范鵬飛，遲象陽，宋小紅，房婷，吳詩坡，陳旖，王瀟霖，張冠英，于長明，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所疫苗與抗體工程研究室，北京 100071

研究報告

埃博拉病毒截短型糖蛋白GPdmucin的表達(dá)與純化

范鵬飛，遲象陽，宋小紅，房婷，吳詩坡，陳旖，王瀟霖，張冠英，于長明，陳薇

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所疫苗與抗體工程研究室，北京 100071

目的：確定黏蛋白區(qū)缺失的埃博拉病毒包膜糖蛋白（GPdmucin）的最佳表達(dá)系統(tǒng)，并獲得純化的GPdmucin。方法：從埃博拉病毒的包膜糖蛋白（GP）全長基因上擴增GPdmucin序列，構(gòu)建至pET32a、pFastBac1和pcDNA3.4三種不同表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒中，分別在原核、昆蟲和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，并用特異抗體鑒定表達(dá)情況。結(jié)果：原核系統(tǒng)表達(dá)的GPdmucin不穩(wěn)定，活性差；在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中，GPdmucin在細(xì)胞內(nèi)以不溶形式表達(dá)；利用Expi293瞬時蛋白表達(dá)系統(tǒng)，GPdmucin在哺乳動物細(xì)胞中可溶性表達(dá)，Ni柱親和層析獲得的目的蛋白純度達(dá)90%以上，且與特異抗體具有很好的結(jié)合活性。結(jié)論：獲得哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GPdmucin蛋白，將用于GPcl的制備、GP抗體篩選、疫苗效果評價及病毒致病機理的研究。

埃博拉病毒；截短型糖蛋白；哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)；生物學(xué)活性

2014年西非暴發(fā)埃博拉疫情，引起了世界范圍的廣泛關(guān)注和重視。埃博拉病毒屬包括扎伊爾型（EBOV）、本迪布焦型（BDBV）、蘇丹型（SUDV）、塔伊森林型（TAFV）和萊斯頓型（RESTV）等5種病毒[1-2]，其中扎伊爾型埃博拉病毒對人類和非人靈長類有著極強的致死率，也是造成2014年埃博拉疫情的病原體。埃博拉病毒可引起快速而致命的出血熱，嚴(yán)重威脅著人類健康，但截至目前尚無獲批的針對埃博拉病毒的治療和預(yù)防措施[3-5]。埃博拉病毒的糖蛋白（glycoprotein，GP）被認(rèn)為與病毒入侵和細(xì)胞毒性相關(guān)，因而成為疫苗和抗體研究的重要靶標(biāo)[6-7]。在病毒膜表面糖蛋白以三聚體形式存在，每個糖蛋白單體由GP1和GP2這2個亞基通過二硫鍵連接構(gòu)成。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能特點，GP1亞基可被劃分成受體結(jié)合區(qū)（receptor bind?ing domain，RBD）、聚糖帽（glycan cap，GC）和黏蛋白區(qū)（mucinlike domain，MLD）[6,8]。病毒入侵過程中，病毒顆粒通過胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞[9-10]。在次級內(nèi)體中病毒膜表面的糖蛋白被組織蛋白酶水解，切掉GC和MLD，暴露出被部分遮蔽的RBD。水解產(chǎn)生的待發(fā)狀態(tài)GP（primed GP，GP?cl）通過與晚期內(nèi)體表面的受體NPC1的C結(jié)構(gòu)域（NPC1-C）結(jié)合，促進(jìn)晚期內(nèi)體與病毒膜融合，進(jìn)而釋放病毒RNA[11-15]。相關(guān)研究表明，刪掉黏蛋白區(qū)后的GP，即GPdmucin（33～310 aa，463～632 aa），在體外可被嗜熱菌蛋白酶水解切掉其上的GC，產(chǎn)生與自然感染過程中功能相似的GPcl結(jié)構(gòu)[15,17-18]。表達(dá)構(gòu)象完整、生物學(xué)活性良好的GPdmucin，對于GPcl的制備、埃博拉病毒抗體的檢測和篩選等具有重要意義。目前，文獻(xiàn)報道大多采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備GPd?mucin[16,18]，也有報道采用HEK293T細(xì)胞表達(dá)該蛋白[19]。我們分別在原核、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中對扎伊爾型埃博拉病毒的GPdmucin進(jìn)行了表達(dá)，并用GP特異抗體MIL77-1/2/3[20]對純化得到的蛋白進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

