袁盛凌，王艷春，劉純杰

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

綜述

合成生物學(xué)助力應(yīng)急疫苗研制

袁盛凌，王艷春，劉純杰

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

合成生物學(xué)具有系統(tǒng)性思維和工程學(xué)理念的特點(diǎn)，致力于創(chuàng)造新的生命或新的系統(tǒng)。合成生物學(xué)為疫苗研發(fā)人員提供了新的思路，不斷開發(fā)出新疫苗研制的技術(shù)平臺(tái)。通過抗原重構(gòu)技術(shù)，合成的強(qiáng)抗原能夠很好地激活VRC0-1種系的B細(xì)胞；利用合成生物學(xué)合成自組裝的納米顆粒疫苗，能夠有效地暴露保守抗原；通過合成生物學(xué)完成流感疫苗基因組的快速組裝，大大縮短了疫苗的研制周期；通過系統(tǒng)性地改造，重組沙門菌再一次成為疫苗開發(fā)的重要工具。合成生物學(xué)在應(yīng)急疫苗研發(fā)過程中疫苗研制平臺(tái)搭建及快速合成新發(fā)傳染病抗原方面發(fā)揮著突出作用。

合成生物學(xué)；疫苗；流感疫情；重組沙門菌;遞送系統(tǒng)

合成生物學(xué)研究建立在分子生物學(xué)、遺傳工程、代謝工程、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)及各種組學(xué)研究的基礎(chǔ)之上，其定義是：利用工程理念理性合成復(fù)雜的、具有生物意義的不同層次系統(tǒng)——從單個(gè)生物分子到整個(gè)細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體乃至群體，執(zhí)行自然界中沒有的功能。

合成生物學(xué)作為最新的思維工具和技術(shù)手段，幫助研究人員不斷拓展新的研究領(lǐng)域。比如在疫苗研發(fā)過程中，合成生物學(xué)幫助人們?cè)O(shè)計(jì)制造更有效、更通用、更及時(shí)的疫苗。在病毒肆虐的今天，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、埃博拉病毒（Ebola virus）、寨卡病毒（Zika virus）等病原微生物，正在不斷威脅著人類的健康。隨著全球人群的流動(dòng)性越來越大，疫情傳播速度極快，疫情防控迫在眉睫。研制有效的應(yīng)急疫苗是科研人員義不容辭的責(zé)任。合成生物學(xué)的研究方法能夠更好地為科研人員搭建疫苗研制平臺(tái)，鍛煉應(yīng)急疫苗研制的技術(shù)能力，在真正疫情到來之時(shí)，將平臺(tái)上的抗原組件進(jìn)行替換，通過平臺(tái)技術(shù)銜接，在最短的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出適應(yīng)疫情的疫苗，讓科研力量成為保護(hù)人類健康、維護(hù)社會(huì)穩(wěn)定的堅(jiān)強(qiáng)后盾。

1 合成生物學(xué)幫助設(shè)計(jì)HIV強(qiáng)抗原

如果天然病毒的免疫原性比較弱，可以利用合成生物學(xué)合成模擬病毒顆粒的強(qiáng)免疫原。一直以來，人免疫缺陷病毒（HIV）的包膜糖蛋白雖然可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但人體產(chǎn)生的中和抗體卻極少，主要原因是：①天然的包膜糖蛋白的免疫原性弱；②免疫原具有高度變異性；③免疫原被最外層的糖苷類物質(zhì)包裹。以上三個(gè)原因使得天然病毒不能有效刺激人體的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生的有效中和抗體少之又少。所以，設(shè)計(jì)強(qiáng)免疫原是研制有效的艾滋病疫苗的關(guān)鍵。

