劉航，郝建忠，欒可峰，李哲，于天資，張繼萍

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔系，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 濰坊 261031；3.濰坊醫(yī)學(xué)院管理系，山東 濰坊 261053)

CGRP影響人牙髓干細(xì)胞增殖分化的研究

劉航1，郝建忠2，欒可峰1，李哲1，于天資1，張繼萍3

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔系，山東 濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，山東 濰坊 261031；3.濰坊醫(yī)學(xué)院管理系，山東 濰坊 261053)

目的 研究降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用，并初步探討CGRP的調(diào)控信號(hào)通路。方法首先獲取健康的牙髓，體外培養(yǎng)并篩選牙髓干細(xì)胞；采用MTT法檢測(cè)不同濃度的CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖作用，獲取適宜的作用濃度；利用茜素紅染色法觀察CGRP作用下牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的效果；在實(shí)時(shí)定量RT-PCR法及免疫印跡法檢測(cè)CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Ⅰ型膠原(Col-1)、轉(zhuǎn)錄因子Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)水平；最后利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)MAPK信號(hào)通路抑制劑作用下CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果經(jīng)過篩選培養(yǎng)獲得生長(zhǎng)穩(wěn)定的牙髓干細(xì)胞；MTT法檢測(cè)可知CGRP可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖，在CGRP的濃度達(dá)到10-7mol/L時(shí)效果最顯著；在CGRP作用牙髓干細(xì)胞28 d后，經(jīng)茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)；經(jīng)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法和免疫印跡法檢測(cè)可知CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)水平得到顯著提高；MAPK信號(hào)通路中ERK激酶通路能夠調(diào)控CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Runx2表達(dá)的水平，ERK激酶和p38通路能夠調(diào)控CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Col-1表達(dá)的水平。結(jié)論CGRP能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖分化，這一作用受到MAPK信號(hào)通路的調(diào)控。

降鈣素基因相關(guān)肽；牙髓干細(xì)胞；分化；MAPK信號(hào)通路；細(xì)胞增殖

牙髓干細(xì)胞是存在于牙髓組織當(dāng)中具有很強(qiáng)增殖和多向分化功能的一種干細(xì)胞。當(dāng)牙髓受到外界刺激如細(xì)菌毒素、機(jī)械化學(xué)等作用時(shí)，牙髓干細(xì)胞會(huì)通過多方定向分化對(duì)牙髓環(huán)境的穩(wěn)態(tài)進(jìn)行維持。其中牙髓干細(xì)胞可以通過許多外界信號(hào)誘導(dǎo)后形成牙本質(zhì)樣細(xì)胞[1-3]，對(duì)牙本質(zhì)及牙髓組織進(jìn)行修復(fù)保護(hù)。降鈣素相關(guān)基因肽(CGRP)主要是由感覺陽性神經(jīng)纖維分泌產(chǎn)生，它的存在范圍主要是隨著神經(jīng)末梢的分布而存在于人體絕大多數(shù)器官組織中[4]。研究發(fā)現(xiàn)CGRP能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[5-6]，體外環(huán)境下CGRP對(duì)成骨細(xì)胞中的ALP、CollaⅠ和OCN等成骨標(biāo)志基因蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用[7-8]。牙髓組織當(dāng)中的感覺神經(jīng)分布很多，牙髓干細(xì)胞存在很強(qiáng)的定向成骨分化能力。筆者通過體外培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，研究在CGRP的作用下牙髓干細(xì)胞的增殖和成骨分化能力，探討兩者之間是否存在的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 CGRP(sigma公司)；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司)；DMSO(Amresco公司)；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；MTT、茜素紅(碧云天公司)胎牛血清(杭州四季青公司)；兔抗人Col-1、ALP抗體(Santa Cruz公司)；PD98059、SP600125、SB203580 (Sellck Chemicals公司)。