Expi293細(xì)胞、Sf9細(xì)胞、pcDNA3.4質(zhì)粒、pDC316-GGPopt質(zhì)粒由本實驗室保存；大腸桿菌Top10、BL21感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅡ、XhoⅠ、NdeⅠ購自NEB公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司；T4DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶購自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒小提系統(tǒng)購自Promega公司；Expi293培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染試劑盒購自Gibco公司；蛋白電泳marker和BCA蛋白定量試劑盒購自 Thermo公司；Histrap FF純化柱購自GE Healthcare公司；Western印跡化學(xué)發(fā)光試劑、離心濃縮管等購自Millipore公司；山羊抗人IgG Fc二抗購自Abcam公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；MIL771/2/3抗體由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所沈倍奮院士贈送（MIL77-1/2/3為埃博拉病毒中和單抗混合物ZMapp[21-22]所包含的3株抗體的優(yōu)化株，其結(jié)合的表位已知，MIL77-1和MIL77-2結(jié)合于GP2亞基，MIL77-3結(jié)合于聚糖帽）。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)圖1所示GPdmucin的結(jié)構(gòu)設(shè)計構(gòu)建質(zhì)粒所需引物（表1）。

圖1 GPdmucin結(jié)構(gòu)示意圖

表1 重組質(zhì)粒構(gòu)建的引物及序列

1.2.1 構(gòu)建 pET32a-GPdmucin表達(dá)質(zhì)粒 以pDC316-GGPopt為模板，用引物1、2擴增GPdmu?cin1片段，用引物3、4擴增GPdmucin2片段（PCR擴增條件：預(yù)變性95℃ 5min；變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 50 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min）；以GPdmucin1和GPdmucin2回收產(chǎn)物為模板，用引物1、7擴增NdeⅠ-GPd?mucin-XhoⅠ片段（PCR擴增條件：預(yù)變性95℃5min；變性95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸72℃ 90 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min）；NdeⅠ/XhoⅠ分別雙酶切GPdmucin片段和pET32a質(zhì)粒，回收目的片段后，將GPdmucin連接至pET32a載體；將pET32a-GPdmucin轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落交上海生工生物工程公司測序，提取質(zhì)粒。

1.2.2 構(gòu)建pFastBac1-gp67-GPdmucin-His表達(dá)質(zhì)粒 合成gp67-GPdmucin（T42V/T230V）-His6基因，以其為模板，用引物6、8擴增EcoRⅠ-gp67-GPdmucin-His6-HindⅢ片段；EcoRⅠ/HindⅢ分別雙酶切pFsatBac1質(zhì)粒和GPdmucin片段，回收目的片段后，將GPdmucin連接至pFsatBac1質(zhì)粒；將pFsatBac1-GPdmucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，涂X-gal平板，37℃孵育48 h；挑取白色克隆用M13引物和特異性引物PCR鑒定后交上海生工生物工程公司測序，提取質(zhì)粒。

1.2.3 構(gòu)建pcDNA3.4-GPdmucin表達(dá)質(zhì)粒 以pDC316-GGPopt為模板，用引物5、9擴增信號肽tPA（PCR擴增條件：預(yù)變性95℃ 5min；變性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 10 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min）；以pET32a-GPd?mucin為模板，用引物10、4擴增GPdmucin片段；以前面2個PCR產(chǎn)物的回收片段為模板，用引物5、6擴增EcoRⅠ-tPA-GPdmucin-His6-HindⅢ片段；EcoRⅠ/HindⅢ分別雙酶切pcDNA3.4質(zhì)粒和插入片段，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落交上海生工生物工程公司測序，提取質(zhì)粒。