VRC01類廣譜中和抗體，可以特異性地針對(duì)HIV gp120上的CD4結(jié)合位點(diǎn)，所以被認(rèn)為是對(duì)抗病毒的有效抗體。然而天然的HIV蛋白無法結(jié)合或刺激VRC01的種系B細(xì)胞，因此無法啟動(dòng)抗體反應(yīng)過程。研究者著手設(shè)計(jì)一種能夠?qū)崿F(xiàn)這一過程的人工免疫原[1]。他們利用蛋白質(zhì)建模軟件，改善了VRC01種系B細(xì)胞抗體與HIV包膜蛋白結(jié)合能力；隨后生成了包含所有可能的有益突變組合的文庫(kù)，獲得了數(shù)以百萬計(jì)的突變體，利用酵母表面展示技術(shù)和FACS對(duì)它們進(jìn)行篩查，結(jié)合計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和定向演化，生成了幾個(gè)對(duì)種系VRC01類抗體具有高親和力的突變包膜蛋白，利用eOD軟件確定了優(yōu)化的eOD-GT6免疫原。采用X線晶體學(xué)確定了這種免疫原的3D原子結(jié)構(gòu)、VRC01抗體的晶體結(jié)構(gòu)，以及免疫原與抗體結(jié)合在一起的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，研究人員設(shè)計(jì)合成了納米級(jí)自組裝的模擬病毒顆粒（圖1），其由60個(gè)拷貝的單體聚合而成，每一個(gè)單體由二氧四氫蝶啶合成酶融合包膜糖蛋白eOD-GT6而構(gòu)成，eOD-GT6上糖苷的位置完全不會(huì)遮蔽免疫原。這個(gè)模擬的納米病毒顆粒極好地激活了培養(yǎng)皿中的VRC01種系B細(xì)胞，甚至成熟B細(xì)胞，而單拷貝eODGT6則不能。這充分說明通過重構(gòu)免疫原的結(jié)構(gòu)和組裝形式，可以獲得很好的免疫效果。

圖1 60聚體的eOD-GT6納米顆粒

2 合成生物學(xué)幫助設(shè)計(jì)通用流感疫苗

與HIV包膜蛋白類似，流感病毒血凝素抗原總是隱藏在分子內(nèi)部，天然病毒結(jié)構(gòu)不能很好地暴露這些保守的抗原表位。利用合成生物學(xué)的方法，可以將HA抗原被遮蔽的部分進(jìn)行有效暴露，更有利于機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)保守區(qū)段的廣譜的中和抗體[2]。血凝素HA是流感病毒衣殼上的主要抗原性蛋白，而鐵蛋白（ferritin）是來自幽門螺桿菌的能夠自然形成球狀簇的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究人員將這2種蛋白融合起來，生成能夠自動(dòng)裝配的HA-ferritin復(fù)合體。該復(fù)合體從鐵蛋白核心伸出由HA組成的8個(gè)突起，模擬流感病毒衣殼上的天然HA突起。這種設(shè)計(jì)能使血球凝集素上的HA分子變得疏散，不會(huì)被其他衣殼蛋白遮蔽，能讓免疫系統(tǒng)獲取更全面的信息，靶向不同流感菌株的通用HA位點(diǎn)，包括識(shí)別宿主細(xì)胞特定受體的頭部和幫助病毒入侵的莖部（圖2）。

圖2 自組裝的納米顆粒流感通用疫苗的設(shè)計(jì)

3 合成生物學(xué)幫助應(yīng)急流感疫苗的研發(fā)

傳統(tǒng)的流感疫苗從研制到上市最快需要幾個(gè)月的時(shí)間，如2009年H1N1甲型流感病毒疫苗，在沒有合成生物學(xué)技術(shù)支持的情況下，雖然以前所未有的速度進(jìn)行研制和生產(chǎn)，但疫苗上市時(shí)仍然遺憾地錯(cuò)過了H1N1流感病毒肆虐的高峰期，錯(cuò)過了人群的最大需求時(shí)期，沒有發(fā)揮應(yīng)有的作用。

2013年，當(dāng)新型流感病毒毒株H7N9在中國(guó)出現(xiàn)的時(shí)候，一個(gè)重要問題擺到人們面前：一旦這種流感病毒或其他病毒大規(guī)模來襲，人們是否能足夠快地生產(chǎn)出足量疫苗應(yīng)對(duì)疫情？應(yīng)急流感疫苗的研制技術(shù)將決定在疫情防控大戰(zhàn)中人類是否能夠掌握主動(dòng)。利用合成生物學(xué)的方法，J.Craig Venter的合成基因組公司與疫苗制造商瑞士諾華公司聯(lián)合設(shè)計(jì)了合成流感疫苗基因組的快速研發(fā)方式[3]。這種合成方式分為兩步：第一步是變異的HA和NA基因的全基因人工合成，第二步是新合成的變異基因與流感病毒的主干基因融合，制造雜合基因組，快速完成病毒拯救。