1.2 方法

1.2.1 牙髓干細(xì)胞的獲取及培養(yǎng) 從臨床上收集到的正常健康完整的拔除的智齒，消毒后放在冷卻的αMEM培養(yǎng)液中暫時(shí)保存。在無菌環(huán)境下破壞牙齒，取出牙髓，留下冠髓，去掉根尖1/3的牙髓，在用加有抗生素的PBS液沖洗牙髓組織下沖洗3次，剪成小塊狀。用3 mg/mL collagenase type I和4 mg/mL dispase在37℃環(huán)境下震蕩水浴2 h，可見牙髓不再成完整形態(tài)。將液體用70 μm的篩子進(jìn)行過濾，獲取到的細(xì)胞懸液離心后去掉上清，將細(xì)胞接種到含有15%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。接種入直徑為10 cm的塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分：αMEM，15%胎牛血清，100 μmol/L L-ascorbic acid 2-phosphate，2 mmol/L L-glutamine，100 U/mL青霉素，100 μg/mL的鏈霉素，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行牙髓干細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，用PBS緩沖液洗滌3次，去除未貼壁的細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后，在倒置顯微鏡下鑒定克隆的形成。細(xì)胞集落中含有50個(gè)以上的細(xì)胞被認(rèn)為是SHED的克隆。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化后按1：4的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度的CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖作用 取細(xì)胞傳代至第3代且生長(zhǎng)狀況良好的人牙髓干細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化呈懸浮單細(xì)胞，以8 000/cm2的密度將牙髓細(xì)胞傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后在培養(yǎng)皿中依次加入濃度分別為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、 10-6mol/L的CGRP，空白對(duì)照組為PBS緩沖液，每個(gè)濃度分別有6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞分別在繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗3次，在每個(gè)復(fù)孔中加入20 μL的MTT試劑，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4 h，再次去除培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗3次后，在每個(gè)復(fù)孔中加入150 μL的DMSO試劑，輕輕震蕩5 min后在酶標(biāo)儀上以490 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)光密度值。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以光密度值及CGRP濃度為軸，繪制牙髓干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 茜素紅染色法觀察CGRP作用下牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的效果 根據(jù)MTT檢測(cè)結(jié)果，選取CGRP濃度為10-7mol/L進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。取細(xì)胞傳代至第3代且生長(zhǎng)狀況良好的人牙髓干細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化呈懸浮單細(xì)胞，以8 000/cm2的密度將牙髓細(xì)胞傳至細(xì)胞培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)組為加入含10-7mol/L CGRP的αMEM，15%胎牛血清培養(yǎng)基；空白對(duì)照組為不含CGRP的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)21 d，4 d傳代一次。20 d后，先用PBS緩沖液沖洗培養(yǎng)皿3次，然后加入無水乙醇15 min以固定細(xì)胞，蒸水沖洗培養(yǎng)皿3次，去凈乙醇，加入pH值調(diào)整至8.3的0.1%茜素紅-Tris-HCL，在37℃的環(huán)境下靜置30 min，蒸水沖洗培養(yǎng)皿3次后室溫下靜置干燥，顯微鏡下觀察并拍攝照片。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2的mRNA表達(dá)水平 取細(xì)胞傳代至第3代且生長(zhǎng)狀況良好的人牙髓干細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化呈懸浮單細(xì)胞，以8 000/cm2的密度將牙髓細(xì)胞傳至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，加入10-7mol/L的CGRP繼續(xù)培養(yǎng)，空白對(duì)照組為PBS緩沖液。分別培養(yǎng)刺激12 h、24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞。然后按照說明書提取牙髓干細(xì)胞的總mRNA，在牙髓干細(xì)胞中加入RNAiso Plus裂解細(xì)胞，在細(xì)胞混合液中加入氯仿，混勻后在4℃下離心使溶液分層液體；取上清加入同體積的異丙醇，混勻后冰上靜置、離心；獲得少量沉淀物，加入75%乙醇洗滌沉淀并離心，加入DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞總mRNA：分別測(cè)定細(xì)胞總RNA在260 nm和280 nm處的光密度值，最后計(jì)算mRNA的含量和純度。