1.3 GPdmucin在原核細(xì)胞中的表達(dá)

將 pET32a-GPdmucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)接至5mL含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；第2 d將菌液按1∶100轉(zhuǎn)接至200mL新的含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)約2.5 h至D600nm為0.6～0.8；加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；菌液于4℃、8000 r/min離心15min，收集菌體，用裂解緩沖液重懸，勻漿后超聲波破碎細(xì)胞；4℃、10000 r/min離心15min，棄上清；包涵體用含2%DOC的裂解緩沖液洗滌，用含8 mol/L尿素的裂解緩沖液重懸；依次在含4、2、1、0.5、0 mol/L尿素的1×TGE緩沖液中透析，透析條件為4℃，每次透析6 h以上；透析液離心去除沉淀，上清經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后，用離心超濾管濃縮。

1.4 GPdmucin在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

處于對數(shù)期的Sf9細(xì)胞計數(shù)后鋪6孔板，每孔8×105細(xì)胞；各取100 μL的空白培養(yǎng)基，一份（A）加入8 μL的Cell fectinⅡ，一份（B）加入0.5 ng的pFsatBac1-GPdmucin；A液室溫靜置30min后與B液混合，混合后的AB液室溫放置20min；將上述混合液緩慢滴加至細(xì)胞中，28℃孵育約5 h后更換2mL完全培養(yǎng)基；28℃繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察，直到細(xì)胞出現(xiàn)病變；500 r/min離心5min，收獲細(xì)胞上清，上清中包含P1代桿狀病毒；以MOI=0.1感染Sf9細(xì)胞擴增獲得高滴度的P2代病毒；P2代病毒經(jīng)Q-PCR測定滴度后，避光短期保存于4℃，長期保存于-80℃；分別以MOI=0.1、0.5、1、5、10用P2代桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，28℃培養(yǎng)96 h，收取細(xì)胞和上清，鑒定蛋白表達(dá)情況。

1.5 GPdmucin在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染前1 d測定Expi293細(xì)胞的數(shù)量和活率，接種2×106細(xì)胞至30mL試劑盒推薦的培養(yǎng)基中；以120 r/min轉(zhuǎn)速懸浮培養(yǎng)，溫度為37℃，CO2含量為5%；轉(zhuǎn)染當(dāng)天，檢測細(xì)胞生長密度達(dá)到3×106/mL時，吸取80 μL ExpiFectamine 293試劑加入1.5mL培養(yǎng)基中，輕輕混勻后室溫孵育5min；取構(gòu)建好的pcDNA3.4-GPdmucin質(zhì)粒30 μg加入1.5mL培養(yǎng)基中，輕輕混勻；將含有轉(zhuǎn)染試劑或轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的2種溶液混合，混勻后室溫孵育25min以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后將其加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；轉(zhuǎn)染后12～16 h，在培養(yǎng)瓶中分別加入150 μL轉(zhuǎn)染增強劑1和1.5mL轉(zhuǎn)染增強劑2，繼續(xù)培養(yǎng)144 h收樣；收集的樣品于4℃、8000 r/min離心10min，留上清。

1.6 Western印跡鑒定GPdmucin的表達(dá)

收集細(xì)胞表達(dá)樣品，在含巰基乙醇的SDS上樣緩沖液中煮沸5min；將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，電轉(zhuǎn)條件為300 mA、1 h；用5%的脫脂奶粉于4℃封閉1 h，然后將MIL77-3抗體稀釋至1 μg/mL，室溫孵育1 h；1×TBST洗膜5次，6min/次；加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；1×TBST洗膜5次，6min/次；在膜上滴加化學(xué)發(fā)光試劑，室溫孵育5min；將膜在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光。

1.7 Ni柱親和層析純化GPdmucin

采用Ni柱親和層析純化攜帶His標(biāo)簽的GPdmucin。Expi293培養(yǎng)液于4℃、8000 r/min離心15min，收集上清；用上樣緩沖液（20mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，20mmol/L PB）平衡Histrap純化柱；表達(dá)上清經(jīng)0.22 μm濾器抽濾后，過純化柱；上樣緩沖液平衡純化柱后，用洗脫緩沖液（500mmol/L咪唑，500mmol/L NaCl，20mmol/L PB）梯度洗脫蛋白，收集出現(xiàn)的蛋白峰。