在變異的HA和NA基因的全基因人工合成中，文特爾研究所的研究人員用不到1天的時(shí)間即可將新發(fā)流感病毒的序列從網(wǎng)上下載、設(shè)計(jì)序列片段、人工拼接、獲得病毒的HA和NA基因的正確序列。在這項(xiàng)應(yīng)急疫苗研制項(xiàng)目中，文特爾研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了一種恒溫一步法組裝技術(shù)，稱作“Gibson恒溫組裝法”，即利用5'核酸外切酶、高保真DNA聚合酶及連接酶的協(xié)調(diào)作用，在體外將多個(gè)帶有重疊區(qū)的DNA片段組裝起來，再利用error correct ErrASE商業(yè)糾錯(cuò)試劑盒糾正序列中的錯(cuò)誤匹配，快速而準(zhǔn)確地合成HA和NA基因（圖3A），僅僅這項(xiàng)技術(shù)就比其他基因合成公司的合成時(shí)間縮短了3～5天。

隨后由諾華公司負(fù)責(zé)，將人工合成的HA和NA基因拼接到PR8基因組中，合成流感病毒雜合基因組，進(jìn)行病毒拯救。他們選用的主干基因是改進(jìn)型的，盡量保證病毒基因間的組配達(dá)到最佳；選用的宿主細(xì)胞是疫苗工業(yè)生產(chǎn)許可的狗腎細(xì)胞（MDCK），在病毒拯救過程中，直接用這種細(xì)胞篩選病毒滴度高的病毒株。在嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)下，從拿到流行毒株序列，到合成出種子病毒，僅僅需要5天時(shí)間（圖3B），將疫苗生產(chǎn)時(shí)間至少縮短了4周。

2013年3月31日，中國(guó)疾控中心宣布了人類H7N9傳染病，并在在線數(shù)據(jù)庫(kù)中儲(chǔ)存了該病毒的基因組序列。次日，美國(guó)圣迭戈市文特爾研究所的科學(xué)家就合成了該病毒的HA和NA基因，之后他們立即將合成物送到諾華公司實(shí)驗(yàn)室，并與PR8融合，4月6日即制成了首個(gè)種子病毒。合成生物學(xué)助力的流感病毒疫苗的快速研制技術(shù)，成為人類戰(zhàn)勝疫情的重要武器。