以提取的牙髓干細(xì)胞總mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。PCR的引物序列設(shè)計(jì)為：Col-1上游，5'-TCTACTGGCGAAACCTGTATCCG-3'；下游，5'-GCAACAAGTTCAACATCATTA GAGCC-3'；獲得的DNA片段長(zhǎng)度為314 bp。IQ5TM PCR儀上設(shè)置的條件為：預(yù)變性溫度為95℃/4 min 1個(gè)循環(huán)；變性溫度95℃/10 s，退火溫度52.1℃/15 s，延伸溫度72℃/25 s 40個(gè)循環(huán)；最后延伸溫度72℃/1 min 1個(gè)循環(huán)。Runx2上游，5'-TCACCTCAGGCATGTCCCTC-GGTAT-3'；下游，5'-TGGCTTCCATCAGCGTCAACACC-3'；獲得的DNA片段長(zhǎng)度為289 bp。IQ5TM PCR儀上設(shè)置的條件為：預(yù)變性溫度為95℃/4 min 1個(gè)循環(huán)；變性溫度95℃/10 s，退火溫度59.8℃/15 s，延伸溫度72℃/25 s 40個(gè)循環(huán)；最后延伸溫度72℃/1 min 1個(gè)循環(huán)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)CGPR調(diào)控人牙髓細(xì)胞中Col-1、Runx2蛋白的表達(dá)水平 取細(xì)胞傳代至第3代且生長(zhǎng)狀況良好的人牙髓干細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化呈懸浮單細(xì)胞，以8 000/cm2的密度將牙髓細(xì)胞傳至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)20 h后細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后在培養(yǎng)皿中加入CGRP至濃度為10-7mol/L。將培養(yǎng)皿分為兩組，每組為兩個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)組加入CGRP，空白對(duì)照組為PBS緩沖液，分別在作用48 h及72 h兩個(gè)階段后胰酶消化收集細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞并收集上清液。經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度后，取25 μL的液體加入兩倍量的凝膠上樣緩沖液并充分混勻，煮沸10 min使蛋白變性，再次離心獲取上清。在SDS-PAGE凝膠上以60 V電壓進(jìn)行電泳，以120 V電壓進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1 h。然后Col-1、ALP兔抗人一抗進(jìn)行免疫反應(yīng)1.5 h，再加入Col-1、ALP鼠抗兔二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)1.5 h。最后進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)并拍照。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MAPK信號(hào)通路抑制劑作用下CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響 取細(xì)胞傳代至第3代且生長(zhǎng)狀況良好的人牙髓干細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化呈懸浮單細(xì)胞，以8 000/cm2的密度將牙髓細(xì)胞傳至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，加入10-7mol/L的CGRP繼續(xù)培養(yǎng)，空白對(duì)照組為PBS緩沖液，刺激培養(yǎng)20 h。將細(xì)胞分為4組分別加入抑制劑阻斷4 h，每組6個(gè)復(fù)孔。組1：DMSO空白對(duì)照；組2：ERK激酶MAPK抑制劑(PD98059)(100 μmol/L)；組3：JNK MAPK抑制劑(SP600125)(100 μmol/L)；組4：P38 MAPK抑制劑(SB203580)(25 μmol/L)。轉(zhuǎn)染完成24 h后以此前成骨細(xì)胞的總mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)3種MAPK信號(hào)通路抑制劑作用下CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Ⅰ型膠原、Runx2 mRNA表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)條件以1.2.4為準(zhǔn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)總共重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法根據(jù)組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 牙髓干細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) 經(jīng)過組織塊酶消化法獲得并篩選出牙髓干細(xì)胞24 h后可見大多數(shù)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)較小，且呈長(zhǎng)圓形，少有伸展，少量細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。48 h后可見牙髓干細(xì)胞完全伸展開，呈梭狀，細(xì)胞尚未增殖，細(xì)胞數(shù)目較為稀疏。培養(yǎng)6 d后，牙髓干細(xì)胞大量增殖，形態(tài)呈長(zhǎng)梭狀，細(xì)胞之間緊密接觸(圖1)。