1.8 ELISA鑒定純化的GPdmucin的活性

純化的GPdmucin以1 μg/mL包被，4℃孵育過夜；用2%BSA的封閉液室溫孵育1 h；PBST洗滌2次后，用0.2%BSA稀釋液將MIL77-1/2/3抗體從10 μg/mL的首孔濃度做1/2梯度稀釋，室溫孵育1 h；PBST洗滌6次后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；PBST洗滌6次，加入TMB單組分顯色液室溫顯色5min；加入終止液，讀取D450nm/630nm值。

2 結(jié)果

2.1 GPdmucin基因片段的擴增與鑒定

根據(jù)圖1設(shè)計的GPdmucin，首先擴增2個拼接片段 GPdmucin1（834bp）和 GPdmucin2（510 bp），電泳分析結(jié)果與理論長度相符（圖2）。將二者通過重疊延伸PCR融合成1344 bp的GPd?mucin片段，條帶大小正確。將目的片段切膠回收后，用于構(gòu)建各表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 PCR擴增GPdmucin片段

2.2 大腸桿菌BL21細(xì)胞表達(dá)不溶性及MIL77-1/3結(jié)合活性差的GPdmucin

GPdmucin在大腸桿菌BL21原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)量較高，1 L菌體可收獲超過200 mg的包涵體。收集的菌體經(jīng)超聲波破碎、2%DOC洗滌，雜蛋白被很好地去除（圖3）。在蛋白復(fù)性過程中，蛋白樣品透析至1×TGE溶液中時出現(xiàn)少許絮狀沉淀，經(jīng)高速離心可去除。

為了分析得到的目的蛋白的構(gòu)象是否正確及生物學(xué)活性是否完整保留，我們用結(jié)合于聚糖帽區(qū)域的 MIL77-3和結(jié)合于 GP2區(qū)域的MIL77-1分別作為一抗進(jìn)行了ELISA分析，發(fā)現(xiàn)MIL77-1不能與原核系統(tǒng)表達(dá)的GPdmucin結(jié)合，而MIL77-3能與其弱結(jié)合（圖4）。說明大腸桿菌BL21表達(dá)的GPdmucin經(jīng)復(fù)性后與天然構(gòu)象的GP在生物學(xué)活性上存在一定的差異，不能作為后期相關(guān)實驗的材料。

圖3 SDS-PAGE分析蛋白復(fù)性過程

圖4 ELISA鑒定大腸桿菌BL21表達(dá)的GPdmucin與MIL77-1/3的結(jié)合

2.3 Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)不溶性GPdmucin

我們用SOC培養(yǎng)基將pFastBac1-GPdmucin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選出序列正確的陽性克隆。用提取的質(zhì)粒感染Sf9細(xì)胞，收集P1代病毒后擴增得到的P2代病毒，經(jīng)Q-PCR測定滴度約為4.70×108pfu/mL。為了確定最佳感染復(fù)數(shù)，我們選取了0.1、0.5、1、5、10共5個MOI的病毒去感染Sf9細(xì)胞。收集感染后細(xì)胞的表達(dá)上清和胞體，用MIL77-3陽性抗體進(jìn)行Western印跡分析。所有表達(dá)上清中均未檢測到特異條帶，而細(xì)胞樣品中可以檢測到目的蛋白，且細(xì)胞沉淀中蛋白的量隨 MOI的增加而明顯增多（圖5A）。確定蛋白表達(dá)在胞內(nèi)后，為了進(jìn)一步分析GPdmucin蛋白的表達(dá)是否可溶，我們對收集的細(xì)胞超聲波破碎后用上清和沉淀做了相同的Western印跡分析，最后確定GPdmucin以不可溶的形式表達(dá)于細(xì)胞中（圖5B），這種情況下蛋白構(gòu)象可能不正確而且難以進(jìn)行純化。