圖3 流感應(yīng)急疫苗合成時(shí)間表

4 合成生物學(xué)讓活菌載體疫苗重新煥發(fā)新的生命

減毒沙門菌作為遞送載體，已經(jīng)研究了近30年。沙門菌能夠侵入組織和細(xì)胞，全面激發(fā)機(jī)體的體液免疫、黏膜免疫和細(xì)胞免疫，免疫原性強(qiáng)，維持時(shí)間長(zhǎng)。限制該活菌載體廣泛應(yīng)用的原因之一是毒性和免疫原性的平衡問題。如果減毒充分，此活菌載體的侵入性將變?nèi)?，免疫原性變差；而如果要保持其免疫原性，其殘留的毒力又是疫苗安全性的一大障礙。利用合成生物學(xué)的原理，亞利桑那州立大學(xué)Roy CurtissⅢ實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了重組減毒沙門菌疫苗（recombi?nantattenuated Salmonella vaccine，RASV）遞送系統(tǒng)，該載體以可調(diào)節(jié)的延遲裂解為特色，保持了載體的侵入、定植能力，具備出色的免疫效果；同時(shí)，巧妙設(shè)計(jì)基因的表達(dá)，使其侵入組織后自行裂解，充分減毒[4]。它的設(shè)計(jì)原理主要是根據(jù)體外-腸道-淋巴組織中必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如甘露糖或阿拉伯糖）逐漸匱乏的原理，構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，毒力和功能受到環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度嚴(yán)格控制。體外培養(yǎng)時(shí)，阿拉伯糖來源充分，負(fù)責(zé)細(xì)菌細(xì)胞壁、脂多糖合成的基因如asd、murA在體外表達(dá)，負(fù)責(zé)細(xì)菌代謝的基因如fur、crp也在體外表達(dá)；口服入腸道后，阿拉伯糖來源減少，但asd、murA、fur、crp能繼續(xù)表達(dá)，保持侵入淋巴組織的毒力；入侵淋巴組織后，由于缺乏阿拉伯糖，上述4種基因表達(dá)關(guān)閉，細(xì)菌裂解，毒力喪失；與此同時(shí)，受阿拉伯糖調(diào)控表達(dá)的阻遏蛋白不再產(chǎn)生，使保護(hù)性抗原表達(dá)解除抑制，在淋巴組織中大量表達(dá)，使抗原得到有效遞送。他們利用RASV構(gòu)建了肺炎球菌疫苗，取得了非常好的免疫效果和保護(hù)效果[5]。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)還設(shè)計(jì)合成了遞送WSN流感病毒HA基因的DNA疫苗。此遞送系統(tǒng)含有真核轉(zhuǎn)錄元件，當(dāng)RASV侵入宿主細(xì)胞后，啟動(dòng)裂解行動(dòng)，釋放DNA載體。DNA載體入核后，開始表達(dá)相關(guān)抗原，激發(fā)宿主系統(tǒng)性的免疫應(yīng)答。為了更好地呈現(xiàn)遞送載體的優(yōu)勢(shì)，他們通過刪除基因或增添新的元件，使新的遞送體系具備如下特征：具有更好的侵入能力；最大限度地內(nèi)在化，避免其在胞質(zhì)中釋放DNA疫苗；降低入侵造成的細(xì)胞凋亡或程序性死亡；增加DNA對(duì)宿主核酸酶的抗性；添加DNA核靶向序列（DTS）和核定位序列，以便DNA疫苗能夠入核，有效地合成編碼的保護(hù)性抗原。如此精心設(shè)計(jì)合成的流感疫苗，可以達(dá)到對(duì)小鼠100%的免疫保護(hù)[6]。此DNA疫苗可以快速制備，隨病原的不同而隨時(shí)改變DNA序列，比如可以將WSN流感病毒HA基因替換為其他型別的HA基因，或替換為埃博拉病毒的包膜糖蛋白GP基因?；谌碌腞ASV遞送系統(tǒng)的DNA疫苗有望成為應(yīng)對(duì)未知或新型生物威脅的有效防御手段。

5 應(yīng)急疫苗研制過程中合成生物學(xué)的助力點(diǎn)

合成生物學(xué)正在蓬勃發(fā)展，它的最大特點(diǎn)就是創(chuàng)造：從創(chuàng)造新的生命、新的代謝通路到創(chuàng)造新的分子、新的遞送工具……，合成生物學(xué)在疫苗研制方面為研究人員提供了更廣的空間，更自由的設(shè)計(jì)。在新疫苗開發(fā)上，可以根據(jù)中和性抗體來設(shè)計(jì)并合成與之相對(duì)應(yīng)的保護(hù)性抗原，為疫苗的設(shè)計(jì)提供了全新的角度；在疫苗的形式方面，可以設(shè)計(jì)成納米顆粒，充分有效地暴露免疫原，并以聚體的形式增強(qiáng)其免疫原性；在疫苗遞送方面，從系統(tǒng)的角度改進(jìn)舊有的遞送載體，讓其呈現(xiàn)出最理想遞送效果和絕對(duì)的安全性；從疫苗的研制效率方面，極大地縮短疫苗研發(fā)生產(chǎn)的時(shí)間，使人們面對(duì)流感疫情時(shí)不再束手無策。

因此，合成生物學(xué)為疫苗研制提供了全新的技術(shù)平臺(tái)和技術(shù)路線。從工程的角度考慮，這些技術(shù)平臺(tái)和技術(shù)路線就像模塊一樣，方便組裝和替換，利用不同的元件，可以組裝成不同的疫苗。而不同病原微生物的保護(hù)性抗原，則是技術(shù)平臺(tái)中的一個(gè)個(gè)可變模塊，它們與對(duì)應(yīng)模塊之間的相互替換，在原則上并不會(huì)改變整個(gè)技術(shù)平臺(tái)的穩(wěn)定性和有效性。比如每一次流感大流行可能會(huì)遭遇到不同的流感病毒，而在科研人員看來，不同的流感病毒只是換了HA和NA抗原蛋白的老朋友，因此，將新的HA和NA序列與已有的流感疫苗研制平臺(tái)銜接，就可以快速制造適應(yīng)新疫情的流感疫苗。

