常肖肖 張議夫 趙士萍 蔣琦輝 王 炳 方洛云 熊本海 蔣林樹(shù)*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

茶皂素對(duì)奶牛免疫功能的影響

常肖肖1張議夫1趙士萍1蔣琦輝1王 炳1方洛云1熊本海2*蔣林樹(shù)1*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

本試驗(yàn)旨在研究茶皂素對(duì)荷斯坦奶牛的血清免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量及其mRNA表達(dá)量的影響。試驗(yàn)采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，選取4頭瘤胃瘺管奶牛，每頭奶牛分別灌注0(對(duì)照)、15、30、45 g/d的茶皂素，預(yù)試期14 d，正試期21 d，共4期。采用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)法試劑盒測(cè)定血清中免疫球蛋白(Ig)、白細(xì)胞介素(IL)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定淋巴細(xì)胞IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示：1)30 g/d茶皂素組奶牛血清IgM含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。2)15 g/d茶皂素組奶牛血清IL-1含量顯著高于對(duì)照組和45 g/d茶皂素組(P<0.05)。3)與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組奶牛血清IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但45 g/d茶皂素組可提高以上細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量。由此可見(jiàn)，茶皂素可提高奶牛血清中Ig及免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量，并提高細(xì)胞因子IL-6 mRNA表達(dá)量，表明茶皂素可提高奶牛免疫功能。

茶皂素；免疫；細(xì)胞因子；奶牛

隨著我國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展和全世界奶業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)越發(fā)激烈化，提高飼養(yǎng)管理水平和奶牛自身健康就顯得尤為重要。由于化學(xué)藥物和抗生素殘留問(wèn)題一直困擾著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此在研究奶牛飼糧中應(yīng)用植物源性添加劑調(diào)節(jié)增強(qiáng)奶牛自身免疫機(jī)能迫在眉睫，開(kāi)發(fā)綠色植物源性飼料添加劑代替化學(xué)添加劑成為了一種必然趨勢(shì)。

茶皂素(tea saponin)作為一種植物源性提取物，具有無(wú)公害、純天然、殘留少等特點(diǎn)，并在生物活性方面有提高免疫機(jī)能、消炎、抑菌、抗腫瘤等作用[1]，已成為畜牧養(yǎng)殖和科研機(jī)構(gòu)研究的常用原料。茶皂素也稱(chēng)之為茶皂甙，屬于五環(huán)三萜類(lèi)結(jié)構(gòu)化合物[2]，基本結(jié)構(gòu)由甙元、糖體和有機(jī)酸3部分組成，是從山茶科(茶、山茶、油茶)植物種子中提取的一種糖式化合物[3]。彭春雨等[4]研究表明，茶皂素可以提高湖羊的采食量和生長(zhǎng)性能，在每頭產(chǎn)奶牛飼糧中添加8 g茶皂素可顯著提高產(chǎn)奶量。Sagesaka等[5]、童勇等[6]研究證明，茶皂素可以有效抑制由角叉膠誘發(fā)的大鼠足浮腫及由二甲苯導(dǎo)致的小鼠耳廓腫脹，提高小鼠熱刺激體表的痛閾，其抗炎特性主要表現(xiàn)在改善炎癥初始階段受障礙毛細(xì)血管的通透性。韓志紅等[7]研究了油茶皂素對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤抑制性試驗(yàn)，結(jié)果表明油茶皂素對(duì)動(dòng)物腫瘤具有明顯的抑制作用。李靜姬等[8]研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素能夠明顯促進(jìn)雛雞免疫器官成熟，進(jìn)而提高其免疫功能。陳瑋等[9]報(bào)道，飼糧中添加茶皂素對(duì)肉雞的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒(méi)有顯著影響，但均有提高的趨勢(shì)。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究茶皂素對(duì)奶牛血清中細(xì)胞因子含量及其基因表達(dá)量的影響，探究其對(duì)奶牛免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物