圖5 Western印跡鑒定Sf9細(xì)胞表達(dá)的GPdmucin

2.4 Expi293細(xì)胞表達(dá)可溶性及MIL77-1/2/3結(jié)合活性良好的GPdmucin

我們采用未突變的GPdmucin基因序列構(gòu)建了pcDNA3.4-tPA-GPdmucin-His質(zhì)粒，然后在Ex?pi293系統(tǒng)中對目的蛋白進(jìn)行了表達(dá)，經(jīng)Ni柱純化獲得了GPdmucin。純化過程各環(huán)節(jié)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果如圖6所示。

GP的基因序列中含有弗林蛋白酶（Furin）酶切位點（圖1箭頭所示），在細(xì)胞內(nèi)合成的GP多肽鏈會被弗林蛋白酶酶切，形成通過二硫鍵連接的GP1（1～501 aa）和GP2（502～676 aa）2個亞基[6]。因此，構(gòu)建的GPdmuin也是由與之對應(yīng)的2部分組成，即GP1dmucin（33～310 aa，463～501 aa）和GP2（502～632 aa）。在還原劑存在的條件下，二硫鍵會被打開，因而呈現(xiàn)出相對分子質(zhì)量為50 000～60 000和15 000～20 000的2條帶（圖6，泳道9）。條帶彌散的原因是GPdmucin含有多個糖基化位點，糖基化修飾使得蛋白相對分子質(zhì)量不均一。

對純化收集的蛋白用相對分子質(zhì)量30 000的離心超濾管濃縮，目的蛋白得到很好的富集，且濾過液中無目的蛋白損失。在非還原SDSPAGE中，GPdmucin為相對分子質(zhì)量為70 000～75 000的單一條帶（圖6，泳道11），經(jīng)ImageJ軟件分析，蛋白純度在90%以上。

對得到的蛋白用特異抗體MIL77-1/2/3通過Western印跡（圖7A）和ELISA（圖7B）分析其構(gòu)象是否正確以及生物學(xué)活性是否良好。MIL77-1/2/3與 GPdmucin結(jié)合的 EC50值分別為0.020、0.072和0.017 μg/mL，與文獻(xiàn)報道相符。幾株特異抗體均能很好地與GPdmucin結(jié)合，提示其空間構(gòu)象正確。Expi293系統(tǒng)表達(dá)的GPdmucin生物學(xué)活性得到很好保留，可滿足后期研究需求。

圖6 SDS-PAGE分析GPdmucin純化過程

圖7 Western印跡（A）和ELISA（B）分析鑒定Expi293表達(dá)的GPdmucin

3 討論

絲狀病毒科病毒的GP序列之間有著較高的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性[18,23-24]，因此對其中一種GP的研究具有廣譜的意義，可為其他種病毒的研究提供相關(guān)信息。

我們用原核、昆蟲和哺乳動物3種表達(dá)系統(tǒng)對GPdmucin進(jìn)行了表達(dá)，發(fā)現(xiàn)3種系統(tǒng)的表達(dá)效果有著較大的差異。原核表達(dá)的優(yōu)點是表達(dá)量較高，1 L菌液中的目的蛋白量可達(dá)幾百毫克。但原核表達(dá)有著諸多缺點，如無糖基化修飾、以包涵體形式存在、蛋白復(fù)性過程復(fù)雜、目的蛋白構(gòu)象不完全正確等。在實驗過程中我們還發(fā)現(xiàn)復(fù)性得到的蛋白不是很穩(wěn)定，凍融易出現(xiàn)沉淀。目前文獻(xiàn)報道的表達(dá)GPdmucin基本采用昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，經(jīng)過我們多次嘗試發(fā)現(xiàn)蛋白在該系統(tǒng)中確有表達(dá)，并且MOI越大蛋白表達(dá)量越高，但重組蛋白以不溶形式表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)。GPdmucin在昆蟲系統(tǒng)中未能成功表達(dá)的原因，可能是使用的細(xì)胞狀態(tài)欠佳或表達(dá)條件還須進(jìn)一步優(yōu)化。將GPdmucin的基因融合tPA信號肽和His標(biāo)簽后構(gòu)建至pcDNA3.4質(zhì)粒中，瞬轉(zhuǎn)Expi293細(xì)胞構(gòu)建GPdmucin的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系，結(jié)果在上清中檢測到目的蛋白的表達(dá)，親和層析純化獲得GPdmucin，并且經(jīng)特異抗體鑒定其構(gòu)象正確、活性較好。