圖4 應(yīng)急疫苗的研制流程

其次，合成生物學(xué)技術(shù)可以保證在突發(fā)疫情來臨時(shí)，可以根據(jù)病原基因組序列進(jìn)行迅速分析和保護(hù)性抗原基因的快速人工合成，并且在這一點(diǎn)上速度可以做到極致（1天之內(nèi)），有效地節(jié)約了異地甚至異國(guó)采樣的路途奔波時(shí)間或樣品郵寄過程所耽誤的時(shí)間。

可以想見，當(dāng)新的疫情悄然來襲時(shí)，疾控人員迅速到位，采集樣品進(jìn)行病原分析鑒定，其基因組數(shù)據(jù)在第一時(shí)間上傳至聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)；疫苗研制人員則在第一時(shí)間下載數(shù)據(jù)，進(jìn)行保護(hù)性抗原基因的人工合成并對(duì)接平臺(tái)技術(shù)，合成對(duì)應(yīng)疫情的新疫苗，比如病毒顆粒疫苗、納米顆粒疫苗、新型遞送載體類疫苗等；之后，疫苗的生產(chǎn)迅速啟動(dòng)，在最短的時(shí)間內(nèi)拿到新發(fā)傳染病的人群接種疫苗。這是多么令人盼望的一刻，但也是現(xiàn)有技術(shù)通過整合完全能夠做到的事。合成生物學(xué)在應(yīng)急疫苗的構(gòu)建和平臺(tái)建立方面均起到了很好的支持作用，為疫情防控打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]Jardine J,Julien J P,Menis S,et al.Rational HIV immunogen design to target specific germline B cell receptors[J].Science,2013,340(6133):711-716.

[2]Kanekiyo M,Wei C J,Yassine H M,et al.Self-as?sembling influenza nanoparticle vaccines elicit broad?lyneutralizingH1N1 antibodies[J].Nature,2013,499 (7456):102-106.

[3]Dormitzer P R,Suphaphiphat P,Gibson D G,et al.Synthetic generation of influenza vaccine viruses for rapid response to pandemics[J].Sci Transl Med, 2013,5(185):185ra68.

[4]Curtiss R 3rd,Wanda S Y,Gunn B M,et al.Sal?monella enterica serovar Typhimurium strains with regulated delayed attenuation in vivo[J].InfectIm?mun,2009,77(3):1071-1082.

[5]Li Y H,Wang S F,Scarpellini G,et al.Evalua?tion ofnew generation Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccines with regulated delayed attenua?tion to induce immune responses againstPspA[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(2):593-598.

[6]Kong W,Brovold M,Koeneman B A,et al.Turn?ing self-destructing Salmonella into a universal DNA vaccine delivery platform[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(47):19414-19419.

Synthetic Biology Contributes to Rapid Production of Vac?cine for Emergency Use

YUAN Sheng-Ling,WANG Yan-Chun,LIU Chun-Jie*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Corresponding author,E-mail:Liucj@nic.bmi.ac.cn

Synthetic biology,the engineering of biology,aims to synthesis of complex,biologically based systems to display functions that do not exist in nature.In this review,we focused on new ideas and new technology plat?forms provided by synthetic biology for the vaccine development.Through the technology of antigen reconstruction, a more effective immunogen was synthesized and could activated germline and mature VRC01-class B cells;selfassembling influenza nanoparticle vaccine induces antibodies targeting conservative regions of both the HA stem and the HA head,and produce antibodies against a wider range of flu strains than traditional vaccines;synthetic vaccine seeds will be assembled and rescued rapidly,which would accelerate responses to influenza pandemics;by systematic reconstruction,recombinant attenuated Salmonella vaccine（RASV）strains exhibiting both hyperinvasive phenotype and delayed lysis phenotype becomes a universal DNA vaccine-delivery vehicle.In all,synthetic biolo?gy plays an important role in new technology platforms and rapid assembly of the pathogenic microorganism anti?gens during vaccine development against emerging infectious diseases.

synthetic biology;vaccine;influenza pandemics;recombinant attenuated Salmonella vaccine;delivery vector

Q-3;R392

A

1009-0002（2017）01-0044-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.008

2017-01-02

袁盛凌（1973-），女，副研究員

劉純杰，（E-mail）Liucj@nic.bmi.ac.cn