圖1 牙髓干細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)

2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度的CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖作用 根據(jù)MTT檢測(cè)可見在CGRP作用于牙髓干細(xì)胞24 h以后，各個(gè)濃度組的干細(xì)胞數(shù)目均多于空白對(duì)照組，表明CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞具有顯著的促進(jìn)增殖的作用。在各個(gè)濃度組中，以10-7mol/L濃度組促進(jìn)效果最為顯著，因此以后的實(shí)驗(yàn)都將以10-7mol/L濃度進(jìn)行(圖2)。

圖2 MTT法檢測(cè)不同濃度的CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的增殖作用

2.3 茜素紅染色法觀察CGRP作用下牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的效果 細(xì)胞培養(yǎng)21 d并經(jīng)茜素紅染色，在顯微鏡下可見，經(jīng)CGRP刺激的牙髓干細(xì)胞增殖數(shù)量較多，排列較為緊密，明顯可見有重度紅褐色染色的團(tuán)狀礦化結(jié)節(jié)。空白對(duì)照組的牙髓干細(xì)胞排列相對(duì)稀疏，未見有紅色染色的團(tuán)狀礦化結(jié)節(jié)(圖3)。

圖3 茜素紅染色法觀察CGRP作用下牙髓干細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的效果

2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2的mRNA表達(dá)水平 根據(jù)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果，CGRP能夠顯著增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2的mRNA表達(dá)水平。在作用24 h時(shí)，CGRP的上調(diào)Runx2作用最為顯著，在作用48 h時(shí)，CGRP的上調(diào)Col-1作用最為顯著(圖4)。

圖4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)CGRP作用下牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2的mRNA表達(dá)水平

2.5 Western blot檢測(cè)CGPR調(diào)控人牙髓細(xì)胞中Col-1、Runx2蛋白的表達(dá)水平 根據(jù)western blot的結(jié)果，在CGRP作用下，牙髓干細(xì)胞中的Col-1、Runx2的蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比得到顯著增強(qiáng)，在作用72 h時(shí)的蛋白表達(dá)水平最高(圖5)。

圖5 Western blot檢測(cè)CGPR調(diào)控人牙髓細(xì)胞中Col-1、ALP蛋白的表達(dá)水平

2.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MAPK信號(hào)通路抑制劑作用下CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響 根據(jù)實(shí)時(shí)定量RT-PCR的結(jié)果，ERK激酶MAPK抑制劑(PD98059)能夠顯著抑制CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Runx2的mRNA表達(dá)水平的促進(jìn)作用，P38 MAPK抑制劑(SB203580)和ERK激酶MAPK抑制劑(PD98059)能夠顯著抑制CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Col-1的mRNA表達(dá)水平的促進(jìn)作用(圖6)。說明p38和ERK通路可能參與了CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的成骨分化，而JNK通路可能未參與這一過程。

圖6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MAPK信號(hào)通路抑制劑作用下CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2 mRNA表達(dá)水平的影響

3 討 論

牙髓干細(xì)胞是最先由Gronthos等[9]從牙髓組織中獲取的一種干細(xì)胞，這種干細(xì)胞屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，能夠接受外界細(xì)胞因子等的作用下發(fā)生高度的增殖和多向分化能力，尤其是能夠分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。在牙髓因外界的機(jī)械或細(xì)菌病毒刺激所導(dǎo)致的損傷時(shí)，牙髓干細(xì)胞因環(huán)境的變化會(huì)分化成為成牙本質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而形成二期修復(fù)性牙本質(zhì)，能夠?qū)κ軗p的牙本質(zhì)和牙髓環(huán)境進(jìn)行修復(fù)維持。牙髓干細(xì)胞可以分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞的能力得到了很多研究人員的關(guān)注。牙髓干細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)的方法簡(jiǎn)單，成功率也很高。當(dāng)前主要通過組織塊酶消化結(jié)合法獲得牙髓干細(xì)胞，培養(yǎng)方法也依然是貼壁培養(yǎng)方法，并在培養(yǎng)基中加入藥物進(jìn)行篩選牙髓干細(xì)胞。

降鈣素相關(guān)基因肽是由Rosenfeld等[10]發(fā)現(xiàn)的，由37個(gè)氨基酸生物活性多肽構(gòu)成。CGRP主要是由感覺陽性神經(jīng)纖維分泌產(chǎn)生的，其分布的范圍主要是隨神經(jīng)末梢的分布而廣泛分布的[4]。在人的牙齒及其周圍組織中，CGRP是廣泛分布的，牙髓、牙周膜、牙槽骨以及頜骨都分布著大量的富含CGRP的神經(jīng)纖維，尤其是在牙髓組織當(dāng)中感覺神經(jīng)以及血管的分布是極廣的，CGRP能夠參與調(diào)節(jié)牙髓、牙周膜、牙槽骨以及頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)改建等過程[11-12]。Fristad等[13]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CGRP的受體在大鼠的牙齒和牙周組織中廣泛分布，在感覺神經(jīng)受到外界刺激后，會(huì)產(chǎn)生大量的CGRP，從而調(diào)節(jié)牙齒及牙周組織中的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞的增殖分化，最終參與牙齒、牙周、牙槽骨及頜骨對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、修復(fù)以及改建的功能[14-15]。