茶皂素(皂甙含量≥65%)購(gòu)自浙江東方茶葉有限公司常山分公司，深棕色細(xì)小粉末狀。選用裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛為作為試驗(yàn)動(dòng)物，由北京誠(chéng)遠(yuǎn)勝隆養(yǎng)殖有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用4×4拉丁方試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇胎次(2～3胎)、泌乳天數(shù)[(153±28) d]、產(chǎn)奶量[(24.5±3) kg/d]相近，身體健康、體態(tài)相似且體重在500 kg左右的4頭永久性瘤胃瘺管荷斯坦奶牛，每頭奶牛分別灌注0(對(duì)照)、15、30、45 g/d的茶皂素，預(yù)試期14 d，正試期21 d，共4期。試驗(yàn)?zāi)膛ｏ曃谷旌先占Z(TMR)，自由采食，自由飲水，每日擠奶2次?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 樣品采集與保存

試驗(yàn)期每期第20天，使用真空促凝采血管進(jìn)行尾靜脈無(wú)菌采血，血樣于3 000 r/min離心15 min后靜置2 h，制取血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)用抗凝真空采血管采集15 mL血液，提取淋巴細(xì)胞，用于細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的測(cè)定。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能測(cè)定

喂料時(shí),記錄每頭牛喂料量、剩料量，計(jì)算平均日采食量。

記錄試驗(yàn)期每頭奶牛早、晚產(chǎn)奶量，計(jì)算產(chǎn)奶量。每期第18天并連續(xù)3 d按早∶晚=6∶4的比例采集50 mL鮮乳，加3滴重鉻酸鉀防腐劑，送至北京市奶牛中心用LACTOSCAN型全自動(dòng)超聲波乳成分分析儀測(cè)定干物質(zhì)、乳糖、乳蛋白和乳脂含量，計(jì)算乳糖率、乳蛋白率和乳脂率。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)測(cè)定

血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量均用森貝伽(南京)生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)法試劑盒測(cè)定，試劑配制和操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet:Cu 800 mg,Mn 1 200 mg,Zn 3 300 mg,Se 30 mg,Co 20 mg,Fe 1 400 mg,I 70 mg,VA 1 100 000 IU,VD 330 000 IU,VE 3 000 IU。

2)產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值，其他營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。NELwas a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.

1.4.3 免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的測(cè)定

淋巴細(xì)胞分離及總RNA提?。和庵苎cD-Hank’s液以1∶1稀釋?zhuān)恿馨图?xì)胞分離液以1 200×g離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加D-Hank’s液以900×g離心10 min，2次。收集淋巴細(xì)胞沉淀，加入1 mLTrizol，4 ℃靜置5 min，加200 μL氯仿，混勻，靜置5 min，10 000×g離心15 min，取上層水相加同體積異丙醇，冰上孵育10 min，10 000×g離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇洗滌，10 000×g離心5 min，得到RNA沉淀。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列及參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2007整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)單因素方差分析差異顯著時(shí)，采用Duncan氏法進(jìn)行平均值的多重比較，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對(duì)奶牛生產(chǎn)性能的影響

從表3中可以看出，與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組奶牛平均日采食量、產(chǎn)奶量及各乳成分含量等指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)，這說(shuō)明茶皂素對(duì)奶牛機(jī)體在生產(chǎn)性能上無(wú)不良影響，為后期試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性提供了依據(jù)。

表3 茶皂素對(duì)奶牛平均日采食量、產(chǎn)奶量和乳成分的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 茶皂素對(duì)奶牛血清免疫指標(biāo)的影響

從表4中可以看出，與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組血清IgM含量均有所提高，30 g/d茶皂素組血清IgM含量顯著提高(P<0.05)，但各組血清IgA、IgG含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組血清IgG含量均有一定程度的提高，并隨著茶皂素灌注水平提高而逐漸降低。

表4 茶皂素對(duì)奶牛血清中免疫球蛋白含量的影響

從表5中可以看出，15 g/d茶皂素組血清IL-1含量顯著高于對(duì)照組和45 g/d茶皂素組(P<0.05)，并隨著茶皂素灌注水平提高而逐漸降低。隨著茶皂素灌注水平的提高，血清TNF-α含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，且30 g/d茶皂素組血清TNF-α含量最高，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