我們采用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)制備了截短型GP——GPdmucin，30mL培養(yǎng)體系可以得到約3.5 mg純化蛋白，最終得到的GPdmucin在埃博拉病毒臨床受試者血清抗體檢測中顯示出較好的活性。相較昆蟲表達(dá)系統(tǒng)而言，該系統(tǒng)方便快捷，表達(dá)量高；并且Expi293來源于人胚腎上皮細(xì)胞，采用該細(xì)胞表達(dá)的蛋白可能更接近于天然感染過程中病毒基因產(chǎn)生的蛋白。本研究對于絲狀病毒科其他病毒膜表面GP的表達(dá)、GPdmucin和GPcl的制備具有借鑒意義，可為埃博拉病毒抗體的檢測、疫苗的效力評價以及治療性抗體中和機制的研究提供幫助。

[1]Fusco M L,Hashiguchi T,Cassan R,et al.Protec?tive mAbs and cross-reactive mAbs raised by immu?nization with engineered Marburg virus GPs[J].PLoS Pathog,2015,11(6):e1005016.

[2]Holtsberg F W,Shulenin S,Vu H,et al.Pan-ebo?lavirus and Pan-filovirus mouse monoclonal antibod?ies:protection against Ebola and Sudan viruses[J].J Virol,2015,90:266-278.

[3]Burke J,Declerq R,Ghysebrechts G.Ebola haemor?rhagic fever in Zaire,1976[J].Bull World Health Or?gan,1978,56:271-293.

[4]Muyembe-Tamfum JJ,MulanguS,MasumuJ,et al.Ebola virus outbreaks in Africa:past and present [J].Onderstepoort J Vet Res,2102,79:1-8.

[5]WHO Ebola Response Team.Ebola virus disease in West Africa-the first 9 months of the epidemic and forward projections[J].N Engl J Med,2014,371:1481-1495.

[6]Lee J E,Fusco M L,Hessell A J,et al.Structure ofthe Ebola virusglycoprotein bound to an anti?body from a human survivor[J].Nature,2008,454: 177-182.

[7]Lee J E,Saphire E O.Ebolavirus glycoprotein struc?ture and mechanism of entry[J].Future Virol,2009,4: 621-635.

[8]SanchezA,YangZ Y,Xu L,etal.Biochemical analysisofthe secreted and virion glycoproteinsof Ebola virus[J].J Virol,1998,72:6442-6447.

[9]Saeed M F,Kolokoltsov A A,AlbrechtT,etal.Cellularentry ofebolavirusinvolvesuptakebya macropinocytosis-like mechanism and subsequent traf?ficking through early and late endosomes[J].PLoS Pathog,2010,6:e1001110.

[10]Nanbo A,Imai M,Watanabe S,et al.Ebolavirus is internalized into host cells via macropinocytosis in a viral glycoprotein-dependent manner[J].PLoS Pathog, 2010,6:e1001121.

[11]Carette J E,Raaben M,Wong A C,et al.Ebola vi?rus entry requires the cholesterol transporter Nie?mann-Pick C1[J].Nature,2012,477(7364):340-343.

[12]Jeffers S A,Sanders D A,Sanchez A.Covalent modifications of the Ebola virus glycoprotein[J].J Vi?rol,2002,76:12463-12472.

[13]Cote M,Misasi J,Ren T,et al.Cunningham,small molecule inhibitors reveal Niemann-pick C1 is essen?tialforEbola virus infection[J].Nature,2011,477: 344-348.

[14]Miller E H,Obernosterer G,Raaben M,et al.Ebo?la virus entry requires the host-programmed recogni?tion of an intracellular receptor[J].EMBO J,2012,31: 1947-1960.