通過篩選的牙髓干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)獲得生長(zhǎng)穩(wěn)定、狀態(tài)活躍的細(xì)胞，MTT檢測(cè)可知在CGRP作用下牙髓干細(xì)胞的增殖效果顯著高于空白對(duì)照，說明CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，以10-7mol/L濃度組促進(jìn)效果最為顯著。牙髓干細(xì)胞的成骨分化對(duì)牙齒的修復(fù)與保護(hù)具有重要作用，茜素紅染色法鑒定CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的骨向分化具有促進(jìn)作用，根據(jù)結(jié)果可知在加入CGRP的培養(yǎng)基培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞21 d后，可見有明顯的礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生。為進(jìn)一步證實(shí)CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的骨向分化促進(jìn)作用，本研究采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞中的Col-1和Runx2的mRNA、蛋白表達(dá)量在CGRP作用下的改變。Col-1是骨形成鈣化結(jié)節(jié)的基本保障[16]，是骨的主要構(gòu)成部分。骨形成過程中鈣鹽的沉積須有Col-1提供支持，因此提升Col-1的表達(dá)水平，才能保證骨的正常的生長(zhǎng)發(fā)育。轉(zhuǎn)錄因子Runx2作為重要的成骨因子，能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[17-19]。根據(jù)結(jié)果可知，在CGRP的作用下，Col-1和Runx2的表達(dá)水平顯著升高，說明牙髓干細(xì)胞的成骨分化開始出現(xiàn)。最后筆者檢測(cè)了在MAPK信號(hào)通路抑制劑作用下CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞中Col-1、Runx2 mRNA表達(dá)的水平，發(fā)現(xiàn)p38和ERK通路可能參與了CGRP對(duì)牙髓干細(xì)胞的調(diào)控，這只是對(duì)CGRP信號(hào)通路的一個(gè)初步研究。綜上可知CGRP能夠促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖分化，同時(shí)MAPK信號(hào)通路參與了這一調(diào)控。

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Effects of CGRP on proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells.

LIU Hang1,HAO Jian-zhong2, LUAN Ke-feng1,LI Zhe1,YU Tian-zhe1,ZHANG Ji-ping3.1.Department of Stomatology,Weifang Medical University, Weifang 261053,Shandong,CHINA;2.Department of Stomatology,Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261031,Shandong,CHINA;3.Department of Management,Weifang Medical University,Weifang 261053, Shandong,CHINA

ObjectiveTo study the effects of calcitonin gene-related peptide(CGRP)on proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells,and to probe the role of CGRP signaling pathway.MethodsFirstly,the healthy pulp was collected,and the pulp stem cells were cultured and selectedin vitro.The tetrazolium-based colorimetric assay(MTT test)was used to detect the proliferation of dental pulp stem cells with different concentrations of CGRP, and the appropriate concentration was obtained.The effect of CGRP on the formation of mineralized nodules in dental pulp stem cells was observed by alizarin red staining.The expression levels of the Col-1 and Runx2 mRNA and protein acted by CGRP in dental pulp stem cells were detected by real-time RT-PCR and Western blot.At the last,we used real-time RT-PCR to observe the expression levels of Col-1 and Runx2 mRNA effect by mitogen-activated protein kinase (MAPK)signal pathway inhibitors.ResultsThe dental pulp stem cells grew stably by cultivating and filtering the cells.MTT method showed that the proliferation of dental pulp stem cells was enhanced by CGRP,and the effect was most significant when CGRP concentration was 10-7mol/L.The mineralize nodules were observed by alizarin red staining when the dental pulp stem cells enchanced by CGRP for 28 d.Real-time RT-PCR and Western blot showed that the expression levels of mRNA and protein of Col-1 and Runx2 were enhanced when CGRP acted on the dental pulp stem cells.In MAPK signal pathways,real-time RT-PCR showed that the mRNA expression level of Runx2 enhanced by CGRP was regulated by ERK kinase pathway,while the mRNA expression level of Col-1 enhanced by CGRP was regulated by ERK kinase pathway and P38 signal pathway.ConclusionCGRP can enhance the differentiation and proliferation of human dental pulp stem cells,which is regulated by the MAPK signal pathway.

Calcitonin gene-related peptide(CGRP);Dental pulp stem cells;Differentiation;Mitogen-activated protein kinase(MAPK)signal pathway;Cell proliferation

R781.3

A

1003—6350（2017）06—0867—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.002

2016-10-16)

郝建忠。E-mail：738259426@qq.com