表5 茶皂素對(duì)奶牛血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量的影響

2.3 茶皂素對(duì)奶牛免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響

從表6中可以看出，與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，但45 g/d茶皂素組可提高以上細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量，IL-6 mRNA表達(dá)量是對(duì)照組5.95倍，IL-1、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)量也都是對(duì)照組2倍以上。與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組均可提高IL-6 mRNA表達(dá)量。

3 討 論

3.1 茶皂素對(duì)奶牛血清免疫指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定血清中免疫球蛋白、白細(xì)胞介素及TNF-α的含量，研究茶皂素對(duì)奶牛免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示30 g/d茶皂素組與對(duì)照組相比，可顯著提高血清中IgM的含量，并隨著茶皂素灌注水平的增加，血清中IgM的含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。而茶皂素對(duì)血清中IgA、IgG含量均無(wú)顯著差異。血清總蛋白指的是體內(nèi)血清蛋白質(zhì)含量的總稱(chēng)，主要包含了白蛋白和球蛋白。球蛋白是由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的，具有免疫調(diào)節(jié)作用。在肉雞飲用水中添加不同含量茶皂素，發(fā)現(xiàn)400 mg/L劑量組對(duì)十二指腸防御素和IgA含量有顯著提高作用[12]。另有研究顯示，一定劑量的茶皂素可以促進(jìn)固始雞免疫器官發(fā)育，促進(jìn)肉雞腸絨毛生長(zhǎng)，增加腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收面積，提高T淋巴細(xì)胞亞群的水平[13-14]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，與外周免疫器官脾臟相比，茶皂素對(duì)法氏囊和胸腺的作用更強(qiáng)[7]。給長(zhǎng)沙黃雞喂含有茶皂素的飼糧，試驗(yàn)組血清淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、IgG含量、IL-2含量均有提高效果[15]。本試驗(yàn)與前人研究有所差異，分析原因可能是由于試驗(yàn)動(dòng)物的種屬差異性。有研究報(bào)道，茶皂素對(duì)雛雞免疫器官的成熟具有明顯的促進(jìn)作用，使雛雞的生產(chǎn)性能明顯提高，因此在飼糧添加茶皂素類(lèi)添加劑能促進(jìn)雞免疫器官發(fā)育[16]。

表6 茶皂素對(duì)奶牛免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響

本試驗(yàn)結(jié)果中，15 g/d茶皂素組血清IL-1含量與對(duì)照組和45 g/d茶皂素組相比差異顯著，與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組均提高了血清IL-1含量。30 g/d皂素組血清TNF-α含量最高，與對(duì)照組差異顯著，并隨著茶皂素灌注水平的增加，血清TNF-α含量呈先增加后減小的趨勢(shì)。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，與對(duì)照組相比，15、30、45 g/d茶皂素組血清中IgM、IL-1、TNF-α均有所提高。本試驗(yàn)探究與分析了茶皂素對(duì)奶牛血清中免疫球蛋白及細(xì)胞因子含量的變化規(guī)律，可為進(jìn)一步研究茶皂素對(duì)奶牛免疫功能的影響提供試驗(yàn)依據(jù)。

3.2 茶皂素對(duì)奶牛免疫相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響

細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)以及修復(fù)損傷組織等多種生物學(xué)功能[17]。其類(lèi)型包括白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族等。TNF-α是機(jī)體組織細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)分泌的一種具有免疫作用的炎性細(xì)胞因子，與白細(xì)胞介素、干擾素等其他細(xì)胞因子共同參與到炎癥免疫反應(yīng)中。目前，關(guān)于茶皂素對(duì)細(xì)胞因子作用的國(guó)內(nèi)外研究較少，免疫系統(tǒng)可通過(guò)細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6傳遞信息給其他生理系統(tǒng)提高免疫水平。本試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，灌注不同水平茶皂素均可提高IL-6 mRNA表達(dá)量，具有一定促進(jìn)作用。IL-6是Kshimoto等[18]從T細(xì)胞中首先獲得的一種糖蛋白，它是機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)分泌的一種細(xì)胞因子，已在B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及纖維母細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[19]。TNF-α是通過(guò)用靈桿菌脂多糖注射小鼠后，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中出現(xiàn)一種能夠誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)生出血，并引起腫瘤壞死的物質(zhì)[20]，故被后人命名為腫瘤壞死因子。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，45 g/d茶皂素組均可提高細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)量，且45 g/d茶皂素組IL-6 mRNA表達(dá)量是對(duì)照組5.95倍，IL-1、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)量也都是對(duì)照組2倍以上。