[15]NgM,NdungoE,JangraR K,etal.Cellentry by a novel European filovirus requires host endosom?al cysteine proteases and Niemann-pick C1[J].Virolo?gy,2014,0:637-646.

[16]Wang H,Shi Y,Song J,et al.Ebola viral glycopro?tein bound to its endosomal receptor Niemann-pick C1[J].Cell,2016,164:258-268.

[17]Schornberg K,Matsuyama S,Kabsch K,et al.Role ofendosomalcathepsins in entry mediated by the Ebola virus glycoprotein[J].J Virol,2006,4174-4178.

[18]HashiguchiT,FuscoM L,BornholdtZ A,etal.StructuralbasisforMarburg virusneutralization by a cross-reactive human antibody[J].Cell,2015,160: 904-912.

[19]Keck Z Y,Enterlein S G,Howell K A,et al.Ma?caque monoclonal antibodies targeting novel con?served epitopes within Filovirus glycoprotein[J].J Vi? rol,2015,90:279-291.

[20]Qiu X,Audet J,LvM,et al.Two-mAb cocktail protects macaques against the Makona variant of Eb?ola virus[J].SciTransl Med,2016,8:329ra33.

[21]Qiu X,Wong G,Audet J,et al.Reversion of ad?vanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp[J].Nature,2014,514(7520):47-53.

[22]Davidson E,Bryan C,Fong R H,et al.Mechanism of binding to Ebola virus glycoprotein by the ZMapp,ZMAb,and MB-003 cocktail antibodies[J].J Virol,2015,89:10982-10992.

[23]Flyak A I,Shen X,Murin C D,et al.Cross-reac?tive and potent neutralizing antibody responses in hu?man survivors of natural Ebolavirus infection[J].Cell, 2016,164:392-405.

[24]Carroll S A,Towner J S,Sealy T K,et al.Molecu?lar evolution ofviruses ofthe family Filoviridae based on 97 whole-genome sequences[J].J Virol, 2013,87(5):2608-2616.

（“科研管理”、“綜述”、“研究報告”欄目責(zé)任編輯：閻明凡；英文審校：于學(xué)玲）

Expression and Purification of a Truncated Form of Ebola Virus Glycoprotein

FAN Peng-Fei,CHI Xiang-Yang,SONG Xiao-Hong,FANG Ting,WU Shi-Po, CHEN Yi,WANG Xiao-Lin,ZHANG Guan-Ying,YU Chang-Ming*,CHEN Wei*
Laboratory of Vaccine and Antibody Engineering,Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Co-corresponding authors,YU Chang-Ming,E-mail:yuchangming@126.com;CHEN Wei,E-mail:cw0226@foxmail.com

Objective:To determine the optimal expression system of a truncated envelope glycoprotein（GPdmu?cin）of Ebola virus,and to obtain purified GPdmucin.Methods:The GPdmucin sequences were amplified from full-length gene of glycoprotein（GP）and cloned into pET32a,pFastBac1 and pcDNA3.4 vectors,then they were transfected into prokaryotic,insect and mammalian expression systems,respectively.The expression of GPdmucin was identified through Western blotting.Results:The GPdmucin expressed in prokaryotic cells was unstable,and had poor biological activity.In the insect expression system,insoluble GPdmucin was expressed intracellularly.Sol?uble GPdmucin was produced in Expi293 mammalian transient protein expression system,and the purity of which was over 90%after purification by Ni affinity chromatography.The biological activity of GPdmucin was confirmed?with specific antibodies in ELISA.Conclusion:GPdmucinhas been expressed in mammalian expression systems, and it can be used in production of GPcl,screening of GP specific antibodies,evaluation of vaccine efficacy and research on viral pathogenesis.

Ebola virus;GPdmucin;mammalian expression system;biological activity

Q78;R392

A

1009-0002（2017）01-0050-08

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.009

2017-01-02

國家科技重大專項（2014ZX09J14301）

范鵬飛（1993-），男，碩士研究生

于長明，（E-mail）yuchangming@126.com；陳薇，（E-mail）cw0226@foxmail.com