從20世紀(jì)80年代，我國(guó)開(kāi)始對(duì)茶皂素進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。到目前為止，已在紡織、建筑、化妝品和材料加工等領(lǐng)域有了較為廣泛的應(yīng)用[21-23]，但在畜牧生產(chǎn)中尚未得到充分利用。有研究報(bào)道[24]，茶皂素可以顯著提高肉牛血清中超氧化物歧化酶、脂肪酶活性和總蛋白含量，降低血清膽固醇含量，提高牛的免疫機(jī)能和抗氧化水平。有研究報(bào)道，飼糧中添加茶皂素對(duì)肉雞的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒(méi)有顯著影響，但有提高的趨勢(shì)[25]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，茶皂素能在一定程度上提高血清免疫球蛋白及免疫相關(guān)細(xì)胞因子的含量，并對(duì)IL-6 mRNA表達(dá)量有促進(jìn)作用，為提高奶牛機(jī)體免疫功能問(wèn)題提供了新的解決思路，同時(shí)為進(jìn)一步研究茶皂素作為調(diào)控奶牛天然飼料添加劑提供了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

茶皂素可提高奶牛血清中免疫球蛋白及免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量，并提高細(xì)胞因子IL-6 mRNA表達(dá)量，表明茶皂素可提高奶牛免疫功能。

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*Corresponding authors: XIONG Benhai, professor, E-mail： xiongbenhai@caas.cn; JIANG Linshu, professor, E-mail： kjxnb@vip.sina.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Tea Saponin on Immune Function of Dairy Cows

CHANG Xiaoxiao1ZHANG Yifu1ZHAO Shiping1JIANG Qihui1WANG Bing1FANG Luoyun1XIONG Benhai2*JIANG Linshu1*

(1.KeyLaboratoryforDairyCowNutrition,CollegeofAnimalScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China; 2.InstituteofAnimalScienceandVeterinary,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

This experiment was conducted to study the effects of tea saponin on serum immune related cytokines contents and their mRNA expression levels of Holstein cows. Four rumen fistulated cows were used following a 4×4 Latin square design with different infusion concentrations of tea saponin [0 (control), 15, 30, 45 g/d]. The experiment had 4 periods, and each period consisted of 14 d per feeding period and 7 d sampling period. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method kit was used to measure the contents of immunoglobulins, interleukin and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in serum. Quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), interleukin-10 (IL-10) andTNF-α. The results showed as follows: 1) the serum immunoglobulin M (IgM) content of dairy cow in 30 g/d tea saponin group was significantly higher than that in control group (P<0.05). 2) The serum IL-1 content in 15 g/d tea saponin group was significantly higher than that in control group and 45 g/d tea saponin group (P<0.05). 3) Compared with the control group, the mRNA expression levels ofIL-1,IL-10,IL-6 andTNF-α in 15, 30 and 45 g/d tea saponin groups were not significantly different (P>0.05), but the mRNA expression levels of above cytokines in 45 g/d tea saponin group was increased. In conclusion, tea saponin can improve the contents of immunoglobulins and immune related cytokines in serum, as well as the mRNA expression level of cytokineIL-6, which indicate that tea saponin can improve the immune function of dairy cows.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(3)：1039-1045]

tea saponin; immunity; cytokines; dairy cows

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.03.038

2016-09-09

“十二五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(25012BAD14B09)；“十三五”國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)(2016YFDO70020，2016YFDO700205)；北京市農(nóng)業(yè)局北京市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系奶牛創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

常肖肖(1993—)，女，山東泰安人，碩士研究生，研究方向?yàn)槟膛I(yíng)養(yǎng)與免疫。E-mail： c-x-x2@163.com

*通信作者:熊本海，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： xiongbenhai@caas.cn；蔣林樹(shù)，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： kjxnb@vip.sina.com

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1006-267X(2017)03-